Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

Summary

Cinética de RNA polimerase II transcricional são medidos em genes específicos em células vivas. mRNAs transcritos do gene de interesse são fluorescente etiquetado e usando a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) o vivo na cinética de alongamento transcricional são obtidos.

Abstract

A atividade transcricional da RNA polimerase II (Pol II) é um processo dinâmico e, portanto, a medição da cinética do processo de transcrição in vivo é importante. Pol cinética II foram medidos utilizando métodos bioquímicos ou moleculares. ^1-3 Nos últimos anos, com o desenvolvimento de novos métodos de visualização, tornou-se possível seguir a transcrição como ocorre em tempo real em células vivas único. ⁴ Aqui nós descrevemos como para realizar a análise de Pol II alongamento cinética em um gene específico nas células vivas. ^{5, 6} Usando uma linha de célula na qual um locus gene específico (DNA), seu produto mRNA, eo produto final pode ser a proteína fluorescente etiquetado e visualizados in vivo , é possível detectar a transcrição de mRNAs real sobre o gene de interesse. ^{7, 8} O mRNA é fluorescente etiquetado com o sistema MS2 mRNAs para marcação in vivo, onde o 3'UTR de transcritos no mRNA de conter 24 MS2 haste-laço repete, que fornecem altamente específicos sítios de ligação para a proteína casaco YFP-MS2 que rotula o mRNA como é transcrito. ⁹ Para monitorar a cinética de transcrição usamos a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) método. Por fotobranqueamento as transcrições YFP-MS2-tagged nascente no local da transcrição e, em seguida, após a recuperação deste sinal ao longo do tempo, obtemos a taxa de síntese dos mRNAs recém-feitos. ⁵ Em outras palavras, YFP-MS2 recuperação de fluorescência reflete a geração de novos MS2-tronco-loops nas transcrições nascente e sua ligação por fluorescentes YFP-MS2 livre moléculas entrem a partir do nucleoplasma circundante. As curvas de recuperação FRAP são então analisados ​​por modelos mecanicistas matemática formalizada por uma série de equações diferenciais, a fim de recuperar os parâmetros de tempo cinética de transcrição.

Protocol

O sistema celular utilizado deve conter uma construção gene integrado que inclui MS2 seqüências de repetição para a marcação do mRNA em células vivas. Neste protocolo, usamos uma linha celular humana U2OS abrigando um gene de maneira estável β-actina integrada, que é fluorescente etiquetado no DNA, RNA e proteínas ^8, da seguinte forma (Figura 1A): A 5 'do gene contém operador lac ( Laco) repete - estas são usadas para marcar o gene (DNA) e, assim, identificar o locus de integração genômica. A proteína fluorescente etiquetado lac repressor (LacI) se ligará à repete Laco e tag do DNA. Os mRNAs são marcados com YFP-MS2 proteínas que se ligam ao MS2 repete (tronco-loops). O produto do gene é CFP-actina e, portanto, a indução do gene irá resultar no aparecimento de CFP-tagged citoesqueleto de actina. A modificação genética é transfectadas em uma linhagem de células U2OS Tet-On estável e sua expressão está sob controle transcricional Tet.

1. Revestimento de célula e transfecção:

1. 48 horas antes das medições, semente ~ 2 * 10 ⁵ células em placas de cultura de fundo de vidro tecido (35 milímetros pratos petri com 14 milímetros de vidro de fundo micropoços (,16-0,19 mm de espessura;. Cat. P35G-1.5-14-C , Mattek, Ashland, MA)). Adicionar 2 ml de meio para as células, a fim de atingir confluência 50-80%.
2. 24 horas antes do experimento, transitoriamente transfecção as células com construções que expressam os marcadores fluorescentes para marcação de DNA eo mRNA. Use FuGENE6 reagentes de transfecção (Roche).
   Os construtos utilizados:
   1. YFP-MS2-NLS irá marcar o tronco MS2-loops nas transcrições mRNA. A seqüência de localização nuclear (NLS) fornece a seqüência de entrada para a proteína nuclear YFP-MS2.
   2. opcional - CFP-LacI ou RFP-LacI que ligará o laço se repete na 5 'do gene e rotular o locus do gene. Lócus de marcação do gene auxilia no rastreamento do gene durante o experimento FRAP, mas não é necessário.
3. Incubar as células durante pelo menos 12 horas, para obter boa expressão das proteínas transitória transfectadas (ver nota).
4. 6 - 12 horas antes do experimento adicionar 1,5 mcg / ml doxiciclina (Sigma) para as células para ativar do Tet induzível gene-PCP-actina.

