Summary
РНК-полимеразы II транскрипционных кинетики измеряются на определенных генов в живых клетках. мРНК транскрибируется из генов, представляющих интерес, флуоресцентно меченых и с помощью флуоресцентной Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) в естественных условиях кинетика транскрипционных удлинения получены.
Abstract
Транскрипционной активности РНК-полимеразы II (Пол II) представляет собой динамический процесс, и поэтому измерения кинетики транскрипционного процесса в естественных условиях имеет важное значение. Pol II кинетики была измерена с помощью биохимических или молекулярных методов. 1-3 В последние годы с развитием новых методов визуализации, это стало возможным следовать транскрипции, как это происходит в реальном времени в единый живых клеток. 4 Здесь мы описываем, как проводить анализ Pol II удлинение кинетики на конкретный ген в живые клетки. 5, 6 Используя линию клеток, в которых конкретные локуса гена (ДНК), его мРНК продукта и конечного продукта белок может быть флуоресцентно меченных и визуализируется в естественных условиях , то можно обнаружить фактическое транскрипции мРНК на интересующего гена. 7, 8 мРНК флуоресцентно меткой использованием MS2 системы для мечения РНК в живом организме, где 3'UTR мРНК стенограммы содержат 24 MS2 стволовых петля повторы, которые обеспечивают высокую конкретные сайты связывания для YFP-MS2 белка оболочки, которая маркирует мРНК как транскрибируется 9. Для контроля кинетики транскрипции мы используем флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) метод. По фотообесцвечивания YFP-MS2-меткой нарождающегося стенограммы на сайте транскрипции и затем, после восстановления этого сигнала с течением времени, мы получаем скорость синтеза мРНК новоиспеченных 5. Другими словами, YFP-MS2 флуоресценции восстановления отражает поколения новых MS2 стволовых петель в зарождающейся стенограмм и их связывания флуоресцентных свободной YFP-MS2 молекул, поступающих из окружающей нуклеоплазмы. Кривые восстановления FRAP которые затем анализируются с помощью математических моделей механистической оформляется серии дифференциальных уравнений, для того, чтобы получить кинетических параметров время транскрипции.
Protocol
Клетка системы, используемой должен содержать интегрированную построить ген, который включает в себя MS2 повторяющихся последовательностей для мечения РНК в живых клетках. В этом протоколе мы используем клетки человека U2OS линии укрывательство стабильно интегрированных β-актина гена, то есть флуоресцентно меченных на ДНК, РНК и белка 8, следующим образом (рис. 1А): 5 'гена содержит лак оператора ( Laco) повторяет - они используются для тега гена (ДНК) и тем самым определить геномный локус интеграции. Флуоресцентно меткой лак репрессор белка (LacI) будет связываться с Laco повторов и тег ДНК. МРНК помечены YFP-MS2 белки, которые связываются с MS2 повторов (стволовых петли). Продукт гена CFP-актина и, следовательно, индукция гена приведет к появлению CFP с метками актина цитоскелета. Генной конструкции является трансфицировали в U2OS Тет-Об устойчивых клеточной линии и ее выражение в Тет транскрипционный контроль.
1. Покрытие сотовых и трансфекции:
- 48 часа до измерения, семена ~ 2 * 10 5 клеток на стекле дна блюда культуры ткани (35 мм чашки Петри с 14 мм прозрачным дном микролуночные (0.16-0.19 мм;. Cat номер P35G-1.5-14-C , Маттек, Ashland, штат Массачусетс)). Добавить 2 мл среды в клетки, с тем чтобы достичь 50-80% слияния.
- 24 часа до начала эксперимента, временно трансфекции клеток с конструкциями, которые выражают флуоресцентных маркеров для мечения ДНК и РНК. Используйте FuGENE6 трансфекции реагента (Roche).
Конструкции используются:- YFP-MS2-NLS будут теги MS2 стволовых петель в мРНК транскриптов. Ядерной последовательность локализации (NLS) обеспечивает ядерным последовательность входа для YFP-MS2 белка.
- опционально - CFP-LacI или RFP-LacI, которые будут связываться Laco повторов в 5 'гена и этикетки локуса гена. Tagging локуса гена помогает в отслеживании гена во время FRAP эксперимент, но не является необходимым.
