Summary
Mutaties in de kisspeptin receptor (KISS1R) zijn geassocieerd met reproductieve stoornissen bij patiënten. Hier beschrijven we hoe de mutaties van belang te introduceren in de GC-rijke sequentie van KISS1R evenals het gebruik van KISS1R constructies om de afbraakroute van de receptor karakteriseren door immunoprecipitatie en western blot
Abstract
De kisspeptin receptor (KISS1R) is een G-eiwit gekoppelde receptor herkend als de trekker van de puberteit en een regulator van reproductieve competentie op volwassen leeftijd 1,2,3. Inactiverende mutaties in KISS1R geïdentificeerd bij patiënten die zijn geassocieerd met iodiopathic hypogonadotropic hypogonadisme (IHH) 1,2 en voortijdige puberteit 4. Functionele studies van deze mutanten zijn cruciaal voor ons begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van de voortplanting van deze receptor, alsmede die de vormgeving van de ziekte uitkomsten, die het gevolg zijn van abnormale KISS1R signaleren en functie. Echter, de zeer GC-rijke sequentie van het KISS1R gen maakt het nogal moeilijk om mutaties te introduceren of het gen dat codeert voor deze receptor door PCR.
Hier beschrijven we een methode om mutaties van belang te introduceren in deze zeer GC-rijke sequentie die met succes is gebruikt voor het genereren van meer dan een dozijn KISS1R mutanten in ons laboratorium. We hebben geoptimaliseerd de PCR-condities voor de amplificatie van een reeks van KISS1R mutanten die substituties, deleties of inserties in de KISS1R volgorde bevatten te vergemakkelijken. De toevoeging van een PCR-versterker oplossing, alsmede van een klein percentage van DMSO waren vooral nuttig om versterking te verbeteren. Deze geoptimaliseerde procedure kan nuttig zijn voor andere GC-rijke templates ook.
De expressie vector die codeert voor het KISS1R wordt gebruikt om signalering en de functie van deze receptor te karakteriseren, om te begrijpen hoe mutaties kunnen KISS1R functie te veranderen en leiden tot de bijbehorende reproductieve fenotypes. Bijgevolg kan de potentiële toepassingen van KISS1R mutanten gegenereerd door plaats-gerichte mutagenese worden geïllustreerd door vele studies 1,4,5,6,7,8. Als voorbeeld, heeft de winst-of-function mutatie in de KISS1R (Arg386Pro), die wordt geassocieerd met vroegtijdige puberteit, is aangetoond dat het reactievermogen van de receptor te verlengen tot ligand stimulatie 4 en aan de afbraaksnelheid van KISS1R 9 te veranderen . Interessant is dat onze studies blijkt dat KISS1R wordt afgebroken door het proteasoom, in tegenstelling tot de klassieke lysosomale afbraak beschreven voor de meeste G-eiwit gekoppelde receptoren 9. In het voorbeeld hier gepresenteerd, is afbraak van de KISS1R onderzocht in humane embryonale niercellen (HEK-293) tijdelijk te drukken Myc-gelabeld KISS1R (MycKISS1R) en behandeld met proteasoom of lysosoom-remmers. Cellysaten zijn immunogeprecipiteerd met behulp van een agarose-geconjugeerd anti-myc antilichaam, gevolgd door western blot-analyse. Detectie en kwantificering van MycKISS1R op blots wordt uitgevoerd met behulp van de LI-COR Odyssey Infrarood-systeem. Deze benadering kan nuttig zijn in de studie van de degradatie van andere eiwitten van belang ook.
Protocol
1. Plaats-gerichte mutagenese van zeer GC-rijke KISS1R gensequentie
- Sjabloon: volledige cDNA-sequentie van het menselijk KISS1R met een Myc-tag gefuseerd met zijn N-terminus. Deze volgorde is gekloneerd in de pCS2 + expressievector, die compatibel is met de zoogdiercellijnen vervolgens wordt gebruikt voor transfecties. Deze uitdrukking vector wordt hierin aangeduid als pCS2 + Myc KISS1R.
