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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Published: June 9, 2011 doi: 10.3791/2889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Center for Vector Biology and Zoonotic Diseases, Department of Environmental Sciences, The Connecticut Agricultural Experiment Station

Summary

Nous décrivons une méthode pour traiter et d'un écran moustiques récoltés sur le terrain pour une diversité des virus par un test de culture de cellules Vero. En employant cette technique, nous avons détecté 9 virus différents de 4 familles taxonomiques dans les moustiques collectés dans le Connecticut.

Abstract

Les moustiques transmettent un certain nombre de virus distincts, y compris d'importants agents pathogènes humains tels que le virus West Nile, virus de la dengue et le virus chickungunya. Beaucoup de ces virus se sont intensifiées dans leurs gammes endémiques et élargi à de nouveaux territoires, ce qui nécessite des programmes efficaces de surveillance et de contrôle pour répondre à ces menaces. Une stratégie pour surveiller l'activité des virus consiste à recueillir un grand nombre de moustiques à partir de sites endémiques et les tests d'infection virale. Dans cet article, nous décrivons comment manipuler, traiter, et d'un écran prélevés sur le terrain pour les moustiques virus infectieux par un test de culture cellulaire Vero. Les moustiques sont triés par emplacement des pièges et des espèces, et regroupés en pools contenant ≤ 50 individus. Pooled spécimens sont homogénéisés dans une solution saline tamponnée en utilisant un mélangeur-broyeur et la phase aqueuse est inoculé à des confluents des cultures de cellules Vero (Clone E6). Les cultures cellulaires sont surveillés pour effet cytopathique de jours 3-7 après l'inoculation des virus et des mises en culture cellulaire sont identifiés par les tests de diagnostic appropriés. En utilisant cette approche, nous avons isolé 9 virus différent de moustiques collectés dans le Connecticut, USA, et parmi eux, 5 sont connus pour causer la maladie humaine. Trois de ces virus (virus du Nil occidental, le virus de Potosi et La Crosse virus) représentent de nouveaux records pour l'Amérique du Nord ou la région de la Nouvelle-Angleterre depuis 1999. La capacité de détecter une grande diversité de virus est essentielle à la surveillance établis et les nouveaux virus émergents dans la population de moustiques.

Protocol

1. Le tri et l'identification des moustiques

  1. Les procédures suivantes sont effectuées sur un banc dans un laboratoire ouvert dédié biosécurité de niveau 2 (BSL-2) en laboratoire par du personnel qui sont formés pour travailler avec les moustiques vivent. Une "chaîne du froid» est maintenu pendant toute la procédure.
  2. Anesthetize vivent les moustiques adultes en plaçant sac de collecte de moustiques dans un congélateur -20 ° C pendant 5 minutes. Sac de collecte de transfert d'un conteneur isotherme contenant de la glace sèche. Fermer le couvercle et exposer les moustiques au dioxyde de carbone pendant 1-3 minutes pour assurer complète le knock-down.
  3. Tap moustiques anesthésiés sur un pan de pré-réfrigérée placé sur un lit de glace sèche. Individuelle séparée moustiques femelles à l'aide de pinces fines et placez dans des gobelets en partie en plastique. Couvrez avec le couvercle et gobelets place sur la glace mouillée.
  4. Identifier les moustiques des espèces en utilisant des clés taxonomiques descriptive basée sur la morphologie externe des moustiques à l'aide d'un microscope stéréo dissection (10-60X zoom) monté sur une table de réfrigérer électronique.
  5. Combinez identifié les espèces de moustiques dans les piscines de ≤ 50 personnes dans 2 mL snap-bouchon des flacons contenant un BB de cuivre. Les flacons sont étiquetés avec un identifiant unique.
  6. Après identification de tous les moustiques, les flacons sont placés dans des sacs étiquetés et stockés dans un refroidisseur styromousse contenant de la glace sèche.
  7. Magasin de pools de moustiques dans un congélateur à -80 ° C jusqu'à ce que les tests de virus.

