Summary
RNA polimerasi II cinetica trascrizionali sono misurate su specifici geni nelle cellule viventi. mRNA trascritto dal gene di interesse sono fluorescente tag e l'utilizzo di recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) la cinetica in vivo di allungamento della trascrizione si ottengono.
Abstract
L'attività trascrizionale della RNA polimerasi II (Pol II) è un processo dinamico e quindi misurare la cinetica del processo di trascrizione in vivo è di importanza. Pol cinetica II sono stati misurati utilizzando metodi biochimici o molecolari. 1-3 Negli ultimi anni, con lo sviluppo di nuovi metodi di visualizzazione, è diventato possibile seguire la trascrizione di quanto avviene in tempo reale in cellule viventi solo 4. Qui si descrivono le modalità di eseguire analisi di Pol II cinetica allungamento su uno specifico gene in cellule viventi. 5, 6 Utilizzando una linea cellulare in cui un locus specifico gene (DNA), il suo prodotto l'mRNA, e il prodotto finale può essere proteina fluorescente e visualizzati in vivo , è possibile rilevare la trascrizione reale di mRNA del gene di interesse. 7, 8 L'mRNA è fluorescente tag MS2 utilizzando il sistema di tagging per mRNA in vivo, dove il 3'UTR dei trascritti di mRNA contiene 24 MS2 stem-loop ripete, che forniscono i siti di legame altamente specifico per il YFP-MS2 proteina di rivestimento che le etichette l'mRNA come è trascritto. 9 Per monitorare la cinetica di trascrizione usiamo il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) metodo. Dal fotodecolorazione il YFP-MS2-tagged trascrizioni nascente nel sito di trascrizione e poi dopo il recupero di questo segnale nel tempo, si ottiene il tasso di sintesi del mRNA di nuova fabbricazione. 5 In altre parole, YFP-MS2 recupero fluorescenza riflette la generazione di nuovo MS2 staminali loop nelle trascrizioni nascente e il loro legame con fluorescente libero YFP-MS2 molecole che entrano dalla nucleoplasma circostante. Le curve di recupero FRAP vengono poi analizzati utilizzando modelli meccanicistici matematici formalizzati da una serie di equazioni differenziali, al fine di recuperare i parametri cinetici tempo di trascrizione.
Protocol
Il sistema cellulare, deve contenere un costrutto integrato gene che comprende MS2 sequenze ripetute per il tagging mRNA nelle cellule viventi. In questo protocollo si usa una linea di cellule umane U2OS asilo ad un stabilmente integrato β-actina gene, che è fluorescente al DNA, RNA e livelli di proteina 8, come segue (Figura 1A): Il 5 'del gene contiene operatore lac ( Laco) ripete - questi sono usato per codificare il gene (DNA) e, quindi, identificare il locus genomico di integrazione. Un fluorescente tag proteina repressore lac (Laci) si legano alle ripetizioni Laco e tag del DNA. L'mRNA sono contrassegnati con YFP-MS2 proteine che si legano alla MS2 ripetizioni (stem-loop). Il prodotto del gene è CFP-actina e quindi l'induzione del gene comporta la comparsa di PCP-tagged citoscheletro di actina. Il costrutto gene è transfettate in un Tet-On linea cellulare U2OS stabile e la sua espressione è sotto il controllo trascrizionale Tet.
1. Placcatura e trasfezione delle cellule:
- 48 ore prima le misure, seme ~ 2 * 10 5 cellule su piatti a fondo la cultura dei tessuti di vetro (35 mm piastre di Petri con un 14 mm il fondo di vetro micropozzetti (0,16-0,19 mm di spessore;. Cat. No. P35G-1.5-14-C , MatTek, Ashland, MA)). Aggiungere 2 ml di medium per le cellule, in modo da raggiungere il 50-80% confluenza.
- 24 ore prima dell'esperimento, transitoriamente trasfezione delle cellule con costrutti che esprimono i marcatori fluorescenti per la codifica del DNA e l'mRNA. Usa FuGENE6 reagente di trasfezione (Roche).
I costrutti utilizzati:- YFP-MS2-NLS sarà la tag MS2 staminali loop nelle trascrizioni mRNA. La sequenza di localizzazione nucleare (NLS) fornisce la sequenza nucleare voce per il YFP-MS2 proteine.
- opzionale - CFP-Laci o RFP-Laci che legherà le ripetizioni Laco in 5 'del gene e l'etichetta del locus genico. Tagging il locus genico assiste nel tracciamento del gene durante l'esperimento FRAP, ma non è necessario.