- Primer ontwerp: primers zijn ontworpen om de gewenste mutaties te dragen, volgens de instructies van de Quikchange plaatsgerichte mutagenese kit (Stratagene). In het kort:
- Beide (vooruit en achteruit) primers moet de gewenste mutatie en gloeien op dezelfde volgorde aan de tegenoverliggende strengen van het plasmide (bijv. vooruit en achteruit primers zijn complementair aan elkaar)
- Primers moeten 25 tot 45 basen lang en eindigen in een of meer C of G bases
- Geïntroduceerd mutatie (s) dienen te worden in het midden van de primer en geflankeerd door ~ 10-15 bases van de juiste volgorde aan beide zijden
- Smelttemperatuur (Tm) van primers moet gelijk of groter dan 78 ° C. Gebruik de volgende formules Tm schatten:
- Bij de introductie van mutaties: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N -% mismatch (N is de lengte in primer basen)
- Bij de introductie van inserties of deleties: Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N (N bevat niet de bases die worden geplaatst of verwijderd)
- Gebruik ontzout primers (geen verdere zuivering nodig).
- Beide (vooruit en achteruit) primers moet de gewenste mutatie en gloeien op dezelfde volgorde aan de tegenoverliggende strengen van het plasmide (bijv. vooruit en achteruit primers zijn complementair aan elkaar)
- De beste versterking voorwaarden omvatten de toevoeging van PCRx Enhancer oplossing (Invitrogen) en DMSO. Minstens twee concentraties van DMSO, zoals de 4% en 8%, moet worden getest. PCR-condities zijn weergegeven in tabel I en in figuur 1, en de resultaten van een representatieve PCR-amplificatie van pCS2 + MycKISS1R is weergegeven in figuur 2.
- Elimineer de ouders DNA op amplificatieproducten door digestie van gemethyleerd DNA met DpnI voor 1u 30min bij 37 ° C: meng in een centrifugebuis 17.5μl van het PCR-product met 2μl van 10x NEBuffer 4 en 0.5μl van DpnI (10U; New England Biolabs).
- Transform DpnI behandelde PCR-product: mix 2μl van DpnI behandelde DNA met 45μl van XL10-Gold Ultracompetent E. coli (Stratagene) in pre-gekoelde 15 ml celcultuur buis. Voeg 2μl van β-mercapto-ethanol en volg de instructies Stratagene. Plaat 100-400μl van getransformeerde bacteriën in LB-agar platen die 100μg/ml ampicilline en incubeer bij 37 ° C.
- Miniprep 2-4 individuele kolonies tot plasmide DNA te isoleren. Bevestig de succesvolle introductie van de gewenste mutaties door sequentiebepaling en analyse van de geïsoleerde DNA.
2. Transiënte transfectie van MycKISS1R in de HEK-293 cellen
- De volgende experimenten worden uitgevoerd in humane embryonale niercellen (HEK-293), gekweekt in een CO 2 incubator (5% CO 2) bij 37 ° C in DMEM aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine.
- Zaad HEK-293 cellen op 2.5x10 5 cellen / ml in 6-well platen en laat ze 's nachts groeien bij 37 ° C voor transfectie. LET OP: (i) het gebruik drievoud putten voor elke experimentele conditie, (ii) ideaal cel samenloop op het moment van transfectie is 30% -50%.
- Transfecteren HEK-293 cellen met behulp van de GenePorter transfectiereagens (Genlantis), volgens instructies van de fabrikant: Mix de helft van de serum-vrij DMEM met 0.5μg pCS2 + MycKISS1R plus 0.5μg control (leeg) vector te totaliseren 1μg van DNA / goed. Meng de andere helft met 10μl transfectiereagens per ig DNA getransfecteerd. LET OP: Ideaal plasmide DNA-concentratie kan variëren.
3. Cel behandeling en lysis
- 24 uur na transfectie, vervang cel medium met 1 ml DMEM met 2,5% FBS (naar cel metabolisme verlagen). LET OP: Deze daling in het serum kunnen vergemakkelijken en / of versterken van de detectie van de resultaten.
