Summary
Kisspeptin reseptör (KISS1R) Mutasyonlar hastalarda üreme bozuklukları ile ilişkilidir. Burada ilgi KISS1R GC-zengin dizisi de immunoprecipitation ve western blot reseptör bozulması yolu karakterize KISS1R yapıları kullanımı gibi mutasyonlar nasıl tanıtmak için açıklar.
Abstract
Kisspeptin reseptör (KISS1R), ergenlik tetik ve yetişkinlik 1,2,3 üreme yetki düzenleyicisi olarak tanınan bir G-protein kenetli reseptör . Hastalarda tespit KISS1R iodiopathic hipogonadotropik hipogonadizm (İHH) 1,2 ve erken ergenlik 4 inaktivasyon mutasyonları ile ilişkili bulunmuştur. Bu mutant Fonksiyonel çalışmalar yanı sıra, bu reseptörün üreme yönetmelik altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir hastalığın sonuçlarının şekillenmesinde bu anormal KISS1R sinyalizasyon ve işlevi sonucudur . Ancak, yüksek GC-zengin KISS1R gen dizisi oldukça zor mutasyonlar tanıtmak veya PCR ile bu reseptör kodlayan gen yükseltmek için yapar.
Burada, bu son derece GC-zengin sıra laboratuvarda bir düzine KISS1R mutantlar oluşturmak için başarıyla kullanılmaktadır ilgi mutasyonlar tanıtmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz değiştirmelerin, silme veya KISS1R sırayla eklemeler KISS1R mutant bir dizi amplifikasyon kolaylaştırmak için PCR koşulları optimize etmiş. Ayrıca, PCR arttırıcı çözüm yanı DMSO küçük bir yüzdesi olarak amplifikasyon geliştirmek için özellikle yararlıdır. Bu optimize yordam yanı sıra diğer GC-zengin şablonları için yararlı olabilir.
KISS1R kodlama ifade vektör mutasyonlar KISS1R işlevini değiştirmek ve ilişkili üreme fenotipleri yol nasıl anlamak için bu reseptör sinyalizasyonu ve fonksiyon karakterize etmek için kullanılmaktadır. Buna göre, site directed mutagenesis tarafından oluşturulan KISS1R mutantlar potansiyel uygulamaları, birçok çalışmada 1,4,5,6,7,8 gösterilmiştir . Örnek olarak, erken ergenlik ile ilgili KISS1R (Arg386Pro), kazanç fonksiyon-mutasyon KISS1R 9 bozulması oranı değiştirmek için reseptör ligand stimülasyon 4 gibi yanıt uzatmak gösterilmiştir . İlginçtir ki, çalışmalar en fazla G-protein reseptörler 9 açıklanan klasik lizozomal bozulması karşı KISS1R proteazom tarafından bozulmuş olduğunu göstermektedir. Burada sunulan örnekte, KISS1R bozulması, geçici Myc etiketli KISS1R (MycKISS1R) ifade İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri (HEK-293) incelenmiştir ve proteazom veya lizozom inhibitörleri ile tedavi. Hücre lizatları western blot analizi ile bir agaroz-konjuge anti-myc antikor kullanarak immunoprecipitated. Algılama ve leke üzerinde MycKISS1R ölçümü LI-COR Odyssey Kızılötesi Sistemi kullanılarak yapılır. Bu yaklaşım, çalışmanın yanı sıra diğer ilgi proteinlerin bozulması yararlı olabilir.
Protocol
1. Site-directed mutagenesis yüksek GC-zengin KISS1R gen sekansı
- Şablon: N-terminus'a erimiş bir Myc etiketi ile insan KISS1R tam cDNA dizisi. Bu dizi daha sonra transfections için kullanılan memeli hücre hatları ile uyumlu pCS2 + ifade vektörü, klonlanmış. Bu ifade, vektör pCS2 + Myc KISS1R gibi burada denir.