Notas:
* É importante não se atingir níveis muito elevados de expressão das proteínas transfectadas para não mascarar o sinal obtido especificamente a partir do site a transcrição, em relação ao sinal de fundo. Níveis de expressão pode ser controlada por: a) ajustar o tempo entre a transfecção e da experiência; b) alterando a força do promotor (por exemplo, CMV é mais forte que o promotor L30); c) adição de um sinal de exportação nuclear (NES) para o YFP-MS2-NLS proteína, o que ajudará a distribuir o sinal YFP em toda a célula.

* O fluoróforo usado para as medições devem ser preferencialmente fotoestável aquisições em todo tempo, por isso verde / amarelo fluoróforos que emitem são melhores do que fluoróforos vermelho. Informações sobre os fluoróforos diferentes podem ser encontrados na ref ^10.

* Determinar que os canais de luz diferente não sangram-through para o outro. Use slides contendo espécimes rotulados com cada um dos marcadores separadamente, medida em cada slide a intensidade de ambos os canais, e depois calcular a sangrar-through.

2. FRAP:

O experimento pode ser realizado em qualquer microscópio que é capaz de adquirir imagens tanto e realizando fotobranqueamento com um feixe de laser. Normalmente, os experimentos FRAP são realizadas com um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM). No entanto, como no nosso caso, o experimento é relativamente longo (15-30 min), e estamos seguindo um locus de pequeno porte dentro do núcleo, é importante ser capaz de manter o gene do site lócus / transcrição em foco durante todo o experimento. Isso exige uma rápida imagem em 3 dimensões ao longo do tempo (4D), e as taxas de aquisição, tais são difíceis de obter através de um microscópio de varredura confocal. Por isso, usamos um sistema 3D-FRAP (fotométricos), construído em um grande campo Olympus IX81 microscópio (63X Plan-Apo, 1,4 NA) equipado com um EM-CCD (Quant-EM, Roper), que pode adquirir imagens em alta velocidade (até 30 imagens / seg). O sistema tem 405 nm e 491 nm lasers que podem ser sincronizados com a câmera para permitir fotobranqueamento em uma região específica de interesse (ROI) da amostra. O microscópio é equipado com uma fonte Lambda DG-4 luz (Sutter) e um estágio XY e Z (prévia) que permite que imagens rápidas e precisas no Z-eixo. Todo o equipamento é integrado e controlado por Metamorph (dispositivos Molecular). Os experimentos em células vivas, são realizados a 37 ° C com 5% de CO _2, utilizando um sistema de câmara de live-célula (Tokai).

