Summary
Мы опишем метод для обработки и экран полевых собраны комаров для разнообразия вирусов Веро анализа культуры клеток. Используя эту технику, мы обнаружили 9 различных вирусов из 4 семей в таксономических комаров, собранных в Коннектикуте.
Abstract
Комары передавать число различных вирусов, включая важных человеческих патогенов, таких как вирус Западного Нила, лихорадка денге вируса, и chickungunya вируса. Многие из этих вирусов активизировались в эндемичных диапазонов и расширена на новые территории, что требует эффективных программ надзора и контроля, чтобы реагировать на эти угрозы. Одна из стратегий для мониторинга вирусной активности включает в себя сбор большого количества комаров из эндемичных сайтов и их тестирования на вирусную инфекцию. В этой статье мы опишем, как в обращении, процесс, и экран полевых собраны комаров для инфекционного вируса от Vero анализа культуры клеток. Комары сортируются по расположению ловушку и видов, а сгруппированы в пулы содержащего ≤ 50 человек. Объединенные образцы гомогенизировали в буферном растворе с помощью миксера-мельница и водную фазу прививку на сливной Vero клеточных культурах (Clone E6). Клеточные культуры контролируются на цитопатический эффект от нескольких дней 3-7 после прививки и любые вирусы, выращенные в культуре клеток определяются соответствующие диагностические анализы. Используя такой подход, мы выделили 9 различных вирусов от комаров, собранных в Коннектикут, США, и среди них, 5 как известно, вызывают болезни человека. Три из них вирусы (вирус Западного Нила, вирус Потоси и Ла-Кроссе вируса) представляют собой новый рекорд для Северной Америки или регионе Новая Англия с 1999 года. Способность обнаруживать большое разнообразие вирусов имеет решающее значение для мониторинга, которые создали и вновь появляющихся вирусов в организме комара населения.
Protocol
1. Сортировка комаров и идентификации
- Следующие процедуры выполняются на открытом лабораторном столе в специальной уровня биобезопасности-2 (BSL-2) лаборатории персонала, обученного работать с живыми комарами. "Холодовой цепи" сохраняется на протяжении всей процедуры.
- Обезболить жить взрослых комаров, поставив сумку комаров коллекции в морозильной камере -20 ° в течение 5 минут. Передача коллекции сумку изолированный контейнер, содержащий сухой лед. Закрыть крышкой и выставить комары углекислого газа в течение 1-3 минут, чтобы обеспечить полный нокдаун.
- Нажмите наркозом комаров на предварительно охлажденные кастрюлю помещен на ложе из сухого льда. Отдельные отдельных самок комаров с использованием тонких щипцов и место в пластиковые стаканчики части. Накрыть крышкой и помещают чашки на льду.
- Определить комары вида с использованием описательной ключи таксономических на основе внешней морфологии комаров при помощи стерео микроскопа рассекает (10-60X зум), установленных на электронные таблицы озноб.
- Комбинат определены видов комаров в пулы ≤ 50 человек в 2 мл оснастки шапка флаконах, содержащих медь BB. Флаконы помечены уникальный идентификатор.
- После выявления всех комаров, флаконы помещают в маркированные мешки и держал в холодильнике пенополистирола содержащих сухой лед.
- Магазин комаров бассейнов в -80 ° C морозильнике до вирусом тестирования.
2. Биобезопасности соображений, чтобы изолировать вирус от комаров
- Следующие процедуры выполняются в уровне биобезопасности-3 (BSL-3) лаборатории, сотрудники, которые готовят для работы на этом уровне сдерживания 1. Лаборатория средств, оборудования, процедур и практики могут быть институциональными, государственных и федеральных надзора и контроля. Ищите соответствующую подготовку и утверждение, прежде чем пытаться следующие протоколы.
- Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) для каждой процедуры, такие как одноразовые халаты, перчатки, щитки, и респираторы.
- Лечить рабочие поверхности с 70% спиртом до и после завершения процедуры.
- Культуры клеток и потенциально инфекционного материала обрабатываются в класс II биобезопасности кабинета (BSC).
