Summary
kisspeptin受体（KISS1R）的突变与患者的生殖系统紊乱。在这里，我们描述如何引入利益的突变的KISS1R富含GC的序列以及使用KISS1R结构特点免疫沉淀和免疫印迹的受体的降解途径
Abstract
kisspeptin受体（KISS1R）确认为青春期的触发和生殖能力的成年 1,2,3调节G蛋白偶联受体。已与iodiopathic hypogonadotropic性腺功能低下症（IHH）1,2和性早熟4的患者确定KISS1R失活的突变。这些突变体的功能研究为我们理解再生产的这种受体的调节，以及背后的机制是至关重要的那些塑造的疾病结果，导致异常KISS1R信令和功能。然而，的高度富含GC序列的KISS1R基因，使得它相当困难的引入突变或扩增PCR这种受体的基因编码。
在这里，我们描述了一种方法，引入利益的突变，这种高度富含GC的序列，已成功地用于产生超过十几KISS1R突变体在我们的实验室。我们已经优化了PCR反应条件，以方便KISS1R包括在KISS1R序列的替换，删除或插入的突变体，放大。的另外一个PCR增强剂解决方案，以及二甲基亚砜的一个很小的比例，尤其是有利于提高放大。这种优化过程可能是有用的，以及其他富含GC的模板。
表达载体编码KISS1R是被用来描述这种受体的信号和功能，以了解如何突变可能会改变KISS1R功能，导致生殖相关的表型。因此，定点突变产生KISS1R的突变体的潜在应用1,4,5,6,7,8许多研究可以说明。作为一个例子，在KISS1R（Arg386Pro），这是与性早熟有关，获得性功能突变已被证明延长受体的反应配体刺激4以及改变的降解率KISS1R 9 。有趣的是，我们的研究表明，KISS1R被蛋白酶体降解，而不是大多数G蛋白偶联受体 9所描述的经典的溶酶体降解。在这里介绍的例子，KISS1R退化是在人胚胎肾细胞（HEK - 293）瞬时表达Myc基因标记KISS1R（MycKISS1R）调查和与蛋白酶或溶酶体抑制剂治疗。使用琼脂糖标记的抗myc抗体免疫印迹分析免疫沉淀的细胞裂解液。使用LI - COR的奥德赛红外线系统进行检测和定量上的污点MycKISS1R。这种方法可能是有用的，以及其他感兴趣的蛋白质降解的研究。
Protocol
1。定点突变的基因序列高度富含GC KISS1R
- 模板：Myc基因标记与融合其N -末端的人类KISS1R完整的cDNA序列。这个序列克隆到的pCS2 +的表达载体，这是其后用于转染哺乳动物细胞线兼容。这表达载体被称为本pCS2 + Myc基因KISS1R。
- 引物设计：引物设计进行所需的突变，根据Quikchange定点突变试剂盒（Stratagene公司）的说明。总结：
- 两者（正向和反向引物）必须包含所需的突变和退火对面链的质粒以相同的顺序（如正向和反向引物的互补性）
- 底漆应25至45个碱基长，最终在一个或多个C或G基地
- 引入的突变（S）应在底漆中，正确的顺序〜10-15基地两侧两侧
- 引物的熔点温度（TM）应等于或大于78 ° C。使用下列公式来估算的Tm：
- 当引入突变：TM = 81.5 + 0.41（％GC） - 675 / N - ％的失配（N是在基地的引物长度）
- 当引入插入或缺失：TM = 81.5 + 0.41（％GC） - 675 / N（n不包括基地正在插入或删除）
- 使用脱盐引物（没有必要的进一步纯化）。
- 两者（正向和反向引物）必须包含所需的突变和退火对面链的质粒以相同的顺序（如正向和反向引物的互补性）
- 最好的扩增条件包括除PCRx增强解决方案（Invitrogen公司）和DMSO。至少有2浓度的DMSO，如4％和8％，应进行测试。我和图1和一个有代表性的PCR扩增的pCS2 + MycKISS1R的结果，如图2所示，PCR条件列于表。
- 消除父母的DNA甲基化的DNA与DpnI消化扩增产物为1小时30分钟在37 ° C：2μL10X NEBuffer 4 DpnI0.5μL（10U; New England Biolabs公司）的PCR产物的离心管17.5μl混合。
