Summary
在活细胞中的特定基因上RNA聚合酶II转录的动力学测量。感兴趣的基因转录的mRNA荧光标记，并使用荧光漂白后（FRAP）在体内转录伸长动力学得到恢复。
Abstract
RNA聚合酶II（聚合酶II）的转录活性，是一个动态的过程， 因此测量在体内的转录过程中的动力学的重要性。聚合酶II动力学测量，利用生化或分子生物学方法。1-3近年来发展的新的可视化方法，它已成为可以遵循的转录发生在单个活细胞的实时4此中，我们介绍了如何执行在活细胞中特定基因的聚合酶II伸长动力学分析，5，6使用的细胞系，其中荧光标记一个特定的基因位点（DNA）的，其mRNA的产品，和最终的蛋白产物可在体内观察，它可以检测到感兴趣的基因转录的mRNA的实际，7，8的mRNA荧光标记使用标记的mRNA在体内，mRNA转录的3'UTR含有24 MS2的茎环MS2的系统重复，提供YFP - MS2外壳蛋白标签的mRNA转录的高度特异性结合位点（ 九 ）监测转录的动力学我们使用漂白（FRAP）方法后，荧光恢复。通过在转录现场漂白新生成绩单YFP - MS2的标签，然后按照这种信号随时间的恢复，我们取得新的mRNA的合成率。，换句话说，YFP - MS2的荧光恢复，反映了一代人新的MS2在新生的成绩单和荧光自由YFP - MS2的分子，从周围的核质进入其约束力的茎环。 FRAP恢复曲线，然后使用一系列微分方程的数学机械化形式化的模型，以检索转录的动力学参数进行分析。
Protocol
所使用的电池系统必须包含一个集成的基因构造，包括MS2的重复序列标记在活细胞中的mRNA。在这个协议中，我们使用人类U2OS细胞株窝藏一个稳定的集成β-肌动蛋白基因，荧光标记的DNA，RNA和蛋白水平8，如下（图1A）：该基因的5'包含lac操纵子（ 法律咨询及田土转易处）重复-这是用来标记基因（DNA），从而确定基因组位点的整合。一个荧光标记的lac阻遏蛋白（LACI）将绑定到法律咨询及田土转易处重复和标记的DNA 。 YFP - MS2的蛋白质结合到MS2的重复（茎环）标签的mRNA。该基因的产物是CFP -肌动蛋白，因此诱导的基因会导致CFP -标记的肌动蛋白细胞骨架的外观。是转基因构建成一个U2OS四面体的稳定细胞系和其表达的是春节的转录控制下。
1。的细胞电镀和转染：
- 测量前48小时，种子1〜2 × 10 5细胞在玻璃见底组织培养皿（35毫米培养皿菜与一个14毫米的玻璃底微孔（厚度为0.16-0.19毫米;猫号P35G - 1.5 - 14 - C MatTek，阿什兰，马萨诸塞州））。添加中等2毫升细胞，以达到50-80％汇合。
- 实验前24小时，瞬时转染的细胞结构，表达的荧光标记物标记的DNA和mRNA的。使用FuGENE6转染试剂（Roche公司）。
所用的构造：- YFP - MS2，免入息审查贷款计划将标签中的mRNA转录MS2的茎环。 YFP - MS2蛋白的核定位序列（NLS）的提供核项目序列。
- 可选 - CFP - LACI或RFP - LACI将绑定在5个基因的“LACO重复，将标签的基因位点。在追踪期间FRAP实验的基因标记基因位点助攻，但是没有必要的。
- 孵育至少12小时的细胞，获得良好的瞬态转蛋白（见注）的表达。
- 6 - 12小时的实验前增加1.5微克/毫升强力霉素（Sigma公司）春节诱导CFP -肌动蛋白基因的激活细胞。
注：
*重要的是没有达到很高的转染蛋白的表达水平，以免掩盖获得相对背景信号转录的网站，特别是信号。表达水平可以控制：a）调整之间的转染和实验的时间; b）改变启动子的强度（如巨细胞病毒是比L30发起人强）; C）加入核出口信号（NES） YFP - MS2，免入息审查贷款计划的蛋白质，这将有助于散布在整个细胞YFP的信号。
*用于测量荧光最好耐光整个长收购，因此，绿色/黄色发光的荧光团比红色荧光团。不同的荧光团的资料，可以发现文献10。
*确定不同的光渠道不流血通过彼此。使用含有与每个单独的标记标记标本幻灯片，每张幻灯片测量两个通道的强度，然后计算渗出。
2。 FRAP：
