Summary
L'ARN polymérase II cinétiques transcriptionnelles sont mesurés sur des gènes spécifiques dans les cellules vivantes. ARNm transcrit à partir du gène d'intérêt sont marqués par fluorescence et de l'utilisation de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) la cinétique in vivo de l'élongation de la transcription sont obtenues.
Abstract
L'activité transcriptionnelle de l'ARN polymérase II (Pol II) est un processus dynamique et donc de mesurer la cinétique du processus de transcription in vivo est d'importance. Pol II cinétiques ont été mesurées en utilisant des méthodes biochimiques ou moléculaires. 1-3 dernières années, avec le développement de nouvelles méthodes de visualisation, il est devenu possible de suivre la transcription comme il se produit en temps réel dans les cellules vivantes unique. 4 des présentes, nous décrivons comment pour effectuer l'analyse de la cinétique de la Pol II allongement sur un gène spécifique dans les cellules vivantes. 5, 6 utilisant une lignée cellulaire dans laquelle un locus spécifique (ADN), son produit ARNm et la protéine finale peut être marqué par fluorescence et visualisés in vivo , il est possible de détecter la transcription réelle des ARNm du gène d'intérêt. 7, 8 L'ARNm est fluorescence marqués en utilisant le système d'ARNm MS2 marquage in vivo, où le 3'UTR de l'ARNm transcrits contenant 24 MS2 tige-boucle répète, qui fournissent très spécifiques des sites de liaison pour la protéine d'enveloppe YFP-MS2 que les étiquettes de l'ARNm comme il est transcrit. 9 Pour contrôler la cinétique de la transcription, nous utilisons la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) méthode. Par photoblanchiment les transcriptions YFP-MS2-taggés naissante sur le site de la transcription et ensuite après la reprise de ce signal dans le temps, on obtient le taux de synthèse de l'ARNm nouvellement fabriqués. 5 En d'autres termes, YFP-MS2 récupération de fluorescence reflète la nouvelle génération de nouveaux MS2 tiges-boucles dans les transcriptions naissantes et leur liaison par des fluorescents YFP-MS2 gratuitement molécules entrant dans le nucléoplasme environnantes. Les courbes de récupération du PAF sont ensuite analysés en utilisant des modèles mécanistes mathématiques formalisées par une série d'équations différentielles, afin de récupérer les paramètres de temps cinétique de la transcription.
Protocol
Le système cellulaire utilisé doit contenir un gène hybride intégré qui comprend des séquences répétées MS2 pour le marquage de l'ARNm dans les cellules vivantes. Dans ce protocole, nous utilisons une lignée cellulaire humaine U2OS abritant un intégré de manière stable β-actine gène, qui est marqué par fluorescence à l'ADN, l'ARN et de protéine 8, comme suit (figure 1A): Le 5 'du gène contient opérateur lac ( LACO) répète - sont utilisés pour étiqueter le gène (ADN) et ainsi identifier les locus génomique de l'intégration. Une fluorescence taggés répresseur lac protéines (LACI) se lient à des répétitions lacO et la balise de l'ADN. Les ARNm sont étiquetés avec la YFP-MS2 protéines qui se lient à l'MS2 répète (tige-boucle). Le produit du gène est PCP-actine et donc l'induction du gène entraîne l'apparition de la PCP-taggés cytosquelette d'actine. La construction génique est transfecté dans une U2OS Tet-On lignée cellulaire stable et son expression est sous contrôle transcriptionnel Tet.
1. Plaquage cellulaire et transfection:
- 48 heures avant les mesures, les graines de ~ 2 * 10 5 cellules sur fond de verre boîtes de culture tissulaire (35 mm boîtes de Pétri avec un 14 mm à fond de verre micropuits (de 0.16 à 0.19 mm d'épaisseur; Cat. No. P35G-1.5-14-C , MatTek, Ashland, MA)). Ajouter 2 ml de milieu pour les cellules, afin d'atteindre la confluence de 50-80%.
- 24 heures avant l'expérience, transitoirement transfecter des cellules avec des constructions qui expriment les marqueurs fluorescents pour le marquage de l'ADN et l'ARNm. Utilisez FuGENE6 réactif de transfection (Roche).
Les constructions utilisées:- YFP-MS2-SNA tag MS2 tiges-boucles dans les transcrits d'ARNm. La séquence de localisation nucléaire (NLS) fournit la séquence d'entrée nucléaire pour la protéine YFP-MS2.