2. Considérations de biosécurité afin d'isoler le virus par les moustiques

  1. Les procédures suivantes sont effectuées dans une biosécurité de niveau 3 (BSL-3) en laboratoire par du personnel qui sont formés pour travailler à ce niveau de confinement 1. Les équipements de laboratoire, les équipements, les procédures et les pratiques sont soumises à la surveillance institutionnelle, étatique et fédéral et d'inspection. Cherchez la formation appropriée et l'approbation avant de tenter les protocoles suivants.
  2. Porter l'équipement approprié de protection individuelle (EPI) pour chaque procédure telles que des blouses jetables, gants, visières et des respirateurs.
  3. Désinfectez les surfaces de travail avec de l'alcool 70% avant et après l'achèvement des procédures.
  4. Les cultures cellulaires et de matériel potentiellement infectieux sont traitées dans une armoire de biosécurité de classe II (CSB).
  5. Pools de moustiques sont homogénéisés dans un mélangeur-broyeur qui est placé à l'intérieur d'un BSC.
  6. Mosquito homogénats sont centrifugés dans une microcentrifugeuse étanche aux aérosols. Si cette procédure ne peut être effectuée au sein d'un BSC, l'opérateur doit porter un respirateur lors de l'utilisation et la récupération des échantillons provenant de la centrifugeuse.
  7. Pipettes et embouts de pipettes de manutention dans le BSC (enceinte de sécurité biologique) sont trempées dans l'eau de Javel à 10% avant l'autoclavage. Tous les déchets de laboratoire est décontaminé par autoclavage avant leur élimination.

3. Préparation des cellules Vero

  1. Décanter les milieux de culture d'un flacon de culture de tissus de grande taille (175 cm 2) de confluence des cellules Vero (Clone E6) dans un bécher de déchets contenant du javellisant.
  2. Laver les cellules Vero en ajoutant une aliquote de 5 ml de PBS et agiter sur la couche de cellules et le long des côtés flacon en prenant soin de bien couvrir l'ensemble monocouche.
  3. Décanter PBS dans un bécher de déchets.
  4. Ajouter 2,5 ml de trypsine-EDTA et tourbillonner sur la couche de cellules en prenant soin de bien couvrir l'ensemble monocouche.
  5. Incuber flacon dans l'incubateur pendant 5 minutes à 37 ° C, 5% de CO 2.
  6. Agitez doucement et le flacon tourbillonner pour éliminer les cellules de la surface inférieure. Les cellules doivent glisser facilement; incuber 1-5 minutes supplémentaires si les cellules ne sont pas facilement glisser.
  7. Ajouter 5 ml de milieu minimum essentiel (MEM), 5% de sérum fœtal bovin (FBS), en utilisant une pipette sérologique et pipette up-and-down 10-20 fois pour briser les amas de cellules.
  8. Ajouter un supplément de 15 ml MEM, 5% de FBS pour un volume total de 22,5 ml et bien mélanger.
  9. Placer 40 petits flacons de culture tissulaire (25 cm 2) en position verticale dans deux racks (20 flacons / rack).
  10. Placez les supports contenant des flacons dans l'armoire de biosécurité et enlever les bouchons ballon, plaçant directement en face bouchons des flacons.
  11. Distribuer 4 ml de MEM, FBS 5% dans chaque flacon à l'aide d'une pipette sérologique.
  12. Distribuer 0,5 mL cellules en suspension dans chaque flacon (rapport ~ fractionnement 01:06) Remplacer bouchons flacon.
  13. Ajouter 50 ml de MEM, 5% de FBS à la fiole d'origine tissulaire grande culture contenant les cellules en suspension restantes (~ 2,5 ml) et le retour ballon à l'incubateur. Le même grand flacon de culture de tissus peuvent être réutilisés jusqu'à 5 passages et puis un nouveau flacon doit être mis en place pour le remplacer.
  14. Placer la culture de tissus de petites fioles en piles sur le plateau. Agiter le plateau pour faire en sorte que les médias couvre uniformément le fond de la Flaks.
  15. Placez de petits flacons dans l'incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2 et de croître durant la nuit jusqu'à confluence de 80-90%.

4. Préparation des pools de moustiques

  1. Gardez pools de moustiques froid pendant les procédures de tests. Utilisez pré-réfrigéréeracks congélateur et mélangeur-broyeur à cassettes, glacée réactifs, et d'une centrifugeuse réfrigérée lors du traitement de pools de moustiques.
  2. Placer les tubes contenant les moustiques dans un rack de pré-congélateur refroidi et ajouter 1 - 1,5 ml de PBS-G pour chaque tube de moustiques.
  3. Récupérer mélangeur-broyeur à cassettes dans le congélateur. Place 24 tubes dans chaque cassette et ensuite sécurisé dans le mélangeur-broyeur.
  4. Homogénéiser les échantillons pendant 4 minutes à 25 cycles / seconde. Le moulin mélangeur secoue les tubes à haute vitesse et un BB métal à l'intérieur de chaque tube perturbe le tissu de moustique.
  5. Centrifuger les tubes pendant 6 minutes à 7000 rpm.
  6. Placer les tubes de retour dans des racks congélateur jusqu'à inoculés dans des cellules Vero.