- 变换DpnI处理的PCR产物：XL10金Ultracompetent大肠杆菌45μlDpnI处理的DNA混合2μL 大肠杆菌中预冷15 ml细胞培养管（Stratagene公司）。 β-巯基乙醇添加2μL，并按照Stratagene公司的指示。板100 -400μl转化菌在LB琼脂板含100μg/ml氨苄青霉素和孵化，在37 ° C。
- 小量2至4个单个菌落分离质粒DNA。确认成功引进孤立的DNA测序和分析所需的突变。
2。 MycKISS1R到HEK - 293细胞的瞬时转染
- 以下实验进行人类胚胎肾细胞（HEK - 293）中的CO 2培养箱（5％CO 2）培养37 ° C的10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素的DMEM补充。
- 种子的HEK - 293细胞在6孔板在2.5 × 10 5细胞/ ml，让他们成长在37℃过夜°转染前彗星。注：（i）使用一式三份每个实验条件下的井;（二）在转染时的理想的细胞汇合30％-50％。
- 转染的HEK - 293细胞使用的GenePorter转染试剂（Genlantis），根据制造商的指示：将一半的无血清DMEM0.5μgpCS2 + MycKISS1R加0.5μg控制（空）向量总和的DNA /1μg。每转微克的DNA加入10μl转染试剂混合的另一半。注意：理想的质粒DNA的浓度可能会有所不同。
3。细胞治疗和裂解
- 转染24小时后，细胞培养基取代1毫升DMEM培养液含2.5％胎牛血清（降低细胞代谢）。注意：这可能有助于减少血清中和/或放大的检测结果。
- 直接添加到每一个完整的6孔板以及溶酶体抑制剂（100μg/孔的亮肽素）。孵育37℃，6或16 h（或其他所需的时间）
- 直接添加到所有井的两个整个6孔板新鲜准备的蛋白酶抑制剂（10μM/的MG132）。孵育于37℃，2，4，6或16小时（或所需的时间）。新增车辆的第四次6孔板（0时间点）的所有水井和37 ° C为16H
- 当孵化结束后，移动板冰，冰，以防止蛋白质的降解和执行整个裂解过程：
- 为了增加蛋白质的产量，结合在一个单一的CENTR 6孔板一式三份ifuge管
- 吸冰冷的磷酸1毫升中期和洗细胞一次缓冲液（PBS）
- 添加含有蛋白酶抑制剂（1X鸡尾酒含有100MM AEBSF盐酸，80μm的抑肽酶，5MM bestatin冰冷的裂解液100μL（20MM HEPES，pH值7.4，1％NP - 40，150mm的氯化钠，为1mM EDTA，0.25％脱氧胆酸钠）， 1.5MM E - 64，0.5M EDTA，2MM亮肽素和胃酶抑素一个1MM，加上2mm的PMSF），每孔
- 与取出一个细胞刮刀和转移细胞，细胞裂解液离心管
- 细胞通过20号针头传递〜10倍。注意：不要超声用于膜蛋白免疫印迹检测的样品。超声导致膜蛋白的聚集，不会在电泳迁移
- 细胞裂解液在4 ° C孵育一个摇摆的平台上为1h
- 离心机细胞裂解液4 ° C为10分钟10,000 × RPM和上清转移到新管。注意：请勿打扰颗粒在此步骤
- 确定使用的BCA法的上清中加入10μl的蛋白浓度（皮尔斯）
- 稀释裂解液中含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲1mg/ml的。
4。免疫沉淀和Western blot检测的MycKISS1R
- 执行以下冰免疫步骤（或在4 ° C）：
- 冰冷PBS洗两次琼脂糖标记的抗myc抗体（2.5μg/样品）适量添加裂解液蛋白400μg。
- 免疫沉淀裂解液的MycKISS1R一夜之间在4 ° C在一个轻轻摇动摇椅平台。
- 离心脉冲离心琼脂糖珠在4 ° C（高达10,000 × RPM）
- 吸并丢弃上清液（不扰民的颗粒）
- 一次用冰冷的裂解液和两次冰冷PBS清洗珠。纺前，轻轻地反转管
- 在2X上样缓冲液含10％β-巯基乙醇含有抗体的约束MycKISS1R Ressuspend珠。
- MycKISS1R免疫复合物的免疫印迹：
- 热样品，30分钟在37 ° C。 注意 ：不要煮沸用于膜蛋白免疫印迹检测的样品。如超声，煎煮，也导致这些蛋白质的聚集
- 5分钟立即移动到冰管
- 经SDS - PAGE分离蛋白在4-15％梯度凝胶。