- Инкубируйте клетки, по крайней мере 12 часов, чтобы получить хорошее выражение переходного трансфекции белков (см. примечание).
- 6 - 12 часов до эксперимента добавить 1,5 мкг / мл, доксициклин (Sigma) в клетки для активации Тет-индуцибельной CFP-актин гена.
Примечания:
* Важно, чтобы не достигать очень больших уровни экспрессии трансфицированных белков, чтобы не маскировать сигнал, полученный в частности, из транскрипции сайта, по отношению к фону сигнала. Уровни выражения можно управлять с помощью: а) регулирование времени между трансфекции и эксперимент, б) изменение силы промотора (например, ЦМВ сильнее L30 промотор), в) добавление сигнала ядерного экспорта (NES), чтобы YFP-MS2-NLS белка, которая позволит распределить YFP сигнала в целой клетки.
* Флуорофора используется для измерения желательно photostable на протяжении длительного поглощения, поэтому зеленый / желтый излучающий флуорофоров лучше, чем красный флуорофоров. Информация о различных флуорофоров можно найти в работе 10.
* Определить, что разные каналы света не проступание друг к другу. Используйте слайды содержащие образцы помечены каждый из маркеров отдельно, измерять в каждом слайде интенсивность обоих каналов, а затем вычислить проступание.
2. FRAP:
Эксперимент может быть выполнена на любой микроскоп, способный и получения изображений и выполнения фотообесцвечивания с лазерным лучом. Как правило, FRAP эксперименты проводятся с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Однако, так как в нашем случае эксперимент относительно длинный (15-30 мин), и мы его выполняем одну маленькую локус внутри ядра, важно, чтобы иметь возможность сохранить геном локуса / транскрипции сайта в центре внимания в течение всего эксперимента. Это требует быстрой визуализации в 3-х измерениях с течением времени (4D), и такие темпы приобретения трудно получить, используя сканирующей конфокальной микроскопии. Поэтому мы используем 3D-FRAP системы (Фотометрические), построенных на широком поле Olympus IX81 микроскоп (63x План-Апо, 1,4 NA) оснащен EM-CCD (Квант-ЕМ, Roper), которые могут получать изображения с высокой скоростью (до 30 изображений / сек). Система имеет 405 нм и 491 нм лазеров, которые могут быть синхронизированы с камерой чтобы фотообесцвечивания на конкретные области интереса (ROI) образца. Микроскоп оснащен Lambda DG-4 источника света (Саттер) и XY и Z этапе (До), что позволяет быстро и точно изображений в Z-оси. Все оборудование интегрировано и управляется Метаморф (Molecular Devices). Живая клетка Эксперименты проводились при температуре 37 ° C с 5% CO 2 с использованием живых-клеточной камерная система (Tokai).
- Процедура: За полчаса до эксперимента, включить отопительный прибор, микроскоп и лазер. Во время экспериментовMent температура должна оставаться постоянной, иначе это может привести к смене фокуса в течение длительного раза приобретения. Мощность лазера должна быть стабильной для последовательного выходной мощности.
- Синхронизация лазер с камерой:
- Поиск по области в тарелку, не содержит клетки (с использованием DIC).
- Используйте тот же канал света, который будет использоваться для экспериментов. Здесь мы используем 491 нм с лазером для канала YFP.
- Точка лазерного середине изображения.
- Используйте кнопку синхронизации (при условии, макро).
- Попробуйте различные места в области, чтобы убедиться, что лазер и камера синхронизированы.
- Выбрать хороший клетка кандидатом на эксперимент. Хотя мы работаем со стабильной клеточных линий, мы находим, что не все клетки имеют сходные уровни экспрессии. Хорошими кандидатами будут клетки, что: а) имеют ясный YFP-MS2 с метками транскрипции сайт выше диффузного YFP-MS2 фона, и б) иметь достаточно свободного YFP-MS2 белка в клетке так, чтобы иметь возможность восстановить полностью после фотообесцвечивания (пример на рисунке 1В - сравнить две клетки, левая ячейка не является хорошим кандидатом для отбеливания).