5. L'inoculation de cellules Vero avec des broyats de moustiques

  1. Vérifiez au moins un flacon de culture tissulaire de chaque série de sous microscope inversé pour assurer santé adéquats confluence et de cellules; attendent sur la couverture de 80-90%.
  2. Line up 20 petits flacons de culture tissulaire dans un rack et des flacons d'étiquettes avec des numéros d'adhésion correspondants de chaque pool de moustiques.
  3. Desserrez bouchons et la plupart des médias décanter des flacons de culture de tissu dans un bécher de déchets. Laisser suffisamment de médias dans le ballon complètement monocouche cellulaire manteau.
  4. 100 ul aliquote de surnageant de chaque groupe de moustiques traitées dans le flacon de culture tissulaire correspondant.
  5. Remplacer et serrer le bouchon flacon de culture.
  6. Lay flacons de culture à plat sur agitateur pendant 5 minutes (température ambiante) à 35-40 min.
  7. Retour 20 flacons de culture tissulaire à la position verticale dans un rack et le placer dans le BSC.
  8. Désoperculer 3 flacons de culture tissulaire à un moment, passer quatre milieux de croissance ml dans chaque flacon à l'aide d'une pipette sérologique; remplacer les bouchons.
  9. Soyez sûr que la pointe de la pipette ne touche pas le col du flacon de culture ou de la lèvre. Changement des embouts de pipette comme nécessaire si le contact est fait avec le ballon.
  10. Incuber flacons de culture tissulaire à 37 ° C, 5% de CO 2.

6. Dépistage des cellules Vero pour la croissance du virus

  1. Ecran inoculé flacons de culture tissulaire pour des signes d'infection virale, l'effet cytopathogène (ECP), à partir de 3-7 jours après l'inoculation.
  2. Inspectez les cultures de cellules pour les CPE et / ou de contamination en inclinant les flacons et en examinant les médias que les piscines au fond du flacon. Le support apparaît trouble que les cellules se détériorent au cours CPE ou en raison de la croissance de la levure, champignon, ou une contamination bactérienne.
  3. Réexaminer les cultures de cellules qui présentent des médias trouble sous un microscope inversé. Virus sera amener les cellules à se déformer et se détacher de l'flacons de culture. Les cultures cellulaires avec des contaminants visibles, la levure, par exemple, d'autres bactéries, des champignons ou des débris de moustiques lourds, sont re-testé en passant de la piscine de moustique d'origine à travers un filtre seringue 0.22μM.
  4. Aseptiquement passer 1-2 PG de médias de virus positifs des cultures cellulaires dans des cryotubes étiquetés à l'aide d'une pipette sérologique.
  5. Cultures de virus sont conservés à -80 ° C jusqu'à identifiés en utilisant les tests diagnostiques appropriés.

7. Préparation des réactifs

  1. MEM, 5% de FBS. Dissoudre 37,6 g de poudre dans du MEM un volume final de 4 L de dd H 2 0. Répartir la solution dans 500 ml aliquotes dans des bouteilles de médias et de l'autoclave. Lorsque la solution est refroidie, ajouter aseptiquement 26 inactivée par la chaleur ml de sérum de veau fœtal, 5,2 ml de L-glutamine, 5,2 ml anti-biotic/mycotic, et 10,4 ml de bicarbonate de sodium 7,5% à chaque bouteille. Conserver à 4 ° C.
  2. PBS-G. Dissoudre 16 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 2,3 g de Na 2 HPO 4, 0,4 g de KH 2 PO 4, et 4 ml de rouge de phénol à 0,5% en 1000 ml de H 2 0 dd. Ajuster le pH à 7.1-7.4 avec NaOH 2 N (si nécessaire). Dans un bécher séparé, la chaleur de 600 mL de H 2 0 à ébullition. Retirer de la plaque chaude, ajoutez 10 g de gélatine, et se dissolvent. Ajouter une solution de gélatine dissoute à la solution PBS et ajuster le volume final à 2 L avec dd H 2 O. Distribuer 100 ml de solution dans des bouteilles et autoclave. Lorsque la solution est refroidie, ajouter aseptiquement 42,8 ml de sérum de lapin inactivé à la chaleur et de 1,4 ml anti-biotic/mycotic. Conserver à 4 ° C.
  3. Laver les cellules du PBS. Ajouter 50 ml 10X PBS de Dulbecco à 400 mL jj H 2 O. Ajuster le pH à 7,1 avec NaOH 2N. Ajuster le volume final à 500 ml avec dd H 2 O. Solution de filtre avec filtre aspirateur 0.2uM. Répartir dans des aliquotes de 5 ml dans 8 ml à bouchon à vis des tubes. Conserver à 4 ° C.