- optionnels - CFP-LacI ou RFP-LacI qui lieront le répète lacO en 5 'du gène et l'étiquette du locus du gène. Marquage du locus du gène aide à suivre le gène lors de l'expérience du FRAP, mais n'est pas nécessaire.
- Incuber les cellules pendant au moins 12 heures, pour obtenir une bonne expression des protéines passagères transfectées (voir note).
- 6 - 12 heures avant l'expérience ajouter 1,5 ug / ml de doxycycline (Sigma) pour les cellules de l'activation de la Têt inductible PCP-gène de l'actine.
Notes:
* Il est important de ne pas atteindre des niveaux très forte expression des protéines transfectées de manière à ne pas masquer le signal obtenu spécifiquement sur le site de transcription, par rapport au signal de fond. Niveaux d'expression peut être contrôlé par: a) en adaptant le temps entre la transfection et l'expérience; b) modifier la force du promoteur (par exemple le CMV est plus fort que le promoteur L30), c) l'ajout d'un signal d'export nucléaire (NDA) pour le YFP-MS2-NLS protéines, ce qui permettra de distribuer le signal YFP dans les cellules entières.
* Le fluorophore utilisé pour les mesures doit être de préférence à travers des acquisitions à long photostable; donc vert / jaune fluorophores émettant sont meilleurs que les fluorophores rouges. Information sur les fluorophores différents peuvent être trouvés dans ref 10.
* Déterminer que les canaux de lumière différente ne saignent pas-par le biais de l'autre. Utilisez diapositives contenant des spécimens étiquetés avec chacun des marqueurs séparément, de mesurer dans chaque diapositive l'intensité des deux canaux, et ensuite calculer le transpercement.
2. FRAP:
L'expérience peut être effectuée sur un microscope qui est capable d'acquérir des images à la fois performants et de photoblanchiment avec un faisceau laser. Typiquement, les expériences du PAF sont effectuées avec un microscope confocal à balayage laser (CLSM). Cependant, puisque dans notre cas, l'expérience est relativement longue (15-30 min), et nous suivons un locus petits au sein du noyau, il est important d'être capable de garder le locus du gène / transcription du site d'orientation tout au long de l'expérience tout entière. Cela nécessite d'imagerie rapide en 3 dimensions dans le temps (4D), et les taux d'acquisition sont difficiles à obtenir en utilisant un microscope confocal à balayage. Par conséquent, nous utilisons un système 3D-FRAP (Photometrics) construite sur un grand champ Olympus IX81 microscope (63X Plan-Apo, 1,4 NA) équipé d'un EM-CCD (Quant-EM, Roper) qui peut acquérir des images à haute vitesse (jusqu'à 30 images / sec). Le système a 405 nm et 491 nm lasers qui peuvent être synchronisées avec la caméra pour permettre photoblanchiment sur une région d'intérêt (ROI) de l'échantillon. Le microscope est équipé d'une source Lambda DG-4 lumière (Sutter) et une platine XY & Z (Avant), qui permet l'imagerie rapide et précis dans l'axe Z. Tous les équipements sont intégrés et contrôlés par MetaMorph (Molecular Devices). Les expériences des cellules vivantes sont effectuées à 37 ° C avec 5% de CO 2 en utilisant un système de chambre de cellules vivantes (Tokai).
- Procédure: Une demi-heure avant l'expérience, allumer l'appareil de chauffage, un microscope et le laser. Au cours de l'expériencement la température doit rester constante, sinon il pourrait causer des changements concentrer pendant les temps d'acquisition long. Puissance du laser doit être stable pour une puissance constante.
- Synchroniser le laser avec la caméra:
- Recherche d'une zone de la plaque qui ne contient pas de cellules (en utilisant DIC).
- Utilisez le canal même lumière qui sera utilisée pour les expériences. Ici, nous utilisons le laser 491 nm pour le canal de la YFP.
- Pointez le laser pour le milieu de l'image.
- Utilisez le bouton de synchronisation (fournie macro).
- Essayez différents endroits sur le terrain pour s'assurer que le laser et la caméra sont synchronisés.
- Choisissez une cellule bon candidat pour l'expérience. Bien que nous travaillons avec des lignées cellulaires stables, nous constatons que toutes les cellules ne présentent des niveaux d'expression similaire. Les bons candidats seraient les cellules qui: a) présentent une YFP-MS2-marqués clairs site de la transcription ci-dessus la YFP-MS2 fond diffus, et b) ont YFP-MS2 libre suffisant en protéines dans la cellule afin d'être en mesure de récupérer complètement après la photoblanchiment (par exemple dans la figure 1B - de comparer les deux cellules, la cellule de gauche n'est pas un bon candidat pour le blanchiment).