- Voeg lysosoom-remmer (100μg / putje van Leupeptin) direct in elk putje van een complete 6-well plaat. Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 of 16 uur (of een andere gewenste tijden)
- Voeg vers bereide proteasoomremmer (10μM / putje van de MG132) direct in ieder putje van twee gehele 6-well platen. Incubeer bij 37 ° C voor 2, 4, 6 of 16 uur (of gewenste keer). Voeg voertuig aan alle putjes van de vierde 6-well plaat (0 time-point) en incubeer bij 37 ° C voor 16 uur
- Wanneer incubatie voorbij is, verhuizen platen ijs en het uitvoeren van deze hele procedure lysis op het ijs aan eiwit degradatie te voorkomen:
- Voor het verhogen van eiwitrendement, combineren de triplo op 6-well platen in een centrifuge buis
- Een keer aspireren medium en wassen cellen met 1 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
- Voeg 100μl van ijskoude lysis buffer (20mm HEPES, pH 7,4, 1% NP-40, 150mm NaCl, 1 mM EDTA, 0,25% natriumdeoxycholaat) met proteaseremmers (1x cocktail met een 100mm AEBSF-HCl, 80μM aprotinine, 5mM bestatin, 1,5 E-64, 0.5M EDTA, 2mm leupeptin en 1 mM pepstatine A, plus 2 mM PMSF) aan elk putje
- Verwijder de cellen met een cel schraper en overdracht cellysaten naar centrifugebuizen
- Pass cellen ~ 10 keer door middel van een 20-gauge naald. OPMERKING: Gebruik geen ultrasone trillingen monsters voor western blot detectie van membraaneiwitten. Sonicatie leidt tot aggregatie van membraaneiwitten, die niet naar behoren zullen migreren tijdens de elektroforese
- Incubeer cellysaten voor 1 uur bij 4 ° C op een schommelende platform
- Centrifugeer cellysaten bij 4 ° C gedurende 10 min bij 10.000 x rpm en transfer supernatantia naar nieuwe buizen. LET OP: Niet storen pellets tijdens deze stap
- Bepaal eiwit concentratie in 10μl van bovenstaande vloeistoffen met behulp van de BCA methode (Pierce)
- Verdunnen lysaten te 1mg/ml met lysis buffer die protease-remmers.
4. Immunoprecipitatie en Western blot detectie van MycKISS1R
- Voer de volgende stappen immunoprecipitatie op ijs (of bij 4 ° C):
- Was twee keer de juiste hoeveelheid van de agarose-geconjugeerd anti-myc antilichaam (2.5μg / sample) met ijskoude PBS en voeg deze aan 400μg van lysaat eiwit.
- Immunoprecipitaat de MycKISS1R op lysaten overnacht bij 4 ° C in een schommelstoel platform onder zacht schudden.
- Spin down agarose parels door de puls centrifugeren bij 4 ° C (tot 10.000 x rpm)
- Zuig en gooi supernatantia (zonder de pellets)
- Een keer wassen kralen met ijskoude lysis buffer en tweemaal met ijskoude PBS. Voorzichtig omkeren buizen voor het spinnen
- Ressuspend kralen met een antilichaam-gebonden MycKISS1R in 2x monster laadbuffer met 10% β-mercapto-ethanol.
- Western blot van MycKISS1R immunocomplexen:
- Warmte monsters gedurende 30 minuten bij 37 ° C. OPMERKING: niet koken monsters voor western blot detectie van membraaneiwitten. Net als sonicatie, koken leidt ook tot aggregatie van deze eiwitten
- Onmiddellijk naar buizen in ijs gedurende 5 minuten
- Afzonderlijke eiwitten door SDS-PAGE in een 4-15% gradiënt gel.
