Att mäta kinetiken av mRNA-transkription i enskilda levande celler

Summary

RNA-polymeras II transkriptionell kinetik mäts på specifika gener i levande celler. mRNA transkriberas från genen av intresse är fluorescerande taggade och med hjälp av fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) in vivo kinetiken av transkriptionell töjning erhålls.

Abstract

Den transkriptionell aktiviteten av RNA-polymeras II (Pol II) är en dynamisk process och därför mäta kinetiken av transkriptionell process in vivo är av betydelse. Pol II kinetik har mätts med hjälp av biokemiska och molekylära metoder. ^1-3 Under de senaste åren med utveckling av nya visualiseringsmetoder, har det blivit möjligt att följa transkription som det sker i realtid i enskilda levande celler. ⁴ Häri beskriver vi hur att utföra analyser av Pol II töjning kinetik på en specifik gen i levande celler. ^{5, 6} Använda en cellinje där en specifik gen lokus (DNA), dess mRNA produkt, och den slutliga proteinprodukter kan fluorescerande och visualiseras in vivo är det möjligt att upptäcka den verkliga transkriptionen av mRNA för genen av intresse. ^{7, 8} mRNA fluorescerande är taggade med MS2 systemet för märkning mRNA in vivo, där 3'UTR av mRNA transkript innehåller 24 MS2 stam-loop upprepar, som ger mycket specifika bindningsställen för YFP-MS2 päls protein som etiketter mRNA som det är transkriberas. ⁹ För att övervaka kinetik transkriptionen vi använder fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP)-metoden. Genom fotoblekning den YFP-MS2-märkta gryende avskrifter på platsen för transkription och sedan följa återvinning av denna signal över tiden, vi får syntesen graden av de nygjorda mRNA. ⁵ Med andra ord speglar YFP-MS2 fluorescens återhämtning generering av nya MS2 Stem-loopar i den framväxande avskrifter och deras bindande genom fluorescerande gratis YFP-MS2 molekyler kommer in från de omgivande nucleoplasm. Den FRAP återhämtning kurvorna analyseras sedan med hjälp av matematiska mekanistiska modeller formaliseras genom en serie av differentialekvationer, för att hämta den kinetiska tidsparametrar för transkription.

Protocol

Cellen system som används måste innehålla ett integrerat gen konstruktion som inkluderar MS2 upprepa sekvenser för taggning mRNA i levande celler. I detta protokoll använder vi ett mänskligt U2OS cellinje hyser ett stabilt integrerad β-aktin-genen, som fluorescerande märks på DNA, RNA och proteinnivåer ⁸ enligt följande (Figur 1A): Den 5 "av genen innehåller lac operatör ( Laco) upprepar - dessa används för att märka gen (DNA) och därmed identifiera de genomiska locus av integration. En fluorescerande taggade lac repressor protein (Laci) kommer att binda till Laco upprepar och tagga DNA. Det mRNA är taggade med YFP-MS2 proteiner som binder till MS2 upprepas (STEM-bågar). Genen Produkten är CFP-aktin och därför induktion av genen kommer att resultera i uppkomsten av GFP taggade-aktin cytoskelettet. Genen konstruera är transfekterade i en U2OS Tet-On stabil cellinje och dess uttryck är under Tet transkriptionell kontroll.

1. Cell plätering och transfektion:

1. 48 timmar före mätningarna, utsäde ~ 2 * 10 ⁵ celler på glas bottnat rätter vävnadsodling (35 mm petriskålar med en 14 mm glas botten brunn (0,16 till 0,19 mm tjocklek,. Cat No P35G-1.5-14-C , Mattek, Ashland, MA)). Tillsätt 2 ml av medium till cellerna, för att nå 50-80% sammanflödet.
2. 24 timmar före försöket, tillfälligt transfektera cellerna med konstruktioner som uttrycker fluorescerande markörer för märkning av DNA och mRNA. Använd FuGENE6 transfektion reagens (Roche).
   Den använda konstruktioner:
   1. YFP-MS2-nls kommer att märka MS2 Stem-loopar i mRNA transkript. Den nukleära lokalisering sekvens (LMV) ger den nukleära posten sekvensen för YFP-MS2 protein.
   2. tillval - GFP-Laci eller RFP-Laci som kommer att binda Laco upprepas i 5 "av genen och kommer att märka genen locus. Märka genen locus hjälper till att spåra genen under FRAP experiment men är inte nödvändigt.
3. Inkubera cellerna i minst 12 timmar, att få bra uttryck av övergående transfekterade proteiner (se not).
4. 6 - 12 timmar före försöket lägga till 1,5 mikrogram / ml doxycyklin (Sigma) till cellerna för aktivering av Tet-inducerbara GFP-aktin-genen.