- Primer tasarımı: primerler Quikchange Site Yönetmen Mutagenez kiti (Stratagene) talimatlarına göre, istenen mutasyonlar taşımak için tasarlanmıştır. Özet olarak:
- Her ikisi de (ileri ve geri) primerler istenilen mutasyon içerir ve plazmid ters ipliklerini aynı sıra tavlama gerekir (örneğin, ileri ve ters primerler birbirini tamamlayıcı)
- Astarlar, bir ya da daha fazla C veya G üsleri 25 ila 45 üsleri uzun ve bitiş olmalıdır
- Tanıtılan mutasyon (lar) astar ortasında olması ve her iki tarafta ~ 10-15 üsleri doğru sırası ile çevrili
- Astar Erime sıcaklığı (Tm) eşit veya 78 ° C daha fazla olmalıdır Tm tahmin etmek için aşağıdaki formülleri kullanın:
- Mutasyonlar tanıtarak zaman: Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N -% uyumsuzluğu (N üsleri astar uzunluğunu)
- Eklemeleri veya silmeleri tanıtan zaman: Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N (N eklenen veya silinmiş üsler dahil değildir)
- Desalted primerler (başka saflaştırılması gerekli) kullanın.
- Her ikisi de (ileri ve geri) primerler istenilen mutasyon içerir ve plazmid ters ipliklerini aynı sıra tavlama gerekir (örneğin, ileri ve ters primerler birbirini tamamlayıcı)
- Iyi amplifikasyon koşullarına ek PCRx Enhancer çözümü (Invitrogen) ve DMSO içerir. % 4 ve% 8 olarak DMSO en az 2 konsantrasyonları, test edilmelidir. PCR koşulları ve pCS2 + MycKISS1R bir temsilcisi PCR sonuçları Şekil 2'de gösterildiği gibi; I ve Şekil 1'de Tablo gösterilmiştir.
- 37 1s 30dk DpnI metillenmiş DNA sindirimi ebeveyn DNA amplifikasyon ürünleri ortadan kaldırılması ° C: PCR ürünü bir santrifüj tüpüne 17.5μl 10x NEBuffer 2μl 4 ve DpnI, 0.5μl (10U, New England Biolabs) ile karıştırın.
- XL10-Altın Ultracompetent E. 45μl DpnI ile tedavi edilen DNA karışımı 2μl Dönüşümü PCR ürünü DpnI tedavi 15 ml hücre kültürü tüp önceden soğutulmuş coli (Stratagene). Β-mercaptoethanol 2μl ekle ve Stratagene yönergeleri izleyin. Tabak 37 100μg/ml ampisilin ve inkübe içeren LB-agar plaklarına dönüştürülmüş bakteri 100-400μl ° C
- Miniprep 2 ila 4 ayrı koloniler plazmid DNA izole etmek. Istenilen mutasyonlar, izole edilmiş DNA diziliminin belirlenmesi ve analizi ile başarılı bir giriş onaylayın.
2. HEK-293 hücre içine MycKISS1R geçici transfeksiyon
- Aşağıdaki deneyler 37 CO 2 inkübatör (% 5 CO 2) kültüre insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-293) yapılmaktadır ° C DMEM% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş.
- Tohum HEK-293 6-kuyucuğu 2.5x10 5 hücre / ml hücreleri ve onları 37 gecede büyümesine izin ° C transfeksiyon önce. NOT: (i) her deneysel durum için üç nüsha kuyuları, (ii) transfeksiyon zaman ideal hücre izdiham 30% -50%.
- Transfect HEK-293 üreticinin talimatlarına göre GenePorter Transfeksiyon Reaktif (Genlantis) kullanarak hücrelerin, serum serbest DMEM Mix yarım 0.5μg pCS2 + MycKISS1R artı 0.5μg kontrolü (boş) DNA / iyi 1μg toplamını vektör. Transfekte DNA mikrogram ortalama 10μl transfeksiyon reaktifi ile diğer yarısını karıştırın. NOT: İdeal plazmid DNA konsantrasyonu değişebilir.
3. Hücre tedavisi ve lizis
- Transfeksiyon 24 saat sonra, 1 ml DMEM% 2.5 FBS (hücre metabolizmasını azaltmak için) içeren hücre orta yerine. NOT: Bu azalma serum kolaylaştırmak ve / veya sonuçlarını algılama yükseltmek olabilir.