- Mosquito бассейны гомогенизировали в смеситель-мельницу, которая находится внутри BSC.
- Mosquito гомогенатах центрифугируют в аэрозоль-плотные микроцентрифужных. Если эта процедура не может быть выполнена в течение BSC, оператор должен использовать респиратор при работе и извлечения образцов из центрифуги.
- Пипец и пипетки советы погрузочно-разгрузочных работ в BSC (биобезопасность кабинет) замачивают в 10% гипохлоритом перед автоклавированием. Все лабораторные отходы дезактивации в автоклаве перед удалением.
3. Подготовка клетки Веро
- Декантировать питательных сред из одной большой колбе культуры тканей (175 см 2) вырожденных клеток Веро (Clone E6) в отходы стакан, содержащий отбеливатель.
- Вымойте клеток Веро, добавив 5 мл аликвоту PBS и вихрем над слоем клеток и по бокам колбы и обязательно тщательно покрывают все монослоя.
- Декантировать PBS в отходы стакан.
- Добавить 2,5 мл трипсина-EDTA и вихрем над слоем клеток, убедившись, что полностью покрывают все монослоя.
- Инкубируйте колбы в инкубаторе в течение 5 минут при 37 ° C, 5% СО 2.
- Осторожно встряхните колбу и водоворот, чтобы удалить клетки от нижней поверхности. Клетки должны соскальзывать легко; инкубировать дополнительные 1-5 минут, если клетки не легко соскользнуть.
- Добавьте 5 мл Минимальная основных средствах массовой информации (MEM), 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), используя серологические пипетки и пипетки вверх-вниз 10-20 раз, чтобы разбить скопления клеток.
- Добавить еще 15 мл MEM, 5% FBS для общего объема 22,5 мл и хорошо перемешать.
- Место 40 малых культур тканей колбы (25 см 2) в вертикальном положении в двух стойках (20 колб / стойка).
- Место стеллажей содержащие колбы внутри шкафа биобезопасности и удалить колбу кепки, шапки размещения непосредственно перед колб.
- Внесите 4 мл MEM, 5% ЭТС в каждую колбу использованием серологических пипетки.
- Внесите 0,5 мл приостановлено клеток в каждой колбе (~ 1:06 коэффициент разделения) Замените колбу шапки.
- Добавьте 50 мл MEM, 5% ЭТС вернуться к первоначальному большой колбе культуре ткани, содержащей оставшиеся суспензии клеток (~ 2,5 мл) и вернуться к колбе инкубатора. Одной большой колбе культуры ткани могут быть использованы повторно до 5 проходов и затем новая колба должна быть настройки для его замены.
- Место небольшие культуры ткани колбы в штабелях на лоток. Swirl лоток, чтобы убедиться, что средства массовой информации равномерно покрывает дно flaks.
- Место небольшой колбы в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО 2 и расти ночь до 80-90% вырожденная.
4. Подготовка комаров бассейнов
- Держите комаров бассейны холода во время процедуры тестирования. Используйте предварительно охлажденноеморозильник стойки и смеситель-мельница кассеты, ледяной реагентов, и центрифуга с охлаждением при обработке комаров бассейнов.
- Место пробирки с комарами в предварительно охлажденной морозильник стойки и добавить 1 - 1,5 мл PBS-G в каждую пробирку комаров.
- Получить смеситель-мельница кассеты из морозильной камеры. Место 24 труб в каждой кассете, а затем в безопасности в смеситель-мельницы.
- Однородный образцы в течение 4 минут при 25 циклов / секунду. Вибрационная мельница трясет труб с высокой скоростью и металла BB внутри каждой трубы нарушает комар ткани.
- Пробирки центрифужные в течение 6 минут при 7000 оборотах в минуту.
- Место трубы обратно в морозильник стойки до инокулировали в клетках Веро.
5. Заражение клеток Веро с москитной гомогенатах бассейн
- Не реже, чем один культуре ткани колбу из каждой серии под инвертированным микроскопом для обеспечения адекватного слияния и клеточной здоровья; рассчитывать примерно на 80-90% покрытия.