- 在25V的Immobilon - FL PVDF膜（红外线检测）30分钟传输缓冲区使用Bio - Rad公司的半干转移（Tris碱48MM，39mm的甘氨酸，1.2mm的SDS，20％甲醇，pH值9.2）仪器
- 洗膜在室温下5分钟的TRIS缓冲液（TBS）和1H块在室温阻断上的摇摆平台（或者可用于阻止非特异性结合，5％的牛奶的TBS）与Licor奥德赛。
- 在4℃过夜孵育膜° C的兔抗Myc抗体阻断含有0.1％Tween - 20的解决方案（1:500）
- 删除的主要抗体，洗膜5分钟3次用TBS含有0.1％Tween - 20的（TBST）
- 在室温与山羊红外线RedDye ® 800CW标记的抗兔IgG（1:10,000）在封闭液含0.1％Tween - 20的0.01％SDS孵育1h后膜
- 删除第二抗体，洗膜5分钟3次的TBS（删除剩余的吐温20）用TBST和最后一次
- 使用LI - COR的奥德赛红外线成像仪成像和定量MycKISS1R：
- 膜MycKISS1R将使用LI - COR的奥德赛红外线成像仪成像。首先，放置在底部左上角奥德赛扫描器膜，使其与电网。封面用的橡胶垫，理顺与滚子的气泡，并盖上盖子
- 在计算机上创建一个新的项目文件。命名该文件，点击“完成”，然后进入扫描仪“扫描”登录。尺寸扫描仪控制台框，以适应你的膜，然后选择169μm分辨率和图像质量中等
- 选择强度设置为700（红色）和800（绿色）通道，根据每个信号的强度预计。这是信号可视化的目的，并不会影响量化。点击“开始扫描”。
- 名称和保存的扫描，然后点击“确定”，打开一个新窗口定量。 MycKISS1R单体应该是可见的的，在约43kD
- 使用的“盒子”的工具（左侧侧边栏上），一个盒子周围绘制的第一个乐队。拖动框周围，以确保所有频段适合，然后“复制”和“粘贴”框中的所有频段
- 选择所有盒使用“Ctrl + A键”，然后选择选项减去中位数的背景。点击顶部菜单上的“报告”，并与量化值的电子表格将出现。这里显示的代表结果是represented倍以上未经处理的细胞增加（零时间）
5。代表性的成果：
- 定点突变的基因序列高度富含GC KISS1R：
表1显示的试剂组合，以提高KISS1R放大效率。这种组合被成功地用于引进几个突变针对KISS1R cDNA序列不同的区域，以及为这个高度富含GC的基因扩增。图1显示了KISS1R诱变骑自行车和扩增条件。这些条件已被修改，从QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene公司）。
图2显示了一个代表性的结果，使用这种优化的协议。另外4％或8％DMSO结合PCRx增强，显着提高富含GC KISS1R的cDNA含有质粒的扩增产量。在此代表的实验，提供4％DMSO扩增条件稍微好一点，比8％DMSO。 DpnI处理的扩增产物转化大肠杆菌ultracompetent 大肠杆菌通常产量100 1000多个殖民地，并成功引进所需的突变率是80-90％，通过DNA测序确定。 - MycKISS1R结构，来研究受体生理：
在此代表的实验中，野生型pCS2 + MycKISS1R扩增根据优化的协议，这里描述的是用来研究在体内KISS1受体的退化有关的细胞株中瞬时表达MycKISS1R（HEK - 293）。治疗溶酶体（亮肽素）或蛋白酶（MG132）抑制剂的方法中所描述的协议，转染HEK - 293细胞后，细胞裂解和免疫印迹处理。图3顶部面板显示扫描MycKISS1R单体，而底部面板中显示的顶部面板上显示的频段的量化。定量分析表明，既不6H也不亮肽素治疗16H影响MycKISS1R蛋白水平的乐队。相反，治疗与MG132在MycKISS1R蛋白在这些细胞中的时间依赖性增加，这与孵化后16H受体的45倍，与MG132积累高潮。这些观测结果表明，不同于大多数G蛋白偶联受体，KISS1R退化的蛋白酶体（而非溶酶体）。
| 二甲基亚砜 | |||
| 试剂 | 0 | 4％ | 8％ |
| 水 | 35 | 33 | 31 |
| 10X PFU超Taq酶缓冲 | 5 | 5 | 5 |
| dNTP混合液（10MM） | 1 | 1 | 1 |