1. Procedimento: Meia hora antes do experimento, ligue o microscópio de aquecimento do dispositivo e laser. Durante a experiênciamento a temperatura deve permanecer constante, caso contrário, pode causar mudanças de foco durante os tempos de aquisição de comprimento. Potência do laser deve ser estável para produção de energia consistente.
2. Sincronizar o laser com a câmara:
   1. Busca de uma área na placa que não contém células (utilizando DIC).
   2. Use o canal de mesma luz que será usada para os experimentos. Aqui usamos o laser 491 nm para o canal YFP.
   3. Aponte o laser para o meio da imagem.
   4. Use o botão de sincronizar (desde macro).
   5. Tente pontos diferentes no campo para garantir que o laser ea câmera são sincronizados.
3. Escolha uma célula bom candidato para o experimento. Apesar de trabalhar com linhagens de células estáveis, descobrimos que nem todas as células têm níveis de expressão similar. Bons candidatos seriam as células que: a) exibem uma YFP-MS2-tagged clara local transcrição acima do difusa YFP-MS2 fundo, e b) ter YFP-MS2 livre suficiente de proteína na célula, de modo a ser capaz de recuperar totalmente após a fotobranqueamento (exemplo na figura 1B - compare as duas células, a célula à esquerda não é um bom candidato para clareamento).
4. Escolha condições adequadas de medição. O procedimento FRAP requer a aquisição de muitas imagens, e por isso é importante para o equilíbrio entre os tempos de exposição razoável e usando como luz mais baixa possível. Altos níveis de luz podem afetar a célula devido à fototoxicidade, e fará com que fotobranqueamento. Recomenda-se manter os parâmetros de imagem constante entre diferentes experimentos.
   Células são gravadas no canal YFP com 150 vezes a exposição ms, e no canal PCP para a detecção de CFP-laci (locus genômica). Após o locus CFP-LacI tag permite a detecção do gene, mesmo quando o YFP-MS2 sinal de mRNA é Foto-descoloração (opcional). Para cada aquisição, 7 Z-fatias são tomadas a cada 350 nm. O site de transcrição ativa é branqueada utilizando o laser nm 491.
5. Realizar o experimento completo, mas sem branqueamento. O experimento FRAP mede o tempo que leva para o site de transcrição para retornar ao estado estacionário. Primeiro, queremos verificar se o site de transcrição ativa é funcional e estável no estado estacionário. Por isso, realizamos um experimento FRAP completa, mas sem branqueamento para garantir que a intensidade medida do local a transcrição não muda durante o período do experimento. Nós usamos esta experiência para também testar nossas condições de imagem através da medição da fotobranqueamento total causado pela série de imagens completo. Como regra geral, o photobleach filme completo não deve ser superior a 30% da intensidade inicial. Isto pode ser medido através da razão de intensidade do mesmo ponto no núcleo da última imagem, divididos por primeira imagem (razão deve ser maior que 0,7).
6. FRAP: O sinal YFP-MS2 no local de transcrição ativa é branqueada utilizando o laser nm 491. 6 pré-bleach imagens são adquiridas. Pós-bleach imagens são adquiridas em uma seqüência de três freqüências de tempo: 15 imagens a cada 3 seg, 15 imagens a cada sec 6, e 26 (ou 45 para os experimentos de comprimento) imagens a cada 30 seg. As mudanças na freqüência de adquirir imagens permite adquirir imagens durante os tempos que mostram a mudança de maior intensidade (inicial de recuperação), e menos imagens para o final, quando as mudanças no sinal são menos proeminentes.

Notas: Este experimento difere da FRAP "regular" em que:
* FRAP de mRNA no local transcrição medidas a ligação do YFP-MS2 proteínas para o mRNA nascente, ao passo que experimentos FRAP típico medir a mobilidade de diferentes proteínas na célula. Portanto, não há interesse em medir a piscina difusivo de YFP-MS2 proteínas. Quando o tempo entre o branqueamento ea primeira imagem adquirida é relativamente longo, é possível desconsiderar essa piscina difusão do livre-YFP MS2 proteínas.

* Uma vez que a recuperação do sinal YFP-MS2 é relativamente longo (15-30 min), é importante para manter o local de transcrição em foco. É por isso que uma série de Z-slices é adquirido em cada ponto do tempo.

3. Normalização dos dados FRAP:

O 4D FRAP dados são analisados ​​usando o software livre de análise de imagem ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Seguinte é a análise realizada com macros disponíveis através do software ImageJ, mas é claro que a auto-escrito macros podem ser geradas.

1. Z-pilhas são projetadas máxima em cada ponto do tempo, resultando em um filme 2D ao longo do tempo para análise posterior.
2. O site de transcrição é controlado em cada quadro e a intensidade média é medido utilizando a ferramenta Rastreador Spot. ¹¹ Os dados são salvos em uma folha de Excel para análise posterior.
3. Para cada ponto do tempo, as intensidades média de outras regiões de interesse (ROI) são medidos da seguinte forma (usando o Analisador de Séries Temporais plug-in de ImageJ): a) A parte de trássolo é retirado de um ROI fora da célula = B (t). b) Um ROI no nucleoplasma, mas, tanto quanto possível do local de bleach = C (t). c) O site de transcrição = S (t) (medida pelo rastreador spot).
4. Corrigir os dados para a fotodegradação causada durante o exame: Subtrair o fundo de todas as outras medidas e corrija a lixívia. Sc (t) é a intensidade corrigida do site transcrição no tempo t.