- Transfer naar Immobilon-FL PVDF membraan (voor infra-rood detectie) op 25V voor 30 min in Transfer buffer (48mm Tris base, 39mm glycine, 1,2 mm SDS, 20% methanol, pH 9,2) met behulp van Bio-Rad Semi-Dry Transfer apparaat
- Was membranen voor 5 min bij kamertemperatuur met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en blokkeren voor 1 uur bij kamertemperatuur met Licor Odyssey blokkeren op een schommelende platform (alternatief, 5% melk in TBS kan worden gebruikt om niet-specifieke binding te blokkeren).
- Incubeer membranen nacht bij 4 ° C met konijn anti-myc antilichaam (1:500) in het blokkeren van oplossing met 0,1% Tween-20
- Verwijder de primaire antistof en was membranen 3 keer van 5 minuten elk met een TBS met 0,1% Tween-20 (TBST)
- Incubeer membranen voor 1 uur bij kamertemperatuur met geitenkaas Infra-RedDye ® 800CW-gelabeld anti-konijn IgG (1:10.000) in het blokkeren van buffer die 0,1% Tween-20 en 0,01% SDS
- Verwijder de tweede antilichaam, was membranen 3 keer van vijf minuten met elk TBST en nog een laatste keer met TBS alleen (te verwijderen resterende Tween-20)
- Imaging en kwantificering van MycKISS1R het gebruik van de LI-COR Odyssey Infra-Red Imager:
- De MycKISS1R op de membranen zal worden afgebeeld met behulp van de LI-COR Odyssey Infra-Red Imager. Om te beginnen, plaats membraan op de linkerbenedenhoek van Odyssey scanner, lijn te brengen met het rooster. Dek af met de rubberen mat, glad te bellen met roller en sluit het deksel
- Maak een nieuw project bestand op de computer. Naam van het bestand, klik "done", en voer vervolgens de scanner inloggen op "scan". De grootte van de scanner console box naar uw membraan te passen, en kies vervolgens 169μm resolutie en een gemiddelde beeldkwaliteit
- Kies de intensiteit instellingen voor de 700 (rood) en 800 (groen) kanalen hand van de verwachte sterkte van elk signaal. Dit is voor signaal visualisatie doeleinden en zal geen invloed kwantificering. Klik op "start scan"
- Naam en sla de scan, klik op "OK" om het te openen over een nieuw venster voor kwantificering. MycKISS1R monomeren moet zichtbaar zijn op ongeveer 43kD
- Met behulp van de "box" gereedschap (aan de linker zijbalk), teken een kader rond de eerste band. Sleep de box rond om ervoor te zorgen dat alle bands passen, dan "copy" en "plakken" de doos over alle bands
- Selecteer alle dozen met "Ctrl + A", en selecteer vervolgens de optie om mediaan achtergrond af te trekken. Klik op "rapport" op de bovenste menu en een spreadsheet met de kwantificering waarden worden weergegeven. Representatieve resultaten die hier getoond worden represented als fold-stijging ten opzichte van onbehandelde cellen (tijdstip nul)
5. Representatieve resultaten:
- Plaats-gerichte mutagenese van zeer GC-rijke KISS1R gensequentie:
Tabel 1. Toont de combinatie van reagentia om de efficiëntie van KISS1R versterking te verbeteren. Deze combinatie is met succes gebruikt om verschillende mutaties gericht tegen verschillende regio's van de KISS1R cDNA-sequentie, alsmede voor de versterking van deze zeer GC-rijke-gen te introduceren. Figuur 1 toont fietsen en versterking voorwaarden voor de mutagenese van KISS1R. Deze voorwaarden zijn gewijzigd ten opzichte van het QuikChange plaatsgerichte mutagenese kit (Stratagene).