- Doğrudan bir bütün 6 plaka her kuyuya lizozom inhibitörü (100μg / iyi Leupeptin) ekleyin. ° C 6 veya 16 saat boyunca (veya diğer istenen kez) 37 inkübe
- Doğrudan iki bütün 6 kuyucuğu tüm kuyulara taze hazırlanan proteazom inhibitörü (10μM / iyi MG132 ile) ekleyin. 37 ° C 2, 4, 6 veya 16 saat (veya istenilen kez) inkübe edin. Dördüncü 6-plaka (0 zaman noktası) tüm kuyulara araç ve 37 inkübe ° C 16h için
- Inkübasyon bittiğinde, buz plakaları hareket ve protein parçalanmasını önlemek için buz üzerinde tüm bu parçalama yordamı gerçekleştirmek:
- Protein verimi artırmak için, tek bir centr 6-kuyucuğu triplicates birleştirmekifuge tüp
- 1ml buz fosfat ile bir kez orta ve yıkama hücreleri aspire tamponlu salin (PBS)
- Proteaz inhibitörleri içeren (100 mM AEBSF-HCI, 80μM aprotinin, 5mM bestatin, 1x kokteyl içeren buz lizis tamponu (20mm Hepes, pH 7.4,% 1 NP-40, 150 NaCl, 1mm EDTA,% 0,25 sodyum deoksikolatın) 100μl ekle iyi 1.5mm E-64, 0,5 M EDTA, 2mm leupeptin ve 1mm pepstatin A, artı 2mm PMSF)
- Bir hücre kazıyıcı ve transfer hücre çıkarın hücreleri tüpler santrifüj lizatları
- 20-gauge iğne ile hücre ~ 10 defa geçirin. NOT: membran proteinlerinin western blot tespiti için tasarlanmış örnekler sonikasyon etmeyin. Sonikasyon agregasyon membran proteinlerinin elektroforez sırasında doğru göç olmaz yol açar
- Sallanan bir platform üzerinde, 4 ° C'de 1s hücre lizatları inkübe
- Santrifüj hücre lizatları 4 ° C de 10 dakika 10.000 x rpm ve yeni tüpler transfer süpernatantlar. NOT: Bu adım sırasında pelet Rahatsız etmeyin
- BCA yöntemi kullanılarak süpernatantlar 10μl protein konsantrasyonu (Pierce) belirleyin
- Proteaz inhibitörleri içeren lizis tamponu ile 1mg/ml lizatları seyreltilir.
4. MycKISS1R, Immunoprecipitation ve Western Blot algılama
- Buz üzerinde aşağıdaki immunoprecipitation (ya da 4 ° C) adımları uygulayın:
- Agaroz-konjuge anti-myc antikor (2.5μg / numune) uygun miktarda buz PBS ile iki kez yıkayın ve lizat protein 400μg için ekleyin.
- Lizatları üzerinde MycKISS1R Immunoprecipitate geceleme 4 ° C yavaşça sallanarak sallanan platform.
- 4 darbe santrifüj agaroz boncuk Spin ° C (x rpm 10.000 'e kadar)
- Süpernatantlar (pelet rahatsız olmadan) ve atın aspire
- Boncuklar, buz gibi soğuk lizis tamponu ve buz gibi iki kez PBS ile bir kez yıkayın. Iplik önce hafifçe tüpler haricindekileri
- 2x örnek yükleme tamponu% 10 β-mercaptoethanol içeren antikor bağlı MycKISS1R içeren Ressuspend boncuk.
- Western Blot MycKISS1R immün:
- 30 dakika 37 ° ° C NOT Isı örnekleri: membran proteinlerinin western blot algılama yönelik örnekleri kaynatın. Sonication gibi, kaynama, ayrıca bu proteinlerin birleşimi yol açar
- 5 dakika buz içine hemen tüpler Taşı
- Ayrı proteinleri SDS-PAGE ile% 4-15 gradient jel.