- Choisissez de bonnes conditions de mesure. La procédure nécessite FRAP l'acquisition de nombreuses images, et donc il est important d'équilibre entre les temps d'exposition raisonnable et en utilisant la lumière faible que possible. Des niveaux élevés de lumière peut affecter la cellule en raison de la phototoxicité et causera photoblanchiment. Il est recommandé de conserver les paramètres d'imagerie constante entre différentes expériences.
Les cellules sont imagés dans le canal de la YFP avec 150 msec temps d'exposition, et dans le canal PCP pour la détection de PCP-lad (locus génomiques). Après le locus PCP-LacI marqués permet la détection du gène de même lorsque le signal YFP-MS2 ARNm est photobleached (facultatif). Pour chaque acquisition, 7 Z-tranches sont prises tous les 350 nm. Le site de transcription actif est blanchie à l'aide du laser 491 nm. - Réaliser l'expérience complète, mais sans blanchiment. L'expérience du FRAP mesure le temps qu'il faut pour que le site de transcription pour revenir à l'état stationnaire. Tout d'abord, nous voulons vérifier que le site de transcription actif est fonctionnel et stable à l'état stationnaire. Par conséquent, nous effectuons une expérience complète du PAF, mais sans blanchiment pour s'assurer que l'intensité mesurée sur le site de transcription ne change pas pendant le délai de l'expérimentation. Nous utilisons cette expérience pour aussi tester nos conditions d'imagerie en mesurant le photoblanchiment totale causée par la série d'imagerie complète. En règle générale, le film complet photobleach ne doit pas être supérieure à 30% de l'intensité initiale. Ceci peut être mesuré en utilisant le rapport d'intensité de la même tache dans le noyau de la dernière image, divisé par la première image (ratio devrait être plus grand que 0,7).
- FRAP: Le signal YFP-MS2 sur le site de transcription active est blanchie à l'aide du laser 491 nm. 6 pré-blanchiment images sont acquises. Post-javel images sont acquises dans une séquence de 3 fréquences de temps: 15 images toutes les 3 secondes, 15 images toutes les 6 sec, et 26 (ou 45 pour les expériences de long) des images toutes les 30 secondes. Les changements dans la fréquence d'acquisition d'images permet d'acquérir plus d'images dans les moments qui montrent le changement de haute intensité (récupération initiale), et moins d'images vers la fin lorsque les changements de signaux sont moins importantes.
Notes: Cette expérience diffère de «régulier» du PAF en ce que:
* PAF de l'ARNm sur le site de la transcription des mesures de la liaison de protéines YFP-MS2 à l'ARNm naissant, alors que des expériences typiques FRAP mesurer la mobilité des différentes protéines dans la cellule. Par conséquent, il n'ya aucun intérêt à la mesure de la piscine diffusif de YFP-MS2 protéines. Lorsque le temps entre le blanchiment et la première image acquise est relativement long, il est possible de faire abstraction de ce bassin de diffusion de libre-YFP MS2 protéines.
* Depuis la reprise du signal YFP-MS2 est relativement long (15-30 min), il est important de garder le site de transcription au point. C'est pourquoi une série de Z-tranches est acquise à chaque point du temps.
3. Normalisation des données FRAP:
Le FRAP 4D données sont analysées en utilisant le logiciel gratuit d'analyse d'image logiciel ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Voici l'analyse réalisée avec des macros disponibles via le logiciel ImageJ, mais des cours d'auto-écrit les macros peuvent être générés.
- Z-piles sont maximales projetées à chaque fois-là, résultant en un film 2D au fil du temps pour une analyse ultérieure.
- Le site de transcription est suivi dans chaque trame et l'intensité moyenne est mesurée en utilisant l'outil Tracker Spot. 11 Les données sont enregistrées dans une feuille Excel pour une analyse ultérieure.
- Pour chaque point dans le temps, les intensités moyennes à d'autres régions d'intérêt (ROI) sont évalués comme suit (en utilisant l'analyseur de séries chronologiques de plug-in de ImageJ): a) Le retourde-chaussée est pris d'un retour sur investissement en dehors de la cellule = B (t). b) Un retour sur investissement dans le nucléoplasme, mais aussi loin que possible du site de Javel = C (t). c) Le site de transcription = S (t) (telle que mesurée par le tracker sur place).