Figuur 2. Toont een representatief resultaat het gebruik van deze geoptimaliseerde protocol. De toevoeging van 4% of 8% DMSO in combinatie met de PCRx Enhancer verbetert rendement van versterking van de GC-rijke KISS1R cDNA-bevattende plasmide. In dit representatieve experiment, 4% DMSO iets betere versterking voorwaarden ten opzichte van 8% DMSO. Transformatie van DpnI behandeld amplificatieproducten met ultracompetent E. coli levert meestal 100 tot meer dan 1.000 kolonies, en de snelheid van succesvolle introductie van de gewenste mutaties is 80-90% zoals bepaald door DNA-sequencing. - Gebruik van MycKISS1R constructies aan de receptor fysiologie studie:
In dit representatief experiment, de wild-type pCS2 + MycKISS1R versterkt volgens het geoptimaliseerde protocol hier beschreven wordt gebruikt om te studeren in vivo KISS1 receptor afbraak in een relevante cellijn (HEK-293) tijdelijk te drukken MycKISS1R. Na het behandelen van de getransfecteerde HEK-293 cellen met lysosoom (leupeptin) of proteasoom (MG132) remmers volgens het protocol beschreven in methoden, worden de cellen gelyseerd en verwerkt voor western blot. Het bovenste paneel van Figuur 3 toont de scan van MycKISS1R monomeren terwijl het onderste paneel toont de kwantificering van de bands die op bovenste paneel. Kwantificering van bands geeft aan dat noch 6u of 16u van leupeptin behandeling MycKISS1R eiwitniveaus beïnvloed. Omgekeerd, de behandeling met MG132 resulteerde in een tijd-afhankelijke stijging van de MycKISS1R eiwit in deze cellen, die culmineert met een 45-voudige accumulatie van de receptor na 16 uur van incubatie met MG132. Deze waarnemingen geven aan dat, in tegenstelling tot de meeste G-eiwit gekoppelde receptoren, KISS1R wordt afgebroken door het proteasoom (in plaats van het lysosoom).
| DMSO | |||
| Reagentia | 0 | 4% | 8% |
| Water | 35 | 33 | 31 |
| 10x Pfu Ultra Taq buffer | 5 | 5 | 5 |
| dNTP mix (10mm) | 1 | 1 | 1 |
| Primer zin (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| Primer antisense (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| 10x PCRx Enhancer Solution | 5 | 5 | 5 |
| DMSO | 0 | 2 | 4 |
| Pfu Ultra Taq-polymerase (2.5U/μl) | 1 | 1 | 1 |
| plasmide DNA (20ng/μl) | 1 | 1 | 1 |
Tabel 1. Combinatie van reagentia met succes gebruikt om muteren en versterken van de GC-rijke KISS1R
Figuur 1. Fietsen voorwaarden van succesvolle mutagenese en versterking van de GC-rijke KISS1R: Een 2min warme start werd gevolgd door 18 cycli van 30 sec smelt bij 95 ° C; 1 min. annealing bij 55 ° C en 6 min extensie bij 68 ° C. Een extra 10 min extensie bij 68 ° C werd toegevoegd aan het einde van de laatste cyclus. Deze instellingen werden aangepast van de oorspronkelijke mutagenese protocol van de QuikChange II XL-plaats-gerichte mutagenese kit (Stratagene).
Figuur 2. Visualisatie van GC-rijke pCS2 + Myc KISS1R versterkt in de aanwezigheid of afwezigheid van DMSO: Vijf pi fracties van pCS2 + Myc KISS1R versterkt in het bijzijn van 0, 4 of 8% DMSO werden geladen in deze vertegenwoordiger 1% agarose gel gekleurd met ethidium bromide en gevisualiseerd met behulp van UV-licht. Het plasmide banden van 6KB zijn zichtbaar op beide rijstroken geladen met PCR-producten versterkt in de aanwezigheid van 4% en 8% DMSO, maar niet op de eerste rijstrook, die was geladen met een PCRproduct versterkt in de afwezigheid van DMSO.