eq. 1:

5. Normalizar os dados: em primeiro lugar calcular a média das imagens pré-sanitária, o que mostra a intensidade do site transcrição no steady-state (= <Sc _{(pre-bleach)>).}

Então normalizar os dados:

eq. 2

Os dados são normalizados por pelo menos 10 experimentos. Calcular a média dos experimentos eo desvio-padrão (STD) para as barras de erro em cada ponto do tempo (Figura 1C).

Notas:
A difusão da proteína YFP-MS2 durante a análise FRAP foi desconsiderada uma vez que a taxa de difusão de livre nucleoplásmica YFP-MS2 é muito rápido, enquanto o limite YFP-MS2 está associada com alta afinidade ao mRNA, e não reconectados à transcrição site. É por isso que a primeira imagem após o clareamento deve ser removido antes da análise.

4. Analisando os dados usando um modelo matemático:

A fim de recuperar os parâmetros cinéticos a partir deste tipo de conjunto de dados, foi utilizado o modelo mais simples descrito que pode caber este tipo de dados. A explicação completa deste modelo específico pode ser lido aqui ^5. O modelo contém as seguintes equações que descrevem o esquema na figura 2A:

Tendo os parâmetros do modelo, é possível calcular a taxa de alongamento:

Analisamos a curva usando Berkeley Madonna ( http://www.berkeleymadonna.com ), como já modelado ^5, mas outras opções estão disponíveis (MatLab, Cell Virtual, COPASI etc.) Os dados foram ajustados ao modelo e constantes de velocidade foram extraídos. Damos o código em Berkeley Madonna. A fim de melhor ajustar os dados foi calculado o estado de equilíbrio e depois ajustar os dados experimentais normalizados para o modelo normalizado.

5. Resultados representativos:

Nós Foto-descoloração do sinal de mRNA marcado no local de transcrição ativa usando laser de alta potência, e seguiu a recuperação da YFP-MS2 sinal ao longo do tempo. O sinal fluorescente no local transcrição consiste na cinética de estado estacionário da síntese de mRNA, assim como mRNA liberado do site. Medir a intensidade local de transcrição ao longo do tempo sem branqueamento dá um sinal de 'constante' (figura 1C, os pontos vermelhos), que implica que este gene está atualmente em um estado relativo constante. Isto significa que o sinal que se acumula no mRNA recentemente transcrito é igual ao sinal que sai quando um mRNA é liberado a partir do site de transcrição. Quando Foto-descoloração, este sistema continua em seu estado estacionário, mas agora é possível medir o tempo que leva para o sinal para se recuperar. Portanto, a recuperação da fluorescência em sua maioria depende das propriedades de alongamento da polimerase. O sistema FRAP 3D permitiu a obtenção do volume 3D completa nuclear durante a recuperação FRAP e, portanto, nenhum sinal foi perdido durante os experimentos. Para calcular os parâmetros cinéticos a partir dos dados, a curva normalizada foi montado para o alongamento modelo cinético que descreve, que é baseado em equações diferenciais. ⁵ A vantagem de usar um modelo simples ODE é que ele pode estar apto para apenas um pequeno número de parâmetros . O passo inicial do modelo (ponto de entrada) é o alongamento, ou seja, o processo responsável pela síntese nova MS2-binding sites. A etapa final (ponto de saída) é a liberação mRNA no nucleoplasma. O modelo é baseado nas curvas de recuperação, que consistem em dois componentes cineticamente resolvido, uma rápida e mais lenta. O componente rápido refere-se a elongação, enquanto que o componente mais lento foi modelada como polimerase pausa durante o alongamento. Os dois estados da polimerase foram modeladas como alongamento com uma transição estocásticos para uma pausa. Nós otimizamos as equações diferenciais deste modelo, que rendeu uma velocidade de alongamento de 3,3 kb / minuto com uma transição estocásticos para uma taxa mais lenta de síntese (pausa para um tempo acumulado de 2,5 minutos). Modelagem mostrou that esta transição de alongamento para pausar afetado apenas 11% das polimerases que entrou alongamento.