| 引物感（25pmol/μl） | 1 | 1 | 1 |
| 引物反义（25pmol/μl） | 1 | 1 | 1 |
| 10X PCRx增强解决方案 | 5 | 5 | 5 |
| 二甲基亚砜 | 0 | 2 | 4 |
| PFU超Taq DNA聚合酶（2.5U/μl） | 1 | 1 | 1 |
| 质粒DNA（20ng/μl） | 1 | 1 | 1 |
表1。试剂组合，成功地用于变异和放大GC 丰富 KISS1R
图1。骑自行车成功的突变和扩增GC丰富KISS1R条件：一个2分钟的热启动18秒30的融化周期在95 ° C，1分钟退火，在55 ° C和6时68分延长° C。额外的10的68分钟延长° C被添加在最后一个周期的结束。这些设置进行了调整，从原诱变QuikChange II XL -定点突变试剂盒（Stratagene公司）的协议。
图2。富含GC pCS2 + Myc基因KISS1R DMSO的存在或缺乏扩增的可视化：五pCS2μL等份+ Myc基因扩增在0存在KISS1R，4个或8％DMSO被装在此代表的1％琼脂糖凝胶与乙锭染色溴化物和可视化使用紫外线灯。 6KB质粒带装载在4％存在PCR产物和8％DMSO两个车道上可见，但不是在第一线，这是用PCR加载二甲基亚砜的情况下扩增的产品。
图3。亮肽素或MG132对HEK - 293细胞中的MYC KISS1R蛋白水平：HEK - 293细胞表达Myc基因KISS1R分别用100μg/ml亮肽素或10μMMG132在37 ° C时指定的时间。 Myc基因细胞裂解液400μgKISS1R是2.5μg琼脂糖标记的抗myc抗体免疫沉淀和免疫印迹分析。 （一）LI - COR的奥德赛Myc基因KISS1R用兔抗- Myc基因标记抗体的检测与IRDye 800CW标记的抗兔孵化后免疫印迹孵化;（二）Myc基因KISS1R频带的量化所示： （一）使用LI - COR的奥德赛量化软件。结果表示为倍，增加了未经处理的细胞（时间0）。
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Discussion
定点突变已被用于研究蛋白质的功能，通过引进超过三十年的靶基因的编码序列的核苷酸变化。原来的技术是于1978年由英国加拿大化学家和诺贝尔经济学奖得主迈克尔史密斯10。迈克尔史密斯分享1993年诺贝尔化学奖与雨霏，美国生物化学家穆利斯是谁发明的聚合酶链式反应（PCR）11。迈克尔史密斯所描述的原始方法多年来已改善。此过程中的高精确度和成功率，以及在一个相对较短的时间内生产的突变引入所需的基因序列，在一个单一的PCR反应的突变，插入或删除的能力作出了贡献。
尽管所有的技术改进，突变和放大KISS1R如基因序列高度富含GC都是特别麻烦。高GC含量序列突变设计引物的大小必须调整，以适应GC含量的熔化温度，使推荐的范围内。因此，引物中KISS1R引入突变的大小有一个78 ° -86 ° C。之间的熔点一些KISS1R基因地区有一个GC含量85％以上。旨在介绍这些地区的突变引物的大小必须进行调整，以满足上述的熔点范围。这一限额以上的熔化点的引物可能不会单独在95℃，损害放大。另一方面，引物与TM降低超过78 ° C时更容易结合并扩大非特异性序列。
同样，扩增条件和试剂KISS1R高GC含量序列优化。 4％DMSO和Invitrogen公司（见表1和图2）的PCR增强解决方案的结合是增加放大KISS1R效率。另外，其他试剂，如甜菜碱已经成功地用于改善其他 GC 12,13丰富序列的扩增。然而，有KISS1R放大甜菜碱在我们手中没有明显的积极效果。此外，从其他供应商提供的PCR增强剂的解决方案可能同样能够提高富含GC序列的扩增。
使用这里所描述的优化设置，我们已经成功推出一些突变在KISS1R的cDNA，其中包括一次6个核苷酸的变化（由相同的引物进行）和高达27个核苷酸的缺失不同的区域。这些突变体的转变产生具有高（80-90％）含有正确突变序列测序证实的殖民地率数百成千上万的殖民地。