- Incubare le cellule per almeno 12 ore, per ottenere una buona espressione delle proteine transitoria transfettate (vedi nota).
- 6 - 12 ore prima dell'esperimento aggiungere 1,5 mg / ml doxiciclina (Sigma) alle cellule per l'attivazione del Tet-inducibile gene CFP-actina.
Note:
* E 'importante non raggiungere livelli molto alti di espressione delle proteine trasfettate in modo da non mascherare il segnale ottenuto specificamente dal sito trascrizione, rispetto al segnale di fondo. I livelli di espressione può essere controllata da: a) regolando il tempo tra trasfezione e l'esperimento; b) modificando la forza del promotore (ad esempio CMV è più forte della promotore L30), c) l'aggiunta di un segnale di esportazione nucleare (NES) al YFP-MS2-NLS proteine, che contribuirà a distribuire il segnale YFP in tutta la cella.
* Il fluoroforo utilizzato per le misure dovrebbero preferibilmente essere fotostabile tutta acquisizioni a lungo; fluorofori che emettono quindi verde / giallo sono meglio di fluorofori rosso. Informazioni sul fluorofori diversi si trovano in rif 10.
* Stabilire che i canali luce diversa non sanguinano-through gli uni agli altri. Diapositive uso contenenti i campioni etichettati con ciascuno dei marcatori a parte, misura in ogni diapositiva l'intensità di entrambi i canali, e quindi calcolare il bleed-through.
2. FRAP:
L'esperimento può essere eseguita su qualsiasi microscopio che è in grado sia di acquisire le immagini e l'esecuzione di photobleaching con un raggio laser. Tipicamente, gli esperimenti FRAP vengono eseguiti con un microscopio confocale a scansione laser (CLSM). Tuttavia, poiché nel nostro caso l'esperimento è relativamente lunga (15-30 minuti), e stiamo seguendo un locus piccola all'interno del nucleo, è importante essere in grado di mantenere il luogo / sito trascrizione del gene a fuoco durante l'intero esperimento. Ciò richiede l'imaging rapido in 3 dimensioni nel tempo (4D), ei tassi di tale acquisizione sono difficili da ottenere utilizzando un microscopio a scansione confocale. Quindi, usiamo un sistema 3D-FRAP (Photometrics) costruita su un grande campo Olympus IX81 microscopio (63x Plan-Apo, 1,4 NA) dotato di un EM-CCD (Quant-EM, Roper) in grado di acquisire immagini ad alta velocità (fino a 30 immagini / sec). Il sistema dispone di 405 nm e 491 nm laser che può essere sincronizzata con la fotocamera per permettere photobleaching su una specifica regione di interesse (ROI) del campione. Il microscopio è dotato di una sorgente Lambda DG-4 luce (Sutter) e uno stadio XY & Z (Prima) che permette l'imaging rapido e preciso nella Z-asse. Tutta l'attrezzatura è integrato e controllato da MetaMorph (Molecular Devices). Il live-cell esperimenti vengono eseguiti a 37 ° C con 5% di CO 2 con un live-cell sistema camerale (Tokai).
- Procedura: Mezz'ora prima dell'esperimento, accendere il dispositivo di riscaldamento, microscopio e laser. Durante l'esperienzamento della temperatura deve rimanere costante, altrimenti potrebbe causare cambiamenti messa a fuoco durante il lunghi tempi di acquisizione. Potenza del laser deve essere stabile per l'uscita di potenza costante.
- Sincronizzare il laser con la fotocamera:
- Cerca in una zona della piastra che non contiene cellule (utilizzando DIC).
- Utilizzare lo stesso canale di luce che verrà utilizzato per gli esperimenti. Qui usiamo il laser a 491 nm per il canale YFP.
- Puntare il laser al centro dell'immagine.
- Utilizzare il pulsante di sincronizzazione (fornito macro).
- Provare diversi punti sul campo per assicurare che il laser e la telecamera sono sincronizzati.
- Scegliere una cella buon candidato per l'esperimento. Anche se lavoriamo con linee cellulari stabili, scopriamo che non tutte le cellule hanno livelli di espressione simili. Buoni candidati sarebbero cellule che: a) mostra una chiara YFP-MS2-tagged site al di sopra della trascrizione diffusa YFP-MS2 sfondo; e b) sono YFP-MS2 sufficiente proteina nella cellula in modo da essere in grado di recuperare completamente dopo l' fotodecolorazione (esempio in figura 1B - confrontare le due celle, la cella di sinistra non è un buon candidato per lo sbiancamento).