- Выберите соответствующие условия измерения. FRAP процедура требует приобретения многих изображений, и поэтому важно, чтобы балансировать между разумное время экспозиции и используя в качестве низком освещении насколько это возможно. Высокий уровень освещенности может повлиять на ячейки за счет фототоксичности, и вызовет фотообесцвечивания. Рекомендуется держать визуализации параметров постоянной между различными экспериментами.
Клетки отображается в канале с YFP 150 раз мс экспозиции, а в канале CFP для обнаружения CFP-LacI (геномной локус). После CFP-LacI меткой локуса позволяет обнаружить ген, даже если YFP-MS2 мРНК сигнал photobleached (опционально). Для каждого приобретения, 7 Z-ломтики каждые 350 нм. Активный центр транскрипция беленой использованием 491 нм лазер. - Выполнить полный эксперимент, но без отбеливания. FRAP эксперимент измеряет время, которое требуется для транскрипции сайта вернуться в устойчивое состояние. Во-первых, мы хотим убедиться, что активный центр транскрипции функциональной и стабильной в стационарном состоянии. Таким образом, мы выполняем полный опыт FRAP но без отбеливания, чтобы измерять интенсивность транскрипции сайта не меняется в течение срока эксперимента. Мы используем этот эксперимент, чтобы также проверить наши условия изображений путем измерения общего фотообесцвечивания вызванных полной серии изображений. Как правило, полный photobleach фильм не должен превышать 30% от начальной интенсивности. Это может быть измерена с помощью отношения интенсивностей же месте в ядро, из последнего изображения, деленной на первое изображение (коэффициент должен быть больше 0,7).
- FRAP: YFP-MS2 сигнала в активном центре транскрипция беленой использованием 491 нм лазер. 6 предварительно отбеливателя изображения приобрели. После отбеливания изображений, приобретенных в последовательность из 3 частот: 15 изображений каждые 3 секунды, 15 изображений каждые 6 сек, а 26 (или 45 для длительных экспериментов) изображения каждые 30 сек. Изменения в частоте приобретения изображений позволяет получить больше изображений во времена, которые показывают наибольшую интенсивность изменения (начальное восстановление), и меньше изображения к концу, когда изменения в сигнал менее заметным.
Примечания: Этот эксперимент отличается от "обычной" FRAP в том, что:
* FRAP мРНК в транскрипции сайт меры связывание YFP-MS2 белков зарождающейся мРНК, тогда как типичные эксперименты FRAP измерения подвижности различных белков в клетке. Таким образом, нет никакого интереса измерения диффузионной пул YFP-MS2 белков. Когда время между отбеливания и впервые приобрел имидж относительно долго, можно не принимать во внимание эту диффундирующих пул свободных YFP-MS2 белков.
* Так как восстановление YFP-MS2 сигнал относительно длинный (15-30 мин), важно держать транскрипции сайта в фокусе. Именно поэтому серия Z-ломтики приобретается в каждый момент времени.
3. Нормализация FRAP данных:
4D FRAP данные анализируются с помощью бесплатного программного обеспечения для анализа изображений ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Ниже приводится анализ, проведенный с помощью макросов доступны через программное обеспечение ImageJ, но, конечно, самостоятельно написанный макросы могут быть получены.
- Z-стеки максимально прогнозируется на уровне каждой временной точке, в результате 2D фильм в течение долгого времени для дальнейшего анализа.
- Транскрипции сайта отслеживается в каждом кадре и средняя интенсивность измеряется с помощью инструмента пятна Tracker. 11 данные сохраняются в листе Excel для дальнейшего анализа.
- Для каждой временной точке, средней интенсивности в других регионах, представляющих интерес (ROI) измеряется следующим образом (с использованием анализатора временных рядов плагин из ImageJ): а) назадземля взята из ROI вне клетки = B (T). б) окупаемость инвестиций в нуклеоплазме, но, насколько это возможно, от отбеливателя сайта = С (т). в) транскрипции сайта = S (T) (измеряемый месте трекера).
- Правильные данные для фотообесцвечивания, причиненный при визуализации: вычитание фона от всех других измерений и затем исправить отбеливателя. SC (T) является исправлены интенсивность транскрипции сайт в момент времени t.