- Corriger les données pour photoblanchiment causés lors de l'imagerie: Soustrayez le fond de toutes les autres mesures et ensuite corriger l'eau de Javel. Sc (t) est l'intensité corrigée du site de transcription à un moment t.
éq. 1: 
- Normaliser les données: d'abord calculer la moyenne des images pré-blanchiment, ce qui montre l'intensité du site de transcription à l'état stationnaire (= (pre-bleach)> <Sc).
Puis normaliser les données:
éq. 2 
Les données sont normalisées pour au moins 10 expériences. Calculer la moyenne des expériences et la déviation standard (STD) pour les barres d'erreur à chaque fois du point (figure 1C).
Notes:
La diffusion de la protéine YFP-MS2 lors de l'analyse du PAF a été écartée, car le taux de diffusion du libre nucléoplasmique YFP-MS2 est très rapide, tandis que la borne YFP-MS2 est associée avec une haute affinité à l'ARNm, et ne remettez pas à la transcription le site. C'est pourquoi la première image après le blanchiment doit être retiré avant l'analyse.
4. Analyser les données en utilisant un modèle mathématique:
Afin de récupérer les paramètres cinétiques de ce genre de jeu de données, nous avons utilisé le modèle le plus simple qui peut s'adapter décrit ce genre de données. L'explication complète de ce modèle spécifique peut être lu ici 5. Le modèle contient des équations qui décrivent le schéma de la figure 2A:
Ayant les paramètres du modèle, il est possible de calculer le taux d'allongement:
Nous avons analysé la courbe en utilisant Berkeley Madonna ( http://www.berkeleymadonna.com ), comme précédemment modélisés 5 mais d'autres options sont disponibles (MatLab, Cell Virtuel, COPASI etc.) Les données ont été apte à le modèle et les constantes de vitesse ont été extraites. Nous attachons le code de Berkeley Madonna. Afin de mieux ajuster les données, nous avons calculé l'état stationnaire et ensuite ajuster les données normalisées expérimentales pour le modèle normalisé.
5. Les résultats représentatifs:
Nous photobleached le signal ARNm marqué sur le site de transcription active en utilisant la puissance du laser haute, et a suivi la reprise de l'YFP-MS2-signal dans le temps. Le signal fluorescent sur le site de la transcription se compose de la cinétique de l'état d'équilibre de la synthèse de l'ARNm ainsi que l'ARNm publié sur le site. Mesure de l'intensité du site de transcription au cours du temps sans blanchiment donne une «constante» du signal (figure 1C, les points rouges) ce qui implique que ce gène est actuellement dans un état relativement stable. Cela signifie que le signal qui s'accumule sur l'ARNm nouvellement transcrits est égal au signal qui laisse quand un ARNm est publié sur le site de transcription. Lorsque photobleached, ce système continue dans son état stable, mais il est désormais possible de mesurer le temps qu'il faut pour le signal pour récupérer. Par conséquent, la récupération de fluorescence dépend surtout des propriétés d'élongation de la polymérase. Le système 3D a permis FRAP l'acquisition du volume nucléaire complet en 3D lors de la récupération du PAF, et donc pas de signal a été perdu pendant les expériences. Pour le calcul des paramètres cinétiques à partir des données, la courbe normalisée a été monté à l'allongement modèle cinétique décrivant, qui est basé sur les équations différentielles. 5 L'avantage d'utiliser un modèle ODE est simple: il peut être apte à seulement un petit nombre de paramètres . L'étape initiale du modèle (point d'entrée) est l'allongement, à savoir le processus responsable de la synthèse de nouveaux sites de liaison MS2. L'étape de fin (point de sortie) est communiqué ARNm dans le nucléoplasme. Le modèle est basé sur les courbes de récupération, qui se composent de deux éléments cinétique résolue, l'un rapide et lent. La composante rapide se réfère à l'allongement, alors que le ralentissement de la composante a été modélisée comme polymérase pause pendant l'allongement. Les deux états polymérase ont été modélisés comme l'élongation à une transition stochastique pour une pause. Nous avons optimisé les équations différentielles de ce modèle, qui a donné une vitesse d'élongation de 3,3 kb / minute avec une transition stochastique à un taux plus lent de synthèse (une pause pour un temps cumulé de 2,5 minutes). Modélisation montré that cette transition de l'allongement à la pause touché que 11% des polymérases, qui est entré élongation.
| K sur | 0,0112 | |
| K pause_in | 0,0015 | |
| K pause_out | 0,0067 | |
| Allongement du temps | (K + K sur pause_out) -1 | 56 sec |
| Temps de pause | (K pause_out) -1 | 2.5 minutes |
| Probabilité de pause | (K pause_in) / (K + K pause_in out) | 11% |
Tableau 1. Le modèle des résultats dans un tableau de paramètres.