任何能够获取图像和执行漂白用激光束显微镜，可以进行实验。通常情况下，FRAP实验用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）。然而，因为在我们的例子的实验是比较长（15-30分钟），和我们下面的细胞核内的一个小的轨迹，重要的是能够保持焦点在整个实验的基因位点/转录网站。这就要求在3个维度（4D）随着时间的推移快速成像，例如采集速率是很难获得使用扫描共聚焦显微镜。因此，我们使用一个3D - FRAP还原系统（Photometrics）建立一个宽领域的奥林巴斯IX81显微镜配备EM - CCD（QUANT - EM，罗珀）（63X计划APO，1.4 NA），能够获得高速的图像（最多30个图像/秒）。该系统具有405纳米和491纳米激光器，可与摄像头，使样品的特定区域的利益率（ROI）漂白同步。该显微镜是配备了一个lambda DG - 4光源（沙特）和一个XY，Z阶段（前），允许在Z轴的快速，准确的成像。所有的设备集成和MetaMorph（Molecular Devices公司）所控制。在37 ° C，5％CO 2进行活细胞的实验使用的是活细胞室系统（东海）。
- 程序：实验前半小时，打开加热装置，显微镜和激光。的实验期间MENT的温度需要保持不变，否则可能会导致在漫长的采集时间的焦点变化。激光功率必须是稳定的，一致的输出功率。
- 同步与摄像头的激光：
- 搜索中不包含细胞（使用DIC的）的板面积。
- 使用相同的光通道将用于实验所用的。在这里，我们用491 nm激光为YFP的通道。
- 激光点的图像的中间。
- 使用同步“按钮（宏）。
- 尝试在该领域的不同点，以确保激光和摄像机同步。
- 选择一个很好的候选细胞实验。虽然我们与稳定的细胞系工作，我们发现，并非所有的细胞也有类似的表达水平。很好的候选人，将细胞：A）表现出明显的YFP - MS2 -标签弥漫YFP - MS2的背景之上的转录网站，B）有足够的自由YFP - MS2蛋白在细胞内，以便能够完全恢复后，漂白（例如，在图1B - 比较两个单元格的左上角单元格是不是一个很好的候选人进行漂白）。
- 选择合适的测量条件。 FRAP还原过程需要许多图像的获取，因此重要的是要合理的曝光时间，并使用尽可能低的光之间的平衡。高光水平可能会影响细胞因光毒性，并会导致漂白。它是建议保持成像参数不同的实验之间的常数。
细胞成像YFP的通道在150毫秒的曝光时间，在CFP CFP - LACI（基因组位点）的检测通道。 CFP - LACI标签位点，使该基因的检测，即使YFP - MS2 mRNA信号光漂白（可选）。对于每个收购，7 Z型片每350纳米。活跃转录的网站是使用491 nm激光漂白。 - 执行完整的实验，但没有褪色。 FRAP实验措施转录网站需要返回到稳定状态的时间。首先，我们要验证活跃转录的网站是处于稳定状态的功能和稳定。因此，我们执行一个完整的FRAP的实验，但没有漂白，以确保测量强度的转录网站在实验过程中的时间框架不会改变。我们用这个实验中也测试通过测量成像系列所造成的总漂白的成像条件。作为一个经验法则，完整的电影光漂白，不应该超过30％的初始强度。这可以使用在细胞核中的相同点从过去的形象，除以第一张图像（比例应小于0.7较大）的强度比来衡量。
- FRAP：YFP - MS2的信号活跃转录的网站是使用491 nm激光漂白。 6漂白前的图像采集。漂白后的图像采集了3个时间频率序列：每3秒15的图像，每6秒和26（或45长期实验）的图像，每30秒15的图像。在获取图像的频率变化，允许在最高强度的变化（初步复苏），并接近尾声图像信号的变化不太突出时代获得更多图片。
注：这个实验，从“常规”，FRAP不同：
*网站在转录的mRNA的FRAP措施YFP - MS2蛋白新生的mRNA结合，而典型的FRAP实验测量细胞在不同的蛋白质的流动性。因此，有没有兴趣在测量YFP - MS2蛋白扩散池。当漂白和第一次获得的图像之间的时间也比较长，很可能无视这个免费YFP - MS2的蛋白质的扩散池。