定点突变也可以用来添加如Myc基因或标志的蛋白质的氨基或羧基端抗原标记。这些标签允许选择性免疫和/或蛋白质的检测，是特别有帮助时对感兴趣的蛋白质的可靠抗体不KISS1R。在这里介绍的例子，表达载体KISS1R，这是融合在其氨基端（我的cKISS1R）11个氨基酸的Myc的标签，是用来研究在HEK - 293细胞的KISS1R的降解途径。 HEK - 293使用这里介绍的方法与我cKISS1R细胞的转染效率为25-30 ％。因此，免疫是用于集中从而提高了检测和可视化的受体从细胞裂解液我cKISS1R。这种方法经常被用来促进蛋白质的可视化表达水平低， 以及 14自身。
更重要的是，G蛋白偶联受体，如KISS1R，以及其他膜蛋白，不应该被匀浆超声或凝胶装载前煮沸。虽然这些程序通常用于免疫或免疫印迹，超声和膜蛋白的聚集沸腾导致处理的样品 ，15电泳过程中损害其应有的迁移。事实上，更换这些程序与较温和的同质化，如针道，并降低样品加热，如37 ° C为30分钟（而不是沸腾）KISS1R单体的检测要求。
免疫沉淀我cKISS1R奥德赛成像仪（LI - COR的生物系统公司）使用的红外染料标记的二抗杂交孵化后检测。该系统的优点包括一个持续的强烈的信号，具有精度高，可以检测到几个月，而不是短命的化学发光发出的信号。此外，奥德赛成像的量化软件提供了更大的检测的灵敏度和线性时相比，以下发光的扫描X光片的传统量化。然而，辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体化学发光法检测可作为。
古典溶酶体退化和KISS1R蛋白酶体降解的检测的情况下描述HEK - 293细胞中也一直在观察的COS - 7 9具有相同MycKISS1R的表达载体转染的细胞。虽然不寻常，G蛋白偶联受体的蛋白酶体降解先前已报道文献 16,17 。
综上所述，本手稿演示了如何调查在KISS1R基因，这是一个高度富含GC序列的基因突变的影响，以了解如何在这种受体的突变可以导致生殖障碍，如hypogonadotropic性腺功能低下或性早熟的表型。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是部分资金由国家儿童健康和人类发展研究所（NICHD的 - R21 HD059015）的生殖科和查尔斯H.胡德基金会青年研究者儿童健康研究奖（马萨诸塞州波士顿）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene, Agilent Technologies | 600385 | |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 | |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene, Agilent Technologies | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 | |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47491 | |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 | |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24948 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | EMD Millipore | 16-219 | |
| 2x loading buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | Bio-Rad | 345-0028 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | ||
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78430 |
References
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