экв. 1: 
- Нормализация данных: сначала вычислить среднее заранее отбеливателя образов, которая показывает интенсивность транскрипции сайта в стационарном состоянии (= <Sc (pre-bleach)>).
Тогда нормализовать данные:
экв. 2 
Данные нормированы по крайней мере 10 экспериментов. Вычисление среднего экспериментов и стандартного отклонения (STD) по ошибке-бары на каждом временной точке (рис. 1в).
Примечания:
Диффузии YFP-MS2 белка во время FRAP анализа было проигнорировано с скоростью диффузии свободных нуклеоплазме YFP-MS2 очень быстро, в то время как связаны YFP-MS2 связано с высоким сродством к мРНК, и не прикрепить к транскрипции сайт. Вот почему первое изображение после отбеливания должны быть удалены перед анализом.
4. Анализ данных с помощью математической модели:
Для того, чтобы получить кинетических параметров от этого вида набора данных, мы использовали простейший описанной модели, которые могут поместиться такого рода данных. Полное описание этой конкретной модели можно прочитать здесь 5. Модель содержит следующие уравнения, описывающие схему на рисунке 2A:
Имея параметры модели, можно рассчитать удлинение курса:
Мы проанализировали кривую с использованием Беркли Мадонна ( http://www.berkeleymadonna.com ), а ранее смоделированные 5, но другие варианты (MatLab, виртуальный сотовый, COPASI и т.д.). Данные подходят к модели и констант скоростей были извлечены. Мы придаем код в Беркли Мадонны. Для того, чтобы наилучшим образом удовлетворить данных мы рассчитали устойчивом состоянии, а затем подходят нормированные экспериментальные данные нормализованной модели.
5. Представитель Результаты:
Мы photobleached меченых мРНК сигнала в активном центре транскрипции использованием мощных лазерных и последовали за восстановление YFP-MS2-сигнала с течением времени. Флуоресцентного сигнала в транскрипции Сайт состоит из устойчивой кинетики состояние мРНК обобщения, а также мРНК освобождается от сайта. Измерение интенсивности транскрипции сайта в течение долгого времени без отбеливания дает "постоянный" сигнал (рис. 1С, красные точки), который подразумевает, что этот ген настоящее время находится в относительной устойчивом состоянии. Это означает, что сигнал, который накапливается на вновь транскрипции мРНК равно сигнал, листьев, если мРНК освобождается от транскрипции сайта. Когда photobleached, эта система продолжает в своем стационарном, но теперь можно измерить время, которое требуется для восстановления сигнала. Таким образом, восстановление флуоресценции во многом зависит от удлинения свойства полимеразы. 3D-системы FRAP позволило приобретение полном 3D объем ядра во время восстановления FRAP, и тем самым сигнал не был потерян во время экспериментов. Для расчета кинетических параметров из данных, нормированная кривая была установлена на кинетической модели, описывающей относительное удлинение, то есть на основе дифференциальных уравнений. 5 преимуществом использования простой модели, ОДУ, что он может быть пригодным лишь небольшое число параметров . Начальном этапе модель (точка входа) является удлинение, а именно процесс, ответственный за синтез новых MS2-сайты связывания. Конце этапа (точка выхода) является мРНК выпуска в нуклеоплазмы. Модель основана на восстановление кривые, которые состоят из двух кинетически решен компонентов, одной быстрой и одной медленной. Быстрый компонент относится к удлинению, в то время как медленный компонент был смоделирован как полимеразная паузы во время удлинения. Двух государств полимеразы были смоделированы как удлинение при стохастической переход к паузы. Мы оптимизировали дифференциальных уравнений от этой модели, которая дала удлинение скоростью 3,3 кб / минута с стохастического переход к более медленной скорости синтеза (останавливаясь на суммарное время на 2,5 минуты). Моделирование показало, тхат этот переход от удлинение паузы пострадавших только 11% полимераз, которые вступили удлинения.
| К из | 0,0112 | |
| К pause_in | 0,0015 | |
| К pause_out | 0,0067 | |
| Удлинение времени | (К + к из pause_out) -1 | 56 сек |
| Время паузы | (К pause_out) -1 | 2,5 минуты |
| Пауза вероятности | (К pause_in) / (K + к pause_in выход) | 11% |
Таблица 1. Результатов моделирования в таблице параметров.