Figuur 3. Effect van leupeptin of MG132 op het niveau van Myc KISS1R eiwit in HEK-293 cellen: HEK-293 cellen die Myc KISS1R werden behandeld met 100μg/ml leupeptin of 10μM MG132 bij 37 ° C voor de aangewezen tijden. Myc KISS1R op 400μg van de cel lysaat werd immunogeprecipiteerd met 2.5μg van agarose-geconjugeerd anti-myc antilichaam en geanalyseerd door western blot. (A) LI-COR Odyssey detectie van Myc KISS1R na incubatie van immunoblots met konijn anti-Myc-tag antilichaam, gevolgd door incubatie met IRDye 800CW-gelabeld anti-konijn; (B) Kwantificering van Myc KISS1R bands getoond in (A) met behulp van de LI-COR Odyssey kwantificering software. De resultaten worden weergegeven als fold-stijging ten opzichte van onbehandelde cellen (tijd 0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plaats-gerichte mutagenese is gebruikt om eiwit-functie studie door het introduceren van nucleotide veranderingen in de coderende sequentie van gerichte genen voor meer dan drie decennia. De originele techniek werd beschreven in 1978 door de Brits-Canadese chemicus en Nobelprijswinnaar Michael Smith 10. Michael Smith deelde de 1993 Nobelprijs voor de Scheikunde met Kary Mullis, de Amerikaanse biochemicus die de uitvinder van de Polymerase Chain Reaction (PCR) 11. De originele methode beschreven door Michael Smith is verbeterd door de jaren heen. De mogelijkheid om mutaties, inserties of deleties te introduceren in de gewenste gensequentie in een enkele PCR-reactie heeft bijgedragen aan de hoge nauwkeurigheid en slagingspercentages van deze procedure, evenals de productie van mutanten in een relatief korte periode van tijd.
Ondanks alle technische verbeteringen, mutaties en versterking van zeer GC-rijke-gen sequenties zoals KISS1R bijzonder lastig. De grootte van de primers ontworpen voor mutagenese van hoge GC inhoud sequenties moet worden aangepast aan de GC-content bieden, zodat de smelttemperatuur wordt binnen het aanbevolen bereik. Dienovereenkomstig, primers om mutaties te introduceren in KISS1R zijn grootte tot een smeltpunt tussen 78 ° -86 ° C hebben Sommige van de KISS1R gen regio's hebben een GC-gehalte van meer dan 85%. De grootte van de primers ontworpen om mutaties te introduceren in deze regio's moeten worden aangepast aan het smeltpunt assortiment bovenstaande voldoen. Primers met smeltpunten boven die limiet mag niet scheiden bij 95 ° C, afbreuk te doen aan versterking. Aan de andere kant, primers met een Tm lager dan 78 ° C hebben meer kans om te binden aan en niet-specifieke sequenties te amplificeren.
Ook zijn versterking voorwaarden en reagentia geoptimaliseerd voor het hoge GC-gehalte volgorde van KISS1R. Een combinatie van 4% DMSO en een PCR Enhancer Solution van Invitrogen (Tabel 1 en figuur 2) is aangetoond dat amplificatie-efficiëntie van KISS1R te verhogen. Als alternatief hebben andere reagentia, zoals betaïne met succes gebruikt voor de versterking van andere GC-rijke sequenties 12,13 te verbeteren. Echter, er was geen merkbaar positief effect van betaïne op de KISS1R versterking in onze handen. Ook kan PCR enhancer oplossingen van andere leveranciers net zo kunnen verbeteren versterking van de GC-rijke sequenties.
Met behulp van de optimale instellingen hier beschreven, hebben we met succes geïntroduceerd aantal mutaties in verschillende regio's van de KISS1R cDNA, die tot opgenomen om 6 nucleotide veranderingen in een keer (uitgevoerd door dezelfde primers) en het schrappen van tot 27 nucleotiden. Transformatie van deze mutanten gegenereerd honderden tot duizenden kolonies met een hoog (80-90%) percentage van kolonies met de juiste volgorde mutant bevestigd door DNA-sequencing.