Anmärkningar:
* Det är viktigt att inte nå mycket höga uttryck nivåer av transfekterade proteiner för att inte dölja den signal som erhålls specifikt från transkriptionen webbplatsen, relativt till bakgrunden signalen. Nivåer av uttryck kan styras av: a) justera tiden mellan transfektion och experimentet, b) att ändra styrkan av promotor (t.ex. CMV är starkare än L30 promotor), c) att lägga till en kärnteknisk export signal (NES) till YFP-MS2-nls protein som hjälper distribuera YFP signalen i hela cellen.

* Den fluoroforen används för mätningarna bör helst photostable hela långa förvärv, därför grön / gul avger fluoroforer är bättre än röda fluoroforer. Information om olika fluoroforer finns i ref ^10.

* Bestäm att de olika ljus-kanalerna inte genomblödning till varandra. Använd bilder som innehåller prover märkta med var och en av markörerna separat åtgärd i varje bild intensiteten i båda kanalerna, och sedan beräkna genomblödning.

2. FRAP:

Experimentet kan utföras på ett mikroskop som klarar av både att hämta bilder och utför fotoblekning med en laserstråle. Normalt är FRAP experiment utförs med en konfokala laserskanning mikroskop (CLSM). Men eftersom i vårt fall experimentet är relativt lång (15-30 min), och vi följer en liten lokus inuti kärnan, är det viktigt att kunna hålla den gen locus / transkription plats i fokus under hela experimentet. Detta kräver en snabb bildbehandling i tre dimensioner över tiden (4D), och sådana förvärv priser är svårt att få hjälp av en scanning konfokalmikroskop. Därför använder vi ett 3D-FRAP system (ljustekniska) bygger på ett brett fält Olympus IX81 mikroskop (63x Plan-Apo, 1,4 NA) utrustad med ett EM-CCD (Quant-EM, Roper) som kan få bilder i hög hastighet (upp till 30 bilder / sek). Systemet har 405 nm och 491 nm lasrar som kan synkroniseras med kameran för att fotoblekning på en specifik region av intresse (ROI) av provet. Mikroskopet är utrustat med en Lambda GD-4 ljuskälla (Sutter) och en XY & Z skede (före) som tillåter snabb och exakt avbildning i Z-axeln. All utrustning är integrerade och styrs av metamorfa (Molecular Devices). Den live-cell experiment utförs vid 37 ° C med 5% CO ₂ med hjälp av ett live-cell kammare systemet (Tokai).