YFP - MS2的信号恢复*由于相对较长（15-30分钟），重要的是要保持重点转录网站。这就是为什么在每一个时间点收购一系列的Z -片。
3。正常化的FRAP数据：
4D FRAP数据分析使用免费的图像分析软件ImageJ（国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达; http://rsb.info.nih.gov/ij/ ）。以下是宏通过ImageJ软件进行分析，但自编写的宏，当然可以生成。
- Z轴堆叠最大预计在每一个时间点，随着时间的推移，作进一步的分析2D电影。
- 转录的网站是在每帧跟踪和平均强度测量使用点跟踪工具。11中的数据保存在Excel工作表，作进一步的分析。
- 对于每一个时间点，在其他地区的利息率（ROI）的平均强度测量如下（使用时间序列分析的ImageJ插件）：A）背面地面是从一个细胞= B（T）之外的投资回报率。二）投资回报率在核质，但尽可能远离漂白网站可能= C（T）。 C）转录网站= S（T）（现场跟踪测量）。
- 在成像过程中造成的漂白正确的数据：减去所有其他测量的背景，然后正确的漂白。 SC（T）是纠正在时间t的力度转录网站
式1： 
- 规范化数据：首先计算漂白前的图像，这表明在稳定状态（= <Sc (pre-bleach)>）的转录网站强度平均。
然后正常化的数据：
式2 
至少有10实验数据归。计算实验的平均值和标准差（STD）的，在每一个时间点（图1C）的错误酒吧。
注：
在FRAP分析YFP - MS2蛋白扩散忽视，因为自由nucleoplasmic YFP - MS2的扩散速度非常快，而绑定的YFP - MS2具有高亲和力的mRNA，并没有重新连接到的转录网站。这就是为什么漂白后的第一个形象，应在分析前删除。
4。使用了一个数学模型的数据分析：
为了获取这种数据集的动力学参数，我们用最简单的描述模型，该模型可以适应这种数据。这一特定模式的完整说明，可以读取这里 5 。该模型包含下面的公式描述图2A计划：
模型的参数，它是可以计算的伸长率：
我们分析使用伯克利麦当娜（ http://www.berkeleymadonna.com ）的曲线，如以前为蓝本5，但其他选项可用（MATLAB，虚拟细胞，COPASI等）。数据拟合模型和速率常数分别提取。我们在伯克利分校的麦当娜附加代码。为了以最适合的数据，我们计算了稳定状态，然后适合归归模型的实验数据。
5。代表性的成果：
我们光漂白使用激光功率高的网站在积极转录标记基因的信号，并遵循随着时间的推移YFP - MS2的信号恢复。转录现场的荧光信号由稳态动力学的mRNA的合成，以及从该网站公布的表达。未经漂白转录网站强度随着时间的推移测量，给出了一个“恒”信号（图1C，红点），这意味着，这种基因是目前在一个相对稳定的状态。这意味着，新转录的mRNA积累的信号等于信号，离开时，一个mRNA转录网站发布。当光漂白，这个系统将继续在稳定状态，但现在可以测量它的信号来恢复所需的时间。因此，荧光的恢复主要取决于聚合酶的延伸特性。 3D FRAP系统允许收购的全3D FRAP恢复期间的核体积，实验过程中丢失了，从而没有信号。从数据计算的动力学参数，归一化曲线拟合，基于微分方程的动力学模型描述伸长5使用一个简单的ODE模型的优点是，它可以适合只有少量的参数。该模型的初始步骤（切入点），伸长率，分别负责合成新的MS2的结合位点的过程。最终的步骤（退出点）是mRNA进入核质的释放。该模型的基础上恢复曲线，动力学解决的两个组件组成，一个快速和一个慢。快速的组成部分，是指伸长率，而速度较慢的组件建模聚合酶暂停期间伸长。两个聚合酶状态为蓝本，作为一个随机过渡暂停伸长。我们从这个模型优化的差分方程，取得了3.3 KB /分钟的伸长速度与随机过渡到一个较慢的合成率（累计时间为2.5分钟暂停）。模型表明T暂停受影响的只有11％的聚合酶进入伸长伸长过渡。
| K掉 | 0.0112 | |
| K pause_in | 0.0015 | |