Plaats-gerichte mutagenese kan ook worden gebruikt om antigene tags zoals Myc of vlag aan de amino-of carboxyl-uiteinde van eiwitten toe te voegen. Deze tags zorgen voor selectieve immunoprecipitatie en / of de detectie van proteïnen, en zijn vooral handig als een betrouwbare antistoffen tegen het eiwit van belang niet beschikbaar zijn, zoals bij KISS1R. In het voorbeeld hier gepresenteerd, is de expressievector codering voor de KISS1R, die is gefuseerd met een elf aminozuur Myc-tag op zijn amino-terminus (My cKISS1R), gebruikt om de afbraakroute voor KISS1R studie in HEK-293 cellen. De efficiëntie van de transfectie van HEK-293 cellen met mijn cKISS1R met behulp van de hier beschreven methode is 25-30%. Zo wordt immunoprecipitatie gebruikt om mijn cKISS1R concentraat van cellysaten dus het verbeteren van detectie en visualisatie van de receptor. Deze aanpak wordt vaak gebruikt om te vergemakkelijken visualisatie van eiwitten die endogeen op een laag niveau en 14.
Belangrijk is, dient G-eiwit gekoppelde receptoren, zoals KISS1R, evenals andere membraaneiwitten, niet worden gehomogeniseerd door sonicatie of gekookt voordat u gel geladen. Hoewel deze procedures worden meestal gebruikt om monsters proces voor immunoprecipitatie of western blot, sonicatie en koken leiden tot de aggregatie van membraaneiwitten, afbreuk te doen aan hun eigenlijke migratie tijdens de elektroforese 15. In feite, vervanging van deze procedures met mildere homogenisering, zoals de naald-passage, en een lagere sample verwarming, zoals de 37 ° C gedurende 30 minuten (in plaats van koken) is nodig voor de detectie van KISS1R monomeren.
Immunogeprecipiteerd Mijn cKISS1R wordt gedetecteerd met behulp van Odyssey Imager (LI-COR Biosystems) na incubatie van blots met infrarood dye-geconjugeerd secundair antilichaam. De voordelen van dit systeem zijn onder een behoud van sterk signaal dat kan met hoge nauwkeurigheid worden opgespoord voor maanden, in tegenstelling tot de kortstondige signaal uitgezonden door chemiluminescentie. Bovendien, de kwantificering software van Odyssey Imager biedt een groteregevoeligheid en lineariteit van de detectie in vergelijking met traditionele kwantificering van gescande x-ray-films na chemiluminescentie. Echter, kan de detectie van mierikswortel peroxidase (HRP)-geconjugeerde antilichamen door chemiluminescentie worden gebruikt.
De afwezigheid van de klassieke lysosomale afbraak en de detectie van proteasomale afbraak van KISS1R hier beschreven in de HEK-293-cellen zijn ook waargenomen in COS-7 cellen getransfecteerd met dezelfde MycKISS1R expressievector 9. Hoewel ongebruikelijk, proteasomale afbraak van G-eiwit gekoppelde receptoren is eerder gemeld in de literatuur 16,17.
Kortom, dit manuscript laat zien hoe het effect van genetische mutaties te onderzoeken in de KISS1R gen, dat is een zeer GC-rijke sequentie, om te begrijpen hoe mutaties in deze receptor kan leiden tot reproductieve wanorde fenotypes, zoals hypogonadotropic hypogonadisme of voortijdige puberteit .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Reproductive afdeling van het National Institute of Child Health and Human Development (NICHD - R21 HD059015) en door het Charles H. Hood Foundation Young Investigator Child Health Research Award (Boston, MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene, Agilent Technologies | 600385 | |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 | |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene, Agilent Technologies | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 | |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47491 | |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 | |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24948 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | EMD Millipore | 16-219 | |
| 2x loading buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | Bio-Rad | 345-0028 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | ||
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78430 |
References
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).
- Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).
- Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty. N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).
- Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54. J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).
- Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).
- Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function. J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).
- Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner. PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).
- Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation. Endocrinology. , Forthcoming (2011).
- Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence. J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 262, 56-61 (1990).
- Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).
- Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).
- Kong, K. C. Chapter 10. MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. Poyner, D. R., Wheatly, M. , Wiley-Blackwell. 197-204 (2010).
- Hall, R. A. Chapter 9. G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. George, S. R., O'Dowd, B. F. , John Wiley & Sons, Inc. 170-171 (2005).
- Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors. J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).
- Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin. Science. 294, 1307-1313 (2001).