- Scegli appropriate condizioni di misura. La procedura FRAP richiede l'acquisizione di molte immagini, e quindi è importante trovare un equilibrio tra tempi di esposizione accettabile e con la luce bassa possibile. Elevati livelli di luce potrebbe influenzare la cellula a causa di fototossicità, e causerà photobleaching. Si raccomanda di mantenere i parametri di imaging costante tra i diversi esperimenti.
Le cellule sono ripreso nel canale YFP tempi di esposizione con 150 msec, e nel canale PCP per la rilevazione di CFP-Laci (locus genomico). Dopo la PCP-Laci locus tag consente la rilevazione del gene, anche quando il segnale-MS2 YFP mRNA è fotodecolorate (opzionale). Per ogni acquisizione, 7 Z-fette vengono effettuate ogni 350 nm. Il sito trascrizione attivo è sbiancata usando il laser a 491 nm. - Eseguire l'esperimento pieno, ma senza sbiancamento. L'esperimento FRAP misura il tempo necessario per il sito di trascrizione per tornare a stato stazionario. In primo luogo, vogliamo verificare che il sito attivo trascrizione è funzionale e stabile allo stato stazionario. Quindi, eseguire un esperimento completo FRAP, ma senza sbiancamento per garantire che l'intensità misurata del sito trascrizione non cambia durante l'arco di tempo esperimento. Noi usiamo questo esperimento per testare anche le nostre condizioni di imaging misurando il photobleaching totale causato dalla serie completa di imaging. Come regola generale, la photobleach film pieno non dovrebbe essere più del 30% dell'intensità iniziale. Questo può essere misurato in base al rapporto di intensità dello stesso punto, nel nucleo dall'ultima immagine, diviso per prima immagine (il rapporto dovrebbe essere maggiore di 0,7).
- FRAP: Il YFP-MS2 segnale nel sito trascrizione attivo è sbiancata usando il laser a 491 nm. 6 pre-candeggina immagini sono state acquisite. Post-candeggina immagini vengono acquisite in una sequenza di 3 frequenze tempo: 15 immagini ogni 3 secondi, 15 immagini ogni 6 secondi, e 26 (o 45 per esperimenti a lungo) le immagini ogni 30 secondi. I cambiamenti nella frequenza di acquisizione di immagini permette di acquisire più immagini durante i tempi che mostrano la variazione più alta intensità (recupero iniziale), e meno le immagini verso la fine quando le variazioni di segnale sono meno evidenti.
Note: Questo esperimento è diverso da FRAP "regolare" in quanto:
FRAP * di mRNA nel sito trascrizione misura il legame di YFP-MS2 proteine al mRNA nascente, mentre gli esperimenti FRAP tipici misurare la mobilità dei differenti proteine all'interno della cellula. Pertanto, non vi è alcun interesse a misurare la piscina diffusiva di YFP-MS2 proteine. Quando il tempo che intercorre tra lo sbiancamento e la prima immagine acquisita è relativamente lungo, è possibile ignorare questo pool di diffusione del libero YFP-MS2 proteine.
* Dal momento che il recupero della YFP-MS2 segnale è relativamente lunga (15-30 min), è importante mantenere il sito trascrizione a fuoco. Questo è il motivo di una serie di Z-fette viene acquisita in ogni punto del tempo.
3. Normalizzazione dei dati FRAP:
Il 4D FRAP dati vengono analizzati utilizzando il software di analisi Free Image ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Che segue è l'analisi effettuata con le macro disponibili attraverso il software ImageJ, ma ovviamente auto-scritto le macro possono essere generati.
- Z-stack sono al massimo proiettati in ogni time-point, risultando in un film in 2D nel corso del tempo per ulteriori analisi.
- Il sito trascrizione viene monitorato in ogni fotogramma e l'intensità media è misurata utilizzando lo strumento Tracker Spot. 11 I dati vengono salvati in un foglio Excel per ulteriori analisi.
- Per ogni time-point, l'intensità media di altre regioni di interesse (ROI) sono valutate come segue (l'analizzatore Time Series plug-in di ImageJ): a) La parte posterioreterreno è tratto da un ROI al di fuori della cellula = B (t). b) un ROI in nucleoplasma, ma per quanto possibile dal sito candeggina = C (t). c) Il sito di trascrizione = S (t) (misurata con il tracker posto).
- Correggere i dati per photobleaching causati durante l'imaging: Sottrarre il fondo da tutte le altre misurazioni e quindi correggere la candeggina. Sc (t) è l'intensità corretta del sito di trascrizione al tempo t.
eq. 1: 
- Normalizzare i dati: in primo luogo calcolare la media delle pre-candeggina immagini, che mostra l'intensità del sito di trascrizione allo stato stazionario (= <Sc (pre-bleach)>).