- Выстроить 20 малых культур тканей колбы в стойку и маркировать колбы с соответствующими номерами присоединения друг от комаров бассейн.
- Ослабить шапки и переливать большинство средств массовой информации из тканевой культуры колбы в отходы стакан. Оставьте достаточно средств массовой информации в колбе, чтобы полностью монослоя ячейки пальто.
- Алиготе 100 мкл надосадочной друг от комаров обрабатываются бассейна в соответствующую колбу культуры ткани.
- Установите и затяните крышку культуры колбу.
- Положите культуры колбы квартира на шейкере в течение 5 минут (комнатной температуры) на 35-40 оборотов в минуту.
- Возвращение 20 колб культуры тканей в вертикальное положение в стойке и место в BSC.
- Uncapping 3 колбы культуры ткани в одно время, обойтись 4 мл питательной среды в каждой колбе использованием серологических пипеток; заменить колпачки.
- Будьте уверены, что кончик пипетки не свяжется с шеи культуры колбу или губы. Изменение наконечники по мере необходимости, если происходит контакт с колбу.
- Инкубируют культуры тканей колбах при 37 ° C, 5% СО 2.
6. Скрининг Веро клетки для роста вируса
- Экран прививку колбы культуры тканей на наличие признаков вирусной инфекции, цитопатический эффект (ЦПЭ), от 3-7 дней после заражения.
- Осмотрите клеточных культур для CPE и / или загрязнения, наклоняя колб и изучения СМИ, что бассейны в нижней части колбы. СМИ появится облачно, как клетки ухудшаться во время CPE или за счет роста дрожжей, грибов, или бактериального заражения.
- Пересмотреть культурах клеток, которые обладают облачно СМИ под инвертированным микроскопом. Вирусы заставит клетки деформируются и вырваться из культуры колб. Клеточные культуры с видимыми загрязняющих веществ, например, дрожжи, других бактерий, грибков или тяжелого мусора комаров, которые повторное тестирование, передавая исходный пул комара через 0.22μM фильтр шприца.
- Асептических обойтись 1-2 мл СМИ от вируса-позитивных клеточных культур в подписанные cryotubes использованием серологических пипетки.
- Вирус культур хранятся при температуре -80 ° C до идентифицируются с помощью соответствующих диагностических тестов.
7. Подготовка реагентов
- MEM, 5% FBS. Растворите 37,6 г порошкообразного MEM в конечный объем 4 л дд H 2 0. Разлить раствор в 500 мл аликвоты в бутылках СМИ и автоклав. Когда раствор остынет, добавить асептически 26 мл тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 5,2 мл L-глутамина, 5,2 мл anti-biotic/mycotic и 10,4 мл 7,5% бикарбоната натрия в каждой бутылке. Хранить при температуре 4 ° С.
- PBS-G. Растворить 16 г хлористого натрия, 0,4 г хлорида калия, 2,3 г Na 2 HPO 4, 0,4 г KH 2 PO 4 и 4 мл 0,5% фенола красного в 1000 мл дд H 2 0. Отрегулируйте рН до 7.1-7.4 с 2 N NaOH (при необходимости). В отдельном стакане, тепло 600 мл H 2 0 до кипения. Удалить из горячей плиты, добавить 10 г желатина, и растворяются. Добавить растворенный желатин решение решение PBS и корректировать конечный объем до 2 л с дд H 2 O. Добавьте 100 мл раствора в бутылках и автоклав. Когда раствор остынет, добавить асептически 42,8 мл тепла инактивированной сыворотки кролика и 1,4 мл anti-biotic/mycotic. Хранить при температуре 4 ° С.
- PBS ячейки стирки. Добавьте 50 мл 10 раз PBS Дульбеко до 400 мл дд H 2 O. Отрегулируйте рН до 7,1 с 2 н. Отрегулируйте конечный объем до 500 мл с дд H 2 O. Фильтры решение с 0.2uM блок фильтра вакуума. Разлить в 5 мл аликвоты в 8 мл завинчивающейся крышкой трубки. Хранить при температуре 4 ° С.