1. Procedur: En halvtimme före försöket, slå på uppvärmningsanordning, mikroskop och laser. Under erfarenning av temperaturen måste vara konstant, annars kan orsaka fokus förändringar under de långa hämtningstider. Lasereffekt måste vara stabilt för konsekvent effekt.
2. Synkronisera lasern med kameran:
   1. Sök efter ett område i plattan som inte innehåller celler (med DIC).
   2. Använd samma ljus kanal som kommer att användas för experiment. Här använder vi 491 nm laser för YFP kanalen.
   3. Rikta lasern till mitten av bilden.
   4. Använd synkronisera knappen (förutsatt makro).
   5. Prova olika platser i området för att se till att lasern och kameran är synkroniserade.
3. Välj en bra kandidat cell för experimentet. Även om vi arbetar med stabila cellinjer, finner vi att inte alla celler har liknande uttryck nivåer. Bra kandidater skulle celler som: a) uppvisar en tydlig YFP-MS2-märkta transkription plats ovanför diffusa YFP-MS2 bakgrund, och b) har tillräckligt med ledigt YFP-MS2 protein i cellen, så att kunna bli helt återställd efter fotoblekning (exempel i figur 1B - jämför de två cellerna, den vänstra cellen inte är en bra kandidat för blekning).
4. Välj lämpliga mätförhållanden. Det FRAP förfarande kräver förvärvande av många bilder, och därför är det viktigt att balansera mellan rimliga exponering gånger och med så svagt ljus som möjligt. Höga ljusnivåer kan påverka cellen på grund av fototoxicitet, och kommer att orsaka fotoblekning. Det rekommenderas att hålla bildbehandling parametrar konstant mellan olika experiment.
   Celler är avbildade i YFP kanalen med 150 msek exponeringstider, och i den gemensamma fiskeripolitiken kanal för detektion av GFP-Laci (genomisk locus). Efter den gemensamma fiskeripolitiken, Laci taggade lokus möjliggör upptäckten av genen även när YFP-MS2 mRNA-signalen är photobleached (tillval). För varje förvärv, Z-skivor 7 tas varje 350 nm. Den aktiva transkription webbplatsen bleks med 491 nm laser.
5. Utför hela försöket men utan blekning. Den FRAP Experimentet mäter tiden det tar för transkription platsen att återvända till steady-state. Först vill vi att kontrollera att den aktiva transkriptionen platsen är funktionell och stabil vid steady state. Därför genomför vi en komplett FRAP experiment, men utan blekning för att säkerställa att den uppmätta intensiteten i transkriptionen webbplatsen inte ändras under försöket tid. Vi använder det här experimentet att också testa vår avbildning villkor genom att mäta den totala fotoblekning orsakas av fulla imaging-serien. Som en tumregel bör hela filmen photobleach vara högst 30% av den ursprungliga intensiteten. Detta kan mätas med hjälp av intensiteten förhållandet samma plats i kärnan från den sista bilden, dividerat med första bilden (förhållandet skall vara större än 0,7).
6. FRAP: Den YFP-MS2 signal på den aktiva transkription webbplatsen bleks med 491 nm laser. 6 före blekmedel bilder förvärvas. Post-blekmedel bilder förvärvas i en sekvens av tre tiden frekvenser: 15 bilder varje 3 sek, 15 bilder var 6 sekunder och 26 (eller 45 för långa experiment) bilder varje 30 sek. De förändringar i frekvens för att hämta bilder gör det möjligt att skaffa fler bilder under de tider som visar den högsta intensitet förändras (inledande återhämtning) och mindre bilder mot slutet när förändringarna i signalen är mindre framträdande.

Anteckningar: Detta experiment skiljer sig från "vanliga" FRAP i att:
* FRAP av mRNA vid transkriptionen platsen åtgärder bindningen av YFP-MS2 proteiner till den framväxande mRNA, medan typiska FRAP experiment mäta rörligheten för olika proteiner i cellen. Därför finns det inget intresse av att mäta diffusiv pool av YFP-MS2 proteiner. När tiden mellan blekning och den första förvärvade bilden är relativt lång det är möjligt att bortse från denna sprida pool av fria YFP-MS2 proteiner.

* Sedan återhämtning YFP-MS2-signalen är relativt lång (15-30 min), är det viktigt att hålla transkriptionen platsen i fokus. Därför är en serie av Z-skivor förvärvas vid varje tidpunkt.

3. Normalisering av FRAP data:

4D FRAP data analyseras med hjälp av gratis bildanalysprogram ImageJ (NIH, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Nedan följer analys med makron tillgängliga via ImageJ mjukvaran, men självklart själv skrivit makron kan genereras.