Poi normalizzare i dati:
eq. 2 
I dati sono normalizzati per almeno 10 esperimenti. Calcolare la media degli esperimenti e la deviazione standard (STD) per l'errore-bar ad ogni time-point (Figura 1C).
Note:
La diffusione del YFP-MS2 proteine durante l'analisi FRAP è stato ignorato in quanto la velocità di diffusione libera nucleoplasmic YFP-MS2 è molto rapido, mentre il limite YFP-MS2 è associata ad alta affinità per l'mRNA, e non ricollegare alla trascrizione sito. È per questo che la prima immagine dopo lo sbiancamento deve essere rimosso prima dell'analisi.
4. Analizzando i dati utilizzando un modello matematico:
Al fine di recuperare i parametri cinetici da questo tipo di set di dati, abbiamo usato il modello più semplice descritto che può andare bene questo tipo di dati. La spiegazione completa di questo specifico modello possono essere lette qui 5. Il modello contiene le seguenti equazioni che descrivono il sistema in figura 2A:
Avendo i parametri del modello, è possibile calcolare il tasso di allungamento:
Abbiamo analizzato la curva utilizzando Berkeley Madonna ( http://www.berkeleymadonna.com ), come precedentemente modellati 5 ma le altre opzioni sono disponibili (MatLab, cella virtuale, COPASI ecc.) I dati sono stati adatti al modello e costanti di velocità sono stati estratti. Noi attribuiamo il codice a Berkeley Madonna. Al fine di soddisfare al meglio i dati che abbiamo calcolato lo stato stazionario e quindi inserire i dati normalizzati sperimentali al modello normalizzato.
5. Rappresentante dei risultati:
Noi fotodecolorate il segnale mRNA marcato nel sito trascrizione attiva utilizzando laser ad alta potenza, e seguito il recupero della YFP-MS2-segnale nel tempo. Il segnale fluorescente al sito trascrizione è costituito dalla cinetica allo stato stazionario della sintesi di mRNA e mRNA rilasciato dal sito. Misurare l'intensità del sito trascrizione nel tempo senza sbiancamento dà un segnale di 'costante' (figura 1C, i punti rossi), il che implica che questo gene è attualmente in uno stato relativamente stabile. Ciò significa che il segnale che si accumula sul mRNA appena trascritto è uguale al segnale che lascia quando un mRNA viene rilasciato dal sito trascrizione. Quando fotodecolorate, questo sistema continua nel suo stato stazionario, ma ora è possibile misurare il tempo impiegato dal segnale per recuperare. Pertanto, il recupero di fluorescenza dipende soprattutto dalle proprietà allungamento della polimerasi. Il sistema FRAP 3D ha permesso l'acquisizione del pieno volume 3D nucleare durante il recupero FRAP, e quindi nessun segnale è stato perso durante gli esperimenti. Per calcolare i parametri cinetici dai dati, la curva normalized è stato montato per l'allungamento modello cinetico che descrive, che si basa su equazioni differenziali. 5 Il vantaggio di utilizzare un semplice modello ODE è che può essere adatto solo a un ristretto numero di parametri . La fase iniziale del modello (punto di ingresso) è l'allungamento, cioè il processo responsabile della sintesi di nuovi MS2 siti di legame. La fase finale (punto di uscita) è uscita mRNA nel nucleoplasma. Il modello si basa sulle curve di recupero, che consistono di due componenti cineticamente risolto, uno veloce e piu 'lento. La componente veloce si riferisce alla allungamento, mentre la componente più lento è stato modellato come polimerasi durante la pausa di allungamento. I due stati polimerasi sono stati modellati come allungamento con una transizione stocastica di pausa. Abbiamo ottimizzato le equazioni differenziali di questo modello, che ha dato una velocità di allungamento di 3,3 kb / minuto con una transizione stocastica ad un tasso più lento di sintesi (la pausa per un tempo complessivo di 2,5 minuti). Modellazione mostrato that questa transizione da allungamento per una pausa colpito solo l'11% della polimerasi che è entrato allungamento.
| K fuori | 0,0112 | |
| K pause_in | 0,0015 | |
| K pause_out | 0,0067 | |
| Allungamento tempo | (K + k pause_out) -1 | 56 sec |
| Tempo di pausa | (K pause_out) -1 | 2,5 minuti |
| Pausa probabilità | (K pause_in) / (K pause_in + k) | 11% |
Tabella 1. Il modello di risultati in una tabella di parametri.