- Bio-Rad Yarı-Kuru Transfer Transfer tamponunda 30 dakika (48mm Tris tabanı, 39mm glisin, 1.2mm SDS,% 20 metanol, pH 9.2) için 25V Immobilon-FL PVDF membran (kızıl ötesi tespiti için) transfer cihaz
- Oda sıcaklığında 5 dakika membranlar yıkayın Tris-Tamponlu Salin (TBS) ve sallanan platform (alternatif olarak, TBS% 5 süt non-spesifik bağlama engellemek için kullanılabilir) engelleme Licor Odyssey ile oda sıcaklığında için blok 1s.
- 4 gece boyunca inkübe membranlar ° C% 0.1 Tween-20 içeren engelleme çözümü tavşan anti-myc antikor (1:500)
- Primer antikor çıkarın ve her TBS ile% 0.1 Tween-20 (TBST) içeren 5 dakika membranlar 3 kere yıkayın
- 1s için membranlar% 0.1 Tween-20 ve% 0,01 SDS içeren tampon engelleme keçi Infra-RedDye ® 800CW etiketli anti-tavşan IgG (1:10,000) oda sıcaklığında inkübe
- Sekonder antikoru çıkarın, (Tween-20 Kalan kaldırmak için), sadece TBS ile TBST ve son bir kez her 5 dk membranlar 3 kere yıkayın
- Görüntüleme ve LI-COR Odyssey Infra-Red Imager kullanarak MycKISS1R ölçümü:
- Membranlar MycKISS1R LI-COR Odyssey Infra-Red Imager kullanarak görüntülü olacaktır. Başlamak için, ızgara ile hizalayarak, Odyssey tarayıcının sol alt köşesinde membran yerleştirmek. Kauçuk paspas ile kaplayın, rulo ile baloncuklar pürüzsüz ve kapağını kapatın
- Bilgisayarda yeni bir proje dosyası oluşturun. Dosya adı, "done" tıklatın ve sonra "tarama" tarayıcı giriş girin. Boyutu tarayıcı konsol membran sığdırmak için kutusuna ve sonra 169μm çözünürlük ve orta görüntü kalitesini seçin
- Yoğunluğu, her bir sinyalin beklenen gücüne göre 700 (kırmızı) ve 800 (yeşil) kanallar için ayarları seçin. Bu sadece sinyal görselleştirme amaçlı ve miktar etkisi olmaz. "Taramayı başlatmak"
- Ad tarama ve kaydetmek, daha sonra ölçümü için yeni bir pencere açmak için "Tamam" a tıklayın. MycKISS1R monomerlerin yaklaşık 43kD görünür olmalı
- "Kutu" aracı (sol kenar çubuğundan) kullanarak, ilk grubu çevresinde bir kutu çizin. Tüm bantlar üzerinde "kopya" ve "yapıştır" kutusunu, sonra tüm bantları uyum emin olmak için etrafında kutusuna sürükleyin
- Kullanan tüm kutuları seçin "Ctrl + A" ve sonra medyan arka plan çıkarmak için seçeneği seçin. Üst menü çubuğunda "raporu" ve miktarının değerleri olan bir tablo belirecektir tıklayın. Burada gösterilen Temsilcisi sonuçları huk.(zaman sıfır) tedavi edilmeyen hücreleri üzerinde kat artırmak gibi nted
5. Temsilcisi Sonuçlar:
- GC-zengin KISS1R gen sekansı Site-directed mutagenesis:
Tablo 1. KISS1R amplifikasyon verimliliğini artırmak için reaktifler kombinasyonu gösterir. Bu kombinasyon KISS1R cDNA dizisi farklı bölgelerinde yöneltilen birkaç mutasyonların yanı sıra bu son derece GC-zengin gen amplifikasyonu için başarıyla tanıtmak amacıyla kullanılmıştır. Şekil 1 KISS1R mutagenez için bisiklet ve amplifikasyon koşulları gösterir. Bu koşullar QuikChange Site Yönetmen Mutagenez kiti (Stratagene) değiştirilmiştir.