Рисунок 1. (А) экспериментальной системы ячейка используется для следующих экспрессии генов в живом организме. Схематическое изображение CFP-актин генной конструкции. 5'-конец содержит серию из 256 повторяет Laco, которые связаны RFP-LacI (красный) и знак сайте гена интеграции. Индукции транскрипции с минимальным промотором CMV достигается за счет связывания транскрипционного обратном тетрациклин активатора (rtTA или Тет-On), чтобы реагировать Тет-элементы (TRES) в присутствии парадокс. Транскрипции мРНК содержит последовательность, кодирующую CFP-β-актина, и 24 MS2 повторяет, что связаны YFP-MS2 слитого белка. На 3'-конце, часть кролика β-глобина экзон-интрон-экзон модуль сопровождается расщепления поли-сигнала. Схема описывает также удлинение анализ показывает флуоресцентные белки MS2 (желтый), подключенных к новой транскрипции мРНК транскрибируется РНК-Pol II. (B) активного центра транскрипции (YFP-MS2, правая ячейка рука) photobleached и восстановления флуоресценции был записан с течением времени (кадры на дне). Мы измерили интенсивность флуоресценции как отбеливатель (средняя линия) и небеленый (нижняя строка) активных центров транскрипции. Обратите внимание на левую ячейку не подходит для фотообесцвечивания эксперимента. (С) экспериментальных измерений, выполненных на CFP-актин сайтов транскрипции генов. В синей кривой восстановления YFP-MS2 измерения FRAP. В красный, небеленый клетки от того же эксперимента показывает YFP-MS2 сигнала на транскрипцию сайта в стационарном состоянии.
Рисунок 2. () Схема модели, описывающей входа и выхода кинетики мРНК, отмеченные YFP-MS2 молекул при транскрипции сайта. (B) YFP-MS2 FRAP данных и оснащен моделирования (в среднем десять экспериментов была установлена на модель) . Рассчитанных остатков подходят представлены в нижней части.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод измерения кинетической полимеразной активности в живых клетках может быть разделена на две части. Первая часть описывает «влажным» процедура, которая дает возможность измерения и извлечения из кинетических данных транскрипции мРНК, тогда как во второй части, данные анализировались с помощью модели ОДУ. 5 Ряд исследований в настоящее время использовать этот подход для извлечения транскрипции кинетики в живых клетках, 5, 6, 8, 12-14. Основное различие между этими исследований был способ восстановления кривой FRAP был преобразован в кинетических параметров. Во многих случаях математическая модель используется. Модель должна описывать биологический процесс, в простой форме, и затем сравнивается с FRAP данных. Раз есть хорошая корреляция между данными и моделью, надо проверить модель дополнительных биологических экспериментов, таких как измерение эффекты препарата или сравнение между разными генами.
Можно взять выше анализ дальнейшего получения дополнительной кинетической результаты. Например, с помощью фотоактивируемых форме MS2 флуоресцентный белок можно photoactivate уже сформирована стенограммы мРНК и следить за их освобождение (= уменьшение интенсивности против восстановления сигнала измеряется FRAP) с транскрипцией сайта. 5 Кроме того, в то время как FRAP из MS2 меткой мРНК кинетики меры удлинение только FRAP из GFP-РНК Pol II в транскрипции сайт дает кинетики целом транскрипционных процесса, а именно, предварительно инициации, посвящения, удлинение и прекращение 5, 13, 15, 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
YS-T поддерживает Европейский исследовательский совет (ERC), Израиль Science Foundation (ISF) (250/06), ХОЯТ-бикура, Израиль онкологический научный фонд (ICRF), германо-израильского фонда научных исследований и развития (GIF ), США-Израиль Двусторонней научный фонд (ЧФ), германо-израильского проекта сотрудничества (DIP), а также израильским министерствами науки и здравоохранения, и Джейн Стерн Lebell семьи научный сотрудник в области наук о жизни в университете Бар-Илан. YB благодарит Фонд Азриэли для присуждения стипендии Азриэли.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | ||
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche Group |
References
- Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
- Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
- Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
- Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
- Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
- Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
- Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
- Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
- Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
- Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
- Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
- Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
- Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
- Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
- Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