Figura 1. (A) Il sistema a celle sperimentali utilizzati per seguire l'espressione genica in vivo. Rappresentazione schematica della PCP-actina gene costruire. Il 5'-end contiene una serie di 256 ripetizioni Laco che sono vincolati da RFP-Laci (rosso) e contrassegnare il sito d'integrazione del gene. Induzione trascrizionale da parte del promotore minimo CMV è raggiunto dal legame di invertire tetraciclina attivatore trascrizionale (rtTA o Tet-On) per Tet-responsive elementi (TRE) in presenza di dox. L'mRNA trascritto contiene la sequenza codificante per CFP-β-actina, e 24 MS2 ripete che sono vincolati dal YFP-MS2 proteina di fusione. Alla 3'-end, una porzione di una β-globina di coniglio esone-esone-introne modulo è seguito da una scissione-polyA segnale. Lo schema descrive anche il test di allungamento mostrando MS2 proteine fluorescenti (giallo), collegato al mRNA appena trascritto trascritti da RNA Pol II. (B) Un sito trascrizione attivo (YFP-MS2, la cella a destra) è stato fotodecolorate e il recupero di fluorescenza è stato rintracciato nel tempo (frame in basso). Abbiamo misurato l'intensità di fluorescenza di entrambi i candeggina (linea centrale) e non sbiancato (bottom line) siti di trascrizione attivo. Si noti la cella a sinistra non è adatto per un esperimento fotoscolorimento. (C) Le misure sperimentali effettuate sui siti gene CFP-actina trascrizione. In blu le curve il recupero della YFP-MS2 misure FRAP. In rosso, un non-sbiancata cella da lo stesso esperimento che mostra la YFP-MS2 segnale nel sito trascrizione allo stato stazionario.
Figura 2. (A) Schema del modello che descrive la cinetica entrata e uscita degli mRNA marcati con YFP-MS2 molecole sul sito della trascrizione. (B) YFP-MS2 dati FRAP e la simulazione dotata (la media di dieci esperimenti è stato montato sul modello) . I residui calcolato del fit sono riportati in basso.
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Discussion
Il metodo per la misurazione dell'attività cinetica polimerasi nelle cellule viventi possono essere suddivisi in due parti. La prima parte descrive la procedura di 'umido', che consente la misurazione e il recupero dei dati cinetici di trascrizione mRNA, mentre nella seconda parte, i dati vengono analizzati utilizzando un modello ODE. 5 Una serie di studi hanno utilizzato questo metodo per l'estrazione cinetica di trascrizione nelle cellule viventi 5, 6, 8, 12-14. La principale differenza tra questi studi è stato il modo in cui è stato convertito la curva di recupero FRAP in parametri cinetici. In molti casi un modello matematico è usato. Un modello deve descrivere il processo biologico in maniera semplice ed è quindi confrontato con i dati FRAP. Una volta che c'è una buona correlazione tra i dati e il modello, si dovrebbe verificare il modello da ulteriori esperimenti biologici, come le misurazioni degli effetti del farmaco o di confronto tra geni diversi.
E 'possibile prendere l'analisi di cui sopra ulteriormente per ottenere ulteriori risultati cinetica. Per esempio, utilizzando una forma photoactivatable della proteina fluorescente MS2 è possibile photoactivate trascritti mRNA già generato e seguire il loro rilascio (= riduzione in VS intensità il recupero del segnale misurato by FRAP) dal sito di trascrizione. 5 Inoltre, mentre FRAP di MS2 tagged cinetica allungamento misure mRNA solo, FRAP di GFP-RNA Pol II sul sito trascrizione produce la cinetica di tutto il processo di trascrizione, cioè, pre-iniziazione, l'iniziazione, l'allungamento e la terminazione 5, 13, 15, 16.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
YS-T è sostenuta dal Consiglio europeo della ricerca (CER), la Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israele Cancer Research Fund (ICRF), tedesco-israeliano Fondazione per la ricerca scientifica e lo sviluppo (GIF ), Stati Uniti-Israele binazionale Science Foundation (BSF), tedesco-israeliano di cooperazione Project (DIP), ei ministeri israeliani della scienza e della Salute, ed è il Jane Stern Fellow Famiglia LeBell in Scienze della vita alla Bar-Ilan University. YB è grato alla Fondazione Azrieli per l'assegnazione di una borsa Azrieli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | ||
| FuGENE 6 transfection reagent | Roche Group |
References
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