Şekil 2, bu optimize protokolünü kullanarak temsili bir sonuç göstermektedir . Ayrıca% 4 veya% 8 PCRx Enhancer ile birlikte DMSO, GC-zengin KISS1R cDNA içeren plazmid amplifikasyon verimi önemli ölçüde artırır. Bu temsili bir deneyde,% 4 DMSO 8% DMSO göre biraz daha iyi amplifikasyon şartları sağladı. Ultracompetent E. DpnI ile tedavi edilen amplifikasyon ürünleri Dönüşüm coli tipik olarak 1.000 'den fazla koloni 100 verimleri ve DNA dizi belirlenen istenilen mutasyonlar başarılı bir giriş oranı% 80-90. - Reseptör fizyolojisi MycKISS1R yapıları incelemek için kullanın:
Bu temsili bir deneyde, vahşi tip pCS2 + MycKISS1R optimize protokol burada açıklanan geçici MycKISS1R ifade ilgili bir hücre hattı in vivo KISS1 reseptör bozulması (HEK-293) çalışma için kullanılır göre amplifiye. Yöntemleri açıklanan protokole göre lizozom (leupeptin) veya proteazom (MG132) inhibitörleri ile transfekte HEK-293 hücre tedavisinde sonra, hücreler parçalanmış ve western blot için işlenmiş. Şekil 3 üst panelde alt panel, üst panelde gösterilen bantları miktarının gösterir iken MycKISS1R monomerlerin tarama gösterir. Bantların Niceleme leupeptin tedavi 6h ne 16h ne MycKISS1R protein düzeyleri etkilediğini gösterir. Tersine, tedavisi MG132, MG132 ile inkübasyon 16h sonra reseptör 45 kat birikimi ile doruğa bu hücreler, zamana bağımlı bir MycKISS1R protein artış, sonuçlandı. Bu gözlemler, en fazla G-protein reseptörler aksine, KISS1R proteazom (lizozoma yerine) tarafından bozulmuş, göstermektedir.
| DMSO | |||
| Reaktifler | 0 | % 4 | % 8 |
| Su | 35 | 33 | 31 |
| 10x Pfu Ultra Taq tampon | 5 | 5 | 5 |
| dNTP mix (10mM) | 1 | 1 | 1 |
| Primer anlamda (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| Primer antisens (25pmol/μl) | 1 | 1 | 1 |
| 10x PCRx Enhancer Çözüm | 5 | 5 | 5 |
| DMSO | 0 | 2 | 4 |
| Pfu Ultra Taq polimeraz (2.5U/μl) | 1 | 1 | 1 |
| plazmid DNA (20ng/μl) | 1 | 1 | 1 |
Tablo 1 GC-zengin KISS1R, başarılı bir şekilde mutasyona ve yükseltmek için kullanılan reaktifler kombinasyonu
Şekil 1. GC-zengin KISS1R başarılı mutagenez ve amplifikasyon Bisiklete binme koşulları: 2min sıcak başlangıç 95 18 30 sn erime döngüleri izledi ° C; 1 dakika 55 68 ° C ve 6 dakika uzatma tavlama ° C 68 ek bir 10 dakika uzatma ° C son döngüsünün sonuna eklenir. Bu ayarlar QuikChange II XL-Site-Yönlendirilmiş Mutagenez kiti (Stratagene) orijinal mutagenez protokol ayarlandı.
Şekil 2. GC-zengin pCS2 DMSO varlığı ya da yokluğu da güçlendiğini + Myc KISS1R Görselleştirme: 0 varlığı amplifiye pCS2 Beş ul alikotları + Myc KISS1R,% 4 veya 8 DMSO ethidium ile boyanmış bu temsili% 1 agaroz jel yüklenen bromür ve görüntülenmiştir kullanarak UV ışık. 6KB plazmid bantları PCR% 4 varlığı amplifiye ürünler ve% 8 DMSO yüklü iki şerit üzerinde görünür, ama ilk şeritli değil, bir PCR ile yüklenenDMSO yokluğunda abartılıyor.