8. Les résultats représentatifs

Neuf différents de virus à partir de 4 familles taxonomiques ont été récupérés par les moustiques recueillis lors de la surveillance en continu tout l'État du Connecticut de 1997 à 2010 (tableau 1). Cinq de ces virus sont connus pour provoquer une maladie humaine, les pathogènes les plus importants étant le virus West Nile et le virus de l'encéphalite équine. De nouvelles découvertes incluent: le premier isolement du VNO par les moustiques collectés dansAmérique du Nord en 1999 2, le premier isolement du virus de Potosi, dans le nord des États-Unis en 2000 3, et le premier isolement du virus de La Crosse en Nouvelle-Angleterre en 2005 4.

Virus Famille N ° isole Lieux n ° Année n ° détecté Maladie de l'homme Refs.
Virus du Nil occidental Flaviviridae 1002 94 12 Modérée à sévère, une fièvre, une encéphalite 2,5
Le virus de l'encéphalite équine orientale Togaviridae 292 41 10 Sévère, l'encéphalite 6,7
Highlands J virus Togaviridae 178 39 11 Non connue 6
Jamestown Canyon du virus Bunyaviridae 305 74 14 Légère à modérée, la fièvre, la méningite 8
Virus de Potosi Bunyaviridae 259 76 4 Non connue 3
Virus de la Cache Valley Bunyaviridae 114 51 8 Légère à sévère, une fièvre, une maladie neurologique, dans deux cas documentés
Trivittatus virus Bunyaviridae 83 21 11 Non connue
La Crosse virus Bunyaviridae 1 1 1 Modérée à sévère, une encéphalite 4
Flandres de virus Rhabdoviridae 4 4 2 Non connue

Virus Tableau 1. Détecté dans le champ-moustiques recueillis par un test de culture de cellules Vero. Les moustiques ont été recueillies durant la surveillance tout l'État du Connecticut de 1997 à 2010.

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Discussion

Dosage de la culture de cellules Vero sert comme une méthode efficace pour les moustiques écran prélevés sur le terrain pour une diversité des virus. Cela contraste avec les méthodes moléculaires qui ciblent spécifiquement une ou quelques virus d'intérêt. Par ailleurs, nous avons constaté que Vero essai de culture de cellules est tout autant, sinon plus sensible que la RT-PCR 7 et nous fournit des isolats de virus qui sont stockés dans notre collection de référence pour de futures études. Néanmoins, les systèmes de culture cellulaire peuvent ne pas être approprié dans de nombreux cas. Cette approche engage des frais supplémentaires et la formation nécessaires pour faire pousser des virus dans un laboratoire BSL-3, mais ces coûts peuvent être compensés par des fournitures relativement peu coûteux pour la culture cellulaire. Il est également intéressant de noter que la plupart mais pas tous les virus transmis par les moustiques produisent CPE en culture de cellules Vero 9,10. Virus de la dengue est une exception notable qui devraient être examinées par un autre test de diagnostic. Idéalement, une combinaison de méthodes de culture à la fois moléculaire et cellulaire sont utilisés pour tester l'infection virale. Nous utilisons actuellement conventionnelles et RT-PCR quantitative des dosages 4,11,12, parfois en conjonction avec le séquençage, pour identifier les virus isolés en culture cellulaire, et à reconfirmer l'infection des moustiques dans la piscine.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous tenons à souligner la contribution importante des Drs. John Anderson, Andrew Main et Shirley Tirrell à cette étude. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) et le US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 et CONH00773).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16140
Anti-biotic/mycotic GIBCO, by Life Technologies 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. GIBCO, by Life Technologies 25080
L-Glutamine 200mM 100x GIBCO, by Life Technologies 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) GIBCO, by Life Technologies 11700
10X Dulbecco’s PBS GIBCO, by Life Technologies 14080
Trypsin-EDTA GIBCO, by Life Technologies 15400
Rabbit serum GIBCO, by Life Technologies 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon BD 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon BD 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

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References

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Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

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