K fora	0,0112
K pause_in	0,0015
K pause_out	0,0067
Tempo de alongamento	(K + para fora k pause_out) -1	56 seg
Tempo de pausa	(K pause_out) -1	2,5 minutos
Probabilidade de fazer uma pausa	(K pause_in) / (K + k pause_in out)	11%

Tabela 1. O modelo resulta em uma tabela de parâmetros.

Figura 1. (A) O sistema de célula experimental utilizada para acompanhar a expressão gênica in vivo. Representação esquemática do gene CFP-actina construir. A 5'-end contém uma série de 256 repete Laco que estão vinculados por RFP-LacI (vermelho) e marcar o local da integração gene. Indução da transcrição do promotor CMV mínima é obtida pela ligação de reverter a tetraciclina ativador transcricional (rtTA ou Tet-On) para Tet-responsive elementos (TREs) na presença de dox. O mRNA transcrito contém a seqüência de codificação para CFP-β-actina, e 24 MS2 repete que estão vinculados pela proteína de fusão YFP-MS2. No final 3'-, uma parte de um módulo de coelho β-globina exon-intron-exon é seguido por um sinal de clivagem-poli. O esquema também descreve o ensaio de alongamento mostrando fluorescentes MS2 proteínas (amarelo) ligado ao mRNAs transcritos recém transcrito pela RNA Pol II. (B) Um site de transcrição ativa (YFP-MS2, célula à direita) foi Foto-descoloração ea recuperação de fluorescência foi monitorado ao longo do tempo (frames na parte inferior). Nós medimos a intensidade de fluorescência de ambos lixívia (linha média) e não-branqueada (linha inferior) sites de transcrição ativa. Nota da célula da esquerda não é adequado para um experimento fotobranqueamento. (C) As medições experimentais realizadas no CFP-actina sites da transcrição de genes. Nas curvas azul a recuperação das medições YFP-MS2 FRAP. Em vermelho, uma célula não-branqueada a partir do mesmo experimento mostrando o sinal YFP-MS2 no local de transcrição no estado estacionário.

Figura 2. (A) Esquema do modelo que descreve a cinética de entrada e saída de mRNAs marcados com YFP-MS2 moléculas no local de transcrição. (B) YFP-MS2 dados FRAP e da simulação equipados (a média de dez experimentos foi montado o modelo) . Os resíduos calculados do ajuste são apresentados na parte inferior.

Discussion

O método para medir a atividade da polimerase cinética em células vivas podem ser divididos em duas partes. A primeira parte descreve o procedimento de "molhado", que permite a medição e recuperação dos dados cinéticos de transcrição de mRNA, enquanto que na segunda parte, os dados são analisados ​​utilizando um modelo de ODE. ⁵ A série de estudos têm agora utilizada esta abordagem para extrair cinética de transcrição em células vivas ^{5, 6, 8, 12-14.} A principal diferença entre estes estudos foi a forma da curva de recuperação FRAP foi convertido em parâmetros cinéticos. Em muitos casos, um modelo matemático é usado. Um modelo deve descrever o processo biológico de uma forma simples e é então comparado com os dados FRAP. Uma vez que há uma boa correlação entre os dados eo modelo, deve-se verificar o modelo por outras experiências biológicas, tais como medidas de efeitos de drogas ou comparando entre genes diferentes.

É possível fazer a análise acima ainda mais para obter resultados adicionais cinética. Por exemplo, usando um formulário photoactivatable da proteína fluorescente MS2 é possível photoactivate transcrições mRNA já gerou e siga sua libertação (= diminuição da intensidade vs a recuperação do sinal medido pelo FRAP) a partir do site de transcrição. ⁵ Além disso, enquanto FRAP de medidas MS2 tag mRNAs cinética de alongamento somente, FRAP de Pol II GFP-RNA no sítio de transcrição produz a cinética de todo o processo de transcrição, ou seja, pré-iniciação, iniciação, alongamento e terminação ^{5, 13, 15, 16.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doxycycline	Sigma-Aldrich
FuGENE 6 transfection reagent	Roche Group