Şekil 3. Myc KISS1R HEK-293 hücrelerinde protein düzeyleri leupeptin veya MG132 Etkisi: Myc KISS1R ifade HEK-293 hücre 37 100μg/ml leupeptin veya 10μM MG132 ile tedavi edildi ° C kez. Hücre lizat 400μg Myc KISS1R agaroz-konjuge anti-myc antikor 2.5μg ile immunoprecipitated ve western blot ile analiz edildi. (A) (B) Myc KISS1R bantları Kantitasyonu gösterilmiştir; IRDye 800CW etiketli anti-tavşan ile inkübasyon tavşan anti-Myc etiketi antikor Myc KISS1R immunoblots, inkübasyon sonra (A) LI-COR Odyssey algılama LI-COR Odyssey kantifikasyon yazılım. Tedavi edilmezse hücreleri (zaman 0) üzerinde kat artış Sonuçlar temsil edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Site-directed mutagenesis üzerinden üç yıl için hedef genlerin kodlama sırası nükleotid değişiklik protein fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Orijinal teknik, İngiliz, Kanadalı Kimyager ve Nobel ödülü sahibi Michael Smith 10 tarafından 1978 yılında tarif edilmiştir. Michael Smith Kary Mullis, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 11 icat eden Amerikalı biyokimyacı, 1993 Nobel Kimya Ödülü paylaştı. Yıllar boyunca Michael Smith tarafından açıklanan orijinal yöntem geliştirilmiştir. , Istenen gen sekansı tek bir PCR reaksiyonu mutasyonları, ekleme veya silme tanıtmak için yeteneği yüksek doğruluk ve başarı oranları, bu prosedürün yanı sıra zaman görece kısa bir süre içinde mutantlar üretimine katkıda bulunmuştur.
Tüm teknik gelişmeler gibi KISS1R gibi yüksek GC-zengin gen dizileri, mutasyonlar ve amplifikasyon rağmen özellikle sıkıntılı. GC içeriği yüksek dizilerinin mutagenez için tasarlanmış primerler boyutu erime sıcaklığı önerilen aralık içinde olduğunu GC içeriğine uygun olarak ayarlanmalıdır. Buna göre, KISS1R mutasyonlar tanıtmak için primerler 78 ° -86 ° C arasında bir erime noktasına sahip ölçekli Bazı KISS1R gen bölgelerinin% 85'i aşkın bir GC içeriği var. Bu bölgelerde mutasyonlar tanıtmak için tasarlanmış primerler boyutu yukarıda belirtilen erime noktası aralığı karşılamak için ayarlanabilir olmalıdır. Bu limitin üzerinde erime noktaları ile Astarlar 95 ° C, zarar amplifikasyon ayıramazsınız. Öte yandan, primerler Tm 78 daha düşük ° C bağlamak ve non-spesifik dizileri yükseltmek için daha fazladır.
Aynı şekilde, amplifikasyon koşulları ve reaktifler KISS1R yüksek GC içeriği dizisi için optimize edilmiştir. Invitrogen (Tablo 1 ve Şekil 2)% 4 DMSO ve PCR Enhancer Çözümü bir arada KISS1R amplifikasyon verimliliğini artırmak için gösterilmiştir. Alternatif olarak, bu tür betain gibi diğer reaktifler başarıyla diğer GC zengin dizileri 12,13 amplifikasyon geliştirmek için kullanılır. Ancak, elimizde KISS1R amplifikasyon betain gözle görülür hiçbir olumlu etkisi vardı. Ayrıca, diğer tedarikçilerden temin PCR arttırıcı çözümler GC zengin dizilerinin amplifikasyonu iyileştirilmesi eşit yeteneğine sahip olabilir.
Burada açıklanan optimize edilmiş ayarlar kullanarak, başarılı bir şekilde tek seferde 6 nükleotid değişiklikleri (aynı primerler tarafından taşınan) ve 27 nükleotidler kadar silme kadar dahil cDNA KISS1R, farklı bölgelerde çeşitli mutasyonlar girmiştik. Bu mutant Dönüşüm DNA dizi teyit doğru mutant dizisi içeren kolonilerin yüksek (% 80-90) oranı ile kolonilerin binlerce yüzlerce oluşturulur.