| K pause_out | 0.0067 | |
| 伸长率时间 | （K掉+ K pause_out）-1 | 56秒 |
| 暂停时间 | （K pause_out）-1 | 2.5分钟 |
| 暂停的可能性 | （K pause_in）/（K pause_in + K掉） | 11％ |
表1模型的参数表中的结果。
图1。 （一）实验细胞系统， 用于体内基因表达。 CFP -肌动蛋白基因构建的示意图。 5' -端包含了一系列的256个法律咨询及田土转易处 ，也必然RFP - LACI（红色）和标记基因整合的网站重复。从最小的CMV启动子的转录诱导是通过反向四环素转录激活因子（rtTA或四面体在）的结合春节反应元件（TRES）DOX存在。转录的mRNA含有CFP -β-肌动蛋白的编码序列，和24 MS2的重复，YFP - MS2融合蛋白的约束。在3' -末端，一个兔β-珠蛋白外显子 - 内含子 - 外显子模块的一部分，其次是一个卵裂多聚腺苷酸信号。该计划还介绍了伸长率检测显示荧光的MS2蛋白（黄色）连接到新转录的RNA聚合酶II转录的mRNA（b）在活跃转录的网站（YFP - MS2，右手细胞）是光漂白和荧光恢复被跟踪随着时间的推移（帧的底部）。我们测得的荧光强度漂白剂（中间线）和非漂白（底线）积极转录。注意左手的细胞是不适合一个漂白实验（C）CFP -肌动蛋白基因的转录网站上进行的实验测量。在蓝色经济复苏的YFP - MS2的FRAP测量曲线。红色，处于稳定状态的转录网站YFP - MS2的信号来自同一实验的非漂白细胞。
图2。 （二）（a）计划的描述与转录现场YFP - MS2的分子标记的mRNA的入口和出口的动力学模型。YFP - MS2的FRAP数据拟合模拟（平均十个实验拟合模型） 。适合计算残差是在底部。
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Discussion
用于测量活细胞聚合酶的动能活动的方法，可以分为两个部分。第一部分介绍的“湿”的过程，使mRNA转录的动力学数据测量和检索，而在第二部分中，数据是使用一个ODE模型分析。5一些研究现在已经利用这种方法提取在活细胞内5，6，8，12-14的转录动力学。这些研究之间的主要区别是FRAP恢复曲线转换成动能参数的方式。在许多情况下使用的数学模型。一个模型，描述了一个简单的方式生物过程，然后比较FRAP数据。一旦有一个良好的相关性之间的数据和模型，验证模型，通过测量药物效果或不同的基因之间的比较，如额外的生物实验。
这是可能采取上述的分析，进一步获得额外动能的结果。例如，它使用的MS2的荧光蛋白photoactivatable形式是photoactivate已经生成的mRNA转录和转录网站将他们释放（=恢复FRAP所测得的信号强度VS减少）5，此外，而FRAP MS2的标签的mRNA措施伸长动力学，GFP RNA聚合酶II转录现场FRAP产量整个转录过程的动力学，即预启动，启动，伸长率和终止5，13，15，16 。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
YS - T是由欧洲研究委员会（ERC），以色列科学基金会（ISF）（250/06），ISF Bikura，以色列癌症研究基金会（ICRF），德国和以色列的科技研究和开发基金会（GIF的支持），美国和以色列两个民族组成的科学基金会（BSF），德国和以色列项目合作（DIP），和以色列科学和健康的部委，并在生命科学，简斯特恩Lebell家庭巴伊兰大学的研究员。 YB是Azrieli Azrieli奖学金奖基金会表示感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | ||
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche Group |
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