Figure 1. (A) Le système de pile expérimentale utilisée pour suivre l'expression des gènes in vivo. Représentation schématique du gène de la PCP-actine construire. L'extrémité 5 'contient une série de répétitions lacO 256 qui sont liés par DP-LacI (rouge) et marquer le site d'intégration du gène. Induction transcriptionnelle du promoteur minimal CMV est réalisée par la liaison de renverser la tétracycline activateur transcriptionnel (rtTA ou Tet-On) pour Tet éléments sensibles (TRE), en présence de Dox. L'ARNm transcrit contient la séquence codant pour CFP-β-actine, et 24 MS2 répète qui sont liés par la protéine de fusion YFP-MS2. À l'extrémité 3 ', une portion d'un lapin β-globine exon-intron-exon module est suivi par un signal de clivage-polyA. Le schéma décrit également le dosage allongement montrant fluorescentes MS2 protéines (jaune) attaché à la nouvelle ARNm transcrits d'ARN transcrits par la Pol II (B). Un site de transcription active (YFP-MS2, la cellule de droite) a été photobleached et la récupération de fluorescence a été suivi au fil du temps (cadres sur le fond). Nous avons mesuré l'intensité de fluorescence des deux Javel (ligne médiane) et non blanchi (ligne du bas) des sites de transcription active. Notez la cellule de gauche n'est pas adapté pour une expérience de photoblanchiment. (C) Les mesures expérimentales effectuées sur les sites PCP-actine transcription des gènes. Dans les courbes la reprise bleue des mesures FRAP YFP-MS2. En rouge, une cellule non-blanchie à partir de la même expérience montrant le signal YFP-MS2 sur le site de la transcription à l'état stationnaire.
Figure 2. (A) Schéma du modèle décrivant la cinétique d'entrée et de sortie des ARNm marqué avec la YFP-MS2 molécules sur le site de la transcription. (B) des données FRAP YFP-MS2 et la simulation équipée (la moyenne des dix expériences a été monté sur le modèle) . Les résidus calculés de l'ajustement sont présentés dans le bas.
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Discussion
La méthode pour mesurer l'activité polymérase cinétique dans les cellules vivantes peuvent être divisés en deux parties. La première partie décrit le «mouillé» la procédure qui permet la mesure et la récupération des données cinétiques de transcription ARNm, alors que dans la seconde partie, les données sont analysées en utilisant un modèle ODE. 5 Un certain nombre d'études ont maintenant utilisé cette approche pour l'extraction cinétique de la transcription dans les cellules vivantes 5, 6, 8, 12-14. La différence majeure entre ces études était la manière la courbe de récupération du PAF a été transformé en paramètres cinétiques. Dans de nombreux cas un modèle mathématique est utilisé. Un modèle doit décrire le processus biologique d'une manière simple et il est ensuite comparé aux données du PAF. Une fois qu'il ya une bonne corrélation entre les données et le modèle, on doit vérifier le modèle par d'autres expériences biologiques telles que les mesures des effets des médicaments ou de comparer entre les différents gènes.
Il est possible de pousser l'analyse ci-dessus pour obtenir plus d'autres résultats cinétiques. Par exemple, en utilisant un formulaire photoactivables de la protéine fluorescente MS2 il est possible de transcrits d'ARNm photoactiver déjà généré et suivre leur mise en liberté (= diminution d'intensité vs la récupération du signal mesuré par FRAP) du site de transcription. 5 De plus, tout le PAF des cinétiques MS2 ARNm marqués mesures d'élongation seulement, FRAP de la GFP-ARN Pol II sur le site de la transcription des rendements de la cinétique de l'ensemble du processus de transcription, à savoir, de pré-initiation, l'initiation, l'élongation et la terminaison 5, 13, 15, 16.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
YS-T est soutenu par le Conseil européen de la recherche (CER), l'Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israël Cancer Research Fund (ICRF), l'Allemagne et Israël Fondation pour la recherche scientifique et le développement (GIF ), Etats-Unis-Israël binational Science Foundation (BSF), Projet de coopération israélo-allemande (DIP), et les Ministères israéliens de la Science et de la santé, et est Fellow de la famille Stern Jane Lebell en sciences de la vie humaine en université Bar-Ilan. YB est reconnaissante à la Fondation Azrieli pour l'octroi d'une bourse Azrieli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | ||
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche Group |
References
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