1. Z-stackar är maximala projiceras vid varje tid-punkten, vilket resulterar i en 2D-film över tid för vidare analys.
2. Transkriptionen webbplats spåras i varje bildruta och den genomsnittliga intensiteten mäts med hjälp av verktyget Spot Tracker. ¹¹ Uppgifterna sparas i ett Excel-ark för vidare analys.
3. För varje gång-punkt, är den genomsnittliga intensiteten på andra områden av intresse (ROI) mätt på följande sätt (med hjälp av Analyzer Time Series plug-in för ImageJ): a) tillbakamarken är tagen från en ROI utanför cellen = B (t). b) En ROI i nucleoplasm, men så långt som möjligt från blekmedel plats = C (t). c) transkriptionen plats = S (t) (mätt med plats tracker).
4. Korrekta uppgifter för fotoblekning orsakade under avbildning: Subtrahera bakgrund från alla andra mätningar och sedan korrigera blekmedel. Sc (t) är den korrigerade intensiteten i transkriptionen plats vid tiden t.

ekv. 1:

5. Normalisera data: först beräkna genomsnittet av de före bleka bilder, som visar intensiteten i transkriptionen plats vid steady-state (= <Sc _{(pre-bleach)>).}

Sedan normalisera data:

ekv. 2

Uppgifterna är normaliserade för minst 10 experiment. Beräkna medelvärdet av experiment och standardavvikelsen (STD) för fel barer vid varje tid-punkten (Figur 1C).

Anmärkningar:
Spridningen av YFP-MS2 protein under FRAP analys bortses eftersom spridningen i fritt nucleoplasmic YFP-MS2 är mycket snabb, medan den bundna YFP-MS2 är förknippad med hög affinitet till mRNA, och inte återansluta till transkriptionen webbplats. Det är därför den första bilden efter blekning bör tas bort före analys.

4. Analysera data med hjälp av en matematisk modell:

För att hämta kinetiska parametrar från denna typ av data som vi använt den enklaste beskrivningen modell som kan passa denna typ av data. Hela förklaringen till denna modell kan läsas här ^5. Modellen innehåller följande ekvationer som beskriver systemet i figur 2A:

Att ha modellparametrar är det möjligt att beräkna töjning rate:

Vi analyserade kurva med Berkeley Madonna ( http://www.berkeleymadonna.com ), som tidigare modellerade ^5, men andra alternativ finns tillgängliga (MatLab, Virtual Cell, COPASI etc.). Uppgifterna var lämpad att modellen och hastighetskonstanterna utvanns. Vi lägger koden i Berkeley Madonna. För att bäst passa de data vi beräknat steady state och montera sedan den normaliserade experimentella data till det normaliserade modell.

5. Representativa resultat:

Vi photobleached märkt mRNA-signalen på aktiva transkriptionen webbplats med hög laser makt, och följde återhämtning YFP-MS2-signal över tiden. Den fluorescerande signal vid transkriptionen platsen består av steady-state kinetiken för mRNA-syntes samt mRNA frigörs från platsen. Mätning av intensitet transkription plats med tiden utan blekning ger en "konstant" signal (figur 1C, de röda prickarna) vilket innebär att denna gen är för närvarande i ett relativt steady state. Det innebär att den signal som samlas på den nyligen transkriberade mRNA är lika med den signal som lämnar efter sig när en mRNA frigörs från transkriptionen platsen. När photobleached fortsätter detta system i sitt steady state, men är nu möjligt att mäta den tid det tar för signalen att återhämta sig. Därför beror återvinning av fluorescens oftast på töjning egenskaper polymeras. 3D-FRAP systemet tillåts förvärv av den fullständiga 3D-nukleära volymen under FRAP återhämtning, och därmed ingen signal förlorades under experimenten. För beräkning av den kinetiska parametrar från data, var den normaliserade kurvan monteras på kinetiska modell som beskriver töjning, som bygger på differentialekvationer. ⁵ Fördelen med att använda en enkel ODE modell är att den kan passa till endast ett fåtal parametrar . Det första steget i modellen (ingång) är töjning, det vill säga den process som ansvarar för att syntetisera ny MS2-bindningsställen. Slutet steg (utgång) är mRNA utsläpp i nucleoplasm. Modellen bygger på återvinningen kurvor, som består av två kinetiskt lösas komponenter, en snabb och en långsammare. Den snabba komponenten avser töjning, medan den långsammare komponenten modelleras som polymeras paus under töjning. De två polymeras staterna modelleras som töjning med en stokastisk övergång till paus. Vi optimerat differentialekvationer från denna modell, som gav en förlängning hastighet av 3,3 kbit / minut med en stokastisk övergång till en långsammare syntes takt (pausa under en ackumulerad tid 2,5 minuter). Modellering visade that denna övergång från töjning för att pausa påverkas endast 11% av polymeraser som trädde töjning.