8. Представитель Результаты
Девять различных вирусов из 4 семей таксономических были извлечены из комары, собранные в ходе непрерывного наблюдения по всему штату в Коннектикуте с 1997-2010 (таблица 1). Пять из этих вирусов, вызывающих заболевания человека, наиболее важных патогенов вирус Западного Нила и восточного лошадиного энцефалита. Новые открытия включают в себя: первое изоляции WNV от комаров, собранных вСеверной Америке в 1999 году 2, первый изоляции Потоси вируса на северо-востоке США в 2000 году 3, и первое изоляции Ла-Кроссе вируса в Новой Англии в 2005 году 4.
Вирус | Семья | Количество изолятов | Количество мест | Количество лет обнаружены | Человека болезнь | Работах. |
Вирус Западного Нила | Flaviviridae | 1002 | 94 | 12 | От умеренной до тяжелой, лихорадки, энцефалита | 2,5 |
Вирус восточного конского энцефалита | Togaviridae | 292 | 41 | 10 | Тяжелая, энцефалит | 6,7 |
Highlands J вирус | Togaviridae | 178 | 39 | 11 | Неизвестный | 6 |
Джеймстаун Каньон вирус | Буньявирусов | 305 | 74 | 14 | От легкой до умеренной, лихорадка, менингит | 8 |
Потоси вирус | Буньявирусов | 259 | 76 | 4 | Неизвестный | 3 |
Кэш долине вирус | Буньявирусов | 114 | 51 | 8 | От легкой до тяжелой, лихорадка, неврологические болезни в двух документально подтвержденных случаев | |
Trivittatus вирус | Буньявирусов | 83 | 21 | 11 | Неизвестный | |
Ла-Кроссе вирус | Буньявирусов | 1 | 1 | 1 | От умеренной до тяжелой, энцефалит | 4 |
Фландрия вирус | Rhabdoviridae | 4 | 4 | 2 | Неизвестный |
Таблица 1. Вредоносные файлы, обнаруженные в поле, собранные от комаров Веро анализа культуры клеток. Комары были собраны во время наблюдения в штате Коннектикут с 1997-2010.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vero клеточной культуре анализа служит эффективным методом для скрининга поле, собранные комаров для разнообразия вирусов. Это контрастирует с молекулярными методами, которые специально направлены один или несколько вирусов, представляющих интерес. Более того, мы обнаружили, что Веро анализа культуры клеток в равной степени, если не более чувствителен, чем ПЦР-7 и дает нам изолятов вируса, которые хранятся в нашей справочной коллекции для будущих исследований. Тем не менее, системы клеточной культуре, может не подходить во многих случаях. Такой подход влечет за собой дополнительные расходы и подготовки, необходимой для роста вирусов в BSL-3 лаборатории, однако эти затраты могут быть компенсированы относительно недорогих материалов для клеточных культур. Стоит также отметить, что большинство, но не все комарами вирусы производят CPE в культуре клеток Vero 9,10. Вирус денге является одним заметным исключением того, что должны быть обследованы другой диагностический тест. В идеале, комбинация обоих молекулярной и клеточной культуре методы используются для тестирования на вирусную инфекцию. Мы в настоящее время с использованием обычных и количественный ПЦР-анализов 4,11,12, иногда в сочетании с секвенирования для выявления вирусов, выделенных в культуре клеток, и подтвердить инфекцию в организме комара бассейн.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы выражаем искреннюю благодарность важный вклад д-ра. Джон Андерсон, Эндрю Главная и Ширли Tirrell к настоящему исследованию. Эта работа была частично поддержана грантами от Центров по контролю и профилактике заболеваний (U50/CCU116806-01-1) и Министерство сельского хозяйства США (58-6615-1-218, CONH00768 и CONH00773).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
Anti-biotic/mycotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
L-Glutamine 200mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
Powdered minimal essential medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
10X Dulbecco’s PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
Rabbit serum | GIBCO, by Life Technologies | 16120 | |
Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon BD | 353108 | |
Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 | |
Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
- Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , American Public Health Association. 189-212 (1995).
- Karabatsos, N. International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).
- Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
- Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).