Site-directed mutagenesis da proteinlerin amino veya karboksil ucuna Myc veya Bayrak gibi antijenik etiketleri eklemek için kullanılabilir. Bu etiketler, seçici immunoprecipitation ve / veya proteinlerin tespiti için, izin ve güvenilir ilgi protein karşı antikorlar KISS1R için mevcut değildir, ne zaman özellikle yararlıdır. Burada sunulan örnek, (Benim cKISS1R) amino terminus bir on bir amino asit Myc-tag erimiş KISS1R, ifade vektör kodlama HEK-293 hücrelerinde KISS1R bozulması yolu çalışma için kullanılır . Burada anlatılan yöntemi kullanarak Benim cKISS1R HEK-293 hücrelerin transfeksiyon verimliliği% 25-30. Böylece, immunoprecipitation böylece hücre reseptör algılama ve görselleştirme iyileştirilmesi lizatları cKISS1R konsantre kullanılır. Bu yaklaşım genellikle görselleştirme proteinlerin yanı sıra 14 düşük seviyelerde endojen ifade kolaylaştırmak için kullanılır.
Önemlisi, G-protein gibi KISS1R birleştiğinde reseptörleri, yanı sıra diğer membran proteinlerinin, sonication homojenize veya jel yükleme önce kaynatılmalıdır olmamalıdır. Bu işlemler genellikle 15 elektroforez sırasında doğru göç zarar immunoprecipitation veya western blot, sonication ve membran proteinlerinin toplama kaynar kurşun örnekleri işlemek için kullanılır. Aslında, bu işlemler gibi 37 gibi iğne geçiş gibi hafif homojenizasyon, ve alt örnek ısıtma, değiştirilmesi ° C de 30 dakika (yerine kaynama dışında) KISS1R monomerlerin tespiti için gereklidir .
Benim cKISS1R kızılötesi boya-konjuge sekonder antikor ile leke inkübasyondan sonra Odyssey Imager (LI-COR Biosystems) kullanılarak tespit Immunoprecipitated. Bu sistemin avantajları, aylar kemilüminesans yaydığı kısa süreli sinyal karşı yüksek doğruluk ile tespit edilebilir sürdürülmesi güçlü bir sinyal içerir. Ayrıca, Odyssey Imager miktarının yazılımı daha sunuyortaranmış x-ray filmleri kemilüminesans aşağıdaki geleneksel niceliği göre duyarlılık ve algılama doğrusallık. Ancak, horseradish peroksidaz (HRP), konjuge kemilüminesans tarafından antikorların tespiti de kullanılıyor olabilir.
Ayrıca klasik lizozomal bozulması ve KISS1R proteozomal bozulma tespit yokluğunda HEK-293 hücrelerinde Burada anlatılan gözlenmiştir COS-7 aynı MycKISS1R ifade vektör 9 ile transfekte hücreler. G-protein-bağlı reseptörler alışılmadık, proteozomal bozulması, daha önce literatürde 16,17 bildirilmiştir olmasına rağmen.
Özetle, bu yazının bu reseptör mutasyonları gibi hipogonadotropik hipogonadizm ya da erken ergenlik gibi üreme bozukluğu fenotipleri yol nasıl anlamak için, son derece GC-zengin bir dizisi KISS1R gen, genetik mutasyonların etkisini araştırmak için nasıl gösterir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Charles H. Hood Vakfı Genç Araştırmacı Çocuk Sağlığı Araştırma Ödülü (Boston, MA) - Bu çalışma, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (R21 HD059015 NICHD) Üreme Şubesi tarafından kısmen finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene, Agilent Technologies | 600385 | |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 | |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene, Agilent Technologies | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 | |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47491 | |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 | |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24948 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | EMD Millipore | 16-219 | |
| 2x loading buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | Bio-Rad | 345-0028 | |
| Immobilon-FL PVDF membrane | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | ||
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78430 |
References
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).
- Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).
- Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty. N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).
- Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54. J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).
- Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).
- Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function. J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).
- Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner. PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).
- Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation. Endocrinology. , Forthcoming (2011).
- Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence. J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 262, 56-61 (1990).
- Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).
- Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).
- Kong, K. C. Chapter 10. MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. Poyner, D. R., Wheatly, M. , Wiley-Blackwell. 197-204 (2010).
- Hall, R. A. Chapter 9. G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. George, S. R., O'Dowd, B. F. , John Wiley & Sons, Inc. 170-171 (2005).
- Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors. J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).
- Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin. Science. 294, 1307-1313 (2001).