K ut	0,0112
K pause_in	0,0015
K pause_out	0,0067
Förlängning tid	(K ut + K pause_out) -1	56 sek
Paustid	(K pause_out) -1	2,5 minuter
Paus sannolikhet	(K pause_in) / (K pause_in + k ut)	11%

Tabell 1. Modellen ger en parameter tabell.

Figur 1. (A) Den experimentella cellsystem som används för följande genuttryck in vivo. Schematisk bild av den gemensamma fiskeripolitiken-aktin genen konstruktion. Den 5'-änden innehåller en serie 256 Laco upprepar som är bundna av RFP-Laci (röd) och markerar platsen där genen integration. Transkriptionell induktion från den minimala CMV promotor uppnås genom bindning av omvänd tetracyklin transkriptionell aktivator (rtTA eller Tet-On) till Tet-lyhörda element (TRES) i närvaro av DOX. Den transkriberade mRNA innehåller kodande sekvensen för GFP-β-aktin och 24 MS2 upprepar som är bundna av YFP-MS2 fusionsprotein. I 3'-änden, är en del av en kanin β-globin exon-intron-exon modul följt av en klyvning-Polya signal. I programmet beskrivs också de töjning analysen visar fluorescerande MS2 proteiner (gul) bifogas den nyligen transkriberade mRNA transkriberas av RNA Pol II. (B) ett verksamt transkription plats (YFP-MS2, högra cellen) var photobleached och fluorescens återhämtning spårades över tiden (ramar på botten). Vi mätte fluorescensintensiteten av både blekmedel (mitten raden) och icke-blekt (nedre raden) aktiva transkription webbplatser. Notera den vänstra cellen är inte lämplig för en fotoblekning experiment. (C) Den experimentella mätningar som utförs på den gemensamma fiskeripolitiken-aktin webbplatser gentranskription. I blått återhämtningen kurvorna i YFP-MS2 FRAP mätningar. I rött, en icke-blekt cell från samma experiment som visar YFP-MS2 signal vid transkriptionen plats vid steady state.

Figur 2. (A) ordning för den modell som beskriver in-och utgång kinetik av mRNA markerade med YFP-MS2 molekyler vid transkription webbplatsen. (B) YFP-MS2 FRAP data och monterade simulering (medeltal av tio försök var monterade på modellen) . Den beräknade rester av passformen presenteras längst ner.

Discussion

Metoden för mätning av polymeras kinetisk aktiviteten i levande celler kan delas in i två delar. Den första delen beskriver den "våta" förfarande som gör det möjligt att mäta och hämta den kinetiska data av mRNA transkriptionen, medan den andra delen är data analyseras med en ODE-modellen. ⁵ Ett antal studier har nu utnyttjat denna metod för att extrahera transkription kinetik i levande celler ^{5, 6, 8, 12-14.} Den stora skillnaden mellan dessa studier var hur FRAP återhämtningen kurvan omvandlades till rörelseenergi parametrar. I många fall en matematisk modell används. En modell bör beskriva den biologiska processen på ett enkelt sätt och då är det jämfört med FRAP data. När det finns en god korrelation mellan data och modell bör man verifiera modellen genom nya biologiska experiment som mätningar av läkemedelseffekter eller jämföra mellan olika gener.

Det är möjligt att ta ovanstående analys ytterligare för att få ytterligare kinetiska resultat. Till exempel genom att använda en photoactivatable form av MS2 fluorescerande proteinet är det möjligt att photoactivate redan genererat mRNA transkript och följa deras frigivning (= minska i intensitet jämfört med återvinning av signalen mätt FRAP) från transkriptionen sajten. ⁵ Dessutom, medan FRAP av MS2 taggade mRNA åtgärder töjning kinetik endast ger FRAP av GFP-RNA Pol II på transkriptionen platsen kinetiken av hela transkriptionell processen, nämligen pre-initiering, initiering, förlängning och uppsägning ^{5, 13, 15, 16.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline	Sigma-Aldrich
FuGENE 6 transfection reagent	Roche Group