Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Het meten van de kinetiek van mRNA transcriptie in Single levende cellen

doi: 10.3791/2898 Published: August 25, 2011

Summary

RNA polymerase II transcriptionele kinetiek worden gemeten op specifieke genen in levende cellen. mRNA getranscribeerd van het gen van belang zijn fluorescent gelabeld en het gebruik van Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) de in vivo kinetiek van transcriptionele rek worden verkregen.

Abstract

De transcriptionele activiteit van RNA polymerase II (Pol II) is een dynamisch proces en dus het meten van de kinetiek van de transcriptie proces in vivo is van belang. Pol II kinetiek is gemeten met behulp van biochemische of moleculaire methoden. 1-3 In de afgelopen jaren, met de ontwikkeling van nieuwe visualisatie methoden, is het mogelijk geworden om transcriptie te volgen als het zich voordoet in real-time in enkele levende cellen. 4 Hierin beschrijven we hoe uit te voeren analyse van de Pol II rek kinetiek op een specifiek gen in levende cellen. 5, 6 Het gebruik van een cellijn, waarin een specifiek gen locus (DNA), de mRNA product, en het uiteindelijke eiwit fluorescent product kan worden geëtiketteerd en gevisualiseerd in vivo , is het mogelijk om de werkelijke transcriptie van mRNA te detecteren op het gen van belang. 7, 8 Het mRNA wordt fluorescent gelabeld met het MS2 systeem voor tagging mRNA in vivo, waar de 3'UTR van het mRNA transcripts bevatten 24 MS2 stam-lus herhaalt, die zeer specifieke bindingsplaatsen voor de YFP-MS2 laag eiwit dat het mRNA labels zoals het is overgeschreven te bieden. 9 Om de kinetiek van transcriptie we het Fluorescence Recovery gebruik Na Photobleaching (FRAP) methode te controleren. Door fotobleken de YFP-MS2-gelabeld ontluikende transcripten op de site van transcriptie en vervolgens na het herstel van dit signaal in de tijd, we de synthese snelheid van de nieuw gemaakte mRNA's te verkrijgen. 5 Met andere woorden, YFP-MS2 fluorescentie herstel weerspiegelt de generatie van de nieuwe MS2 stam-lussen in de opkomende transcripties en hun binding door TL-free YFP-MS2 moleculen die van de omringende nucleoplasm. De FRAP herstel curves zijn vervolgens geanalyseerd met behulp van wiskundige mechanistische modellen geformaliseerd door een reeks van differentiaalvergelijkingen, om de kinetische parameters tijd van de transcriptie te halen.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het gebruikte cel systeem moet bevatten een geïntegreerde genconstruct dat MS2 herhalen sequenties voor het coderen van de mRNA in levende cellen bevat. In dit protocol gebruiken we een menselijke cellijn U2OS drager zijn van een stabiel geïntegreerde β-actine-gen, dat fluorescent gelabeld is aan het DNA, RNA en eiwit niveau 8, als volgt (Figuur 1A): De 5 'van het gen lac operator bevat ( LACO) herhaalt - deze worden gebruikt om het gen (DNA) tag en daarmee identificeren van de genomische locus van integratie. Een fluorescent gelabelde lac repressor eiwit (Laci) zal binden aan de Laco herhaalt en tag het DNA. De mRNA's worden gelabeld met YFP-MS2 eiwitten die zich binden aan de MS2 herhalingen (stam-loops). Het gen product is het GVB-actine en dus inductie van het gen zal resulteren in het ontstaan ​​van de GVB-gelabeld actine cytoskelet. Het genconstruct is getransfecteerd in een U2OS Tet-On stabiele cellijn en de uitdrukking daarvan is onder Tet transcriptionele controle.

1. Cel plating en transfectie:

  1. 48 uur voor de metingen, zaad ~ 2 * 10 5 cellen op glas bodem weefselkweek gerechten (35 mm petrischaaltjes met een 14 mm glazen bodem microwell (0.16-0.19 mm dik;. Cat No P35G-1.5-14-C , MatTek, Ashland, MA)). Voeg 2 ml medium aan de cellen, om 50-80% confluentie bereiken.
  2. 24 uur voor het experiment, tijdelijk transfecteren de cellen met constructies die de fluorescerende markers voor het coderen van de DNA en het mRNA uit te drukken. Gebruik FuGENE6 transfectiereagens (Roche).
    De gebruikte constructen:
    1. YFP-MS2-NLS zal de tag MS2 stam-lussen in de mRNA transcripten. De nucleaire lokalisatie volgorde (NLS) biedt de nucleaire ingang volgorde voor de YFP-MS2 eiwit.
    2. optioneel - CFP-Laci of RFP-Laci die bindend is voor de LACO herhaalt in de 5 'van het gen en zal het gen locus label. Tagging het gen locus helpt bij het volgen van het gen tijdens de FRAP experiment, maar is niet noodzakelijk.
  3. Incubeer de cellen gedurende ten minste 12 uur, goede expressie van de voorbijgaande getransfecteerde eiwitten (zie toelichting) te verkrijgen.
  4. 6 - 12 uur voor het experiment toe te voegen 1,5 ng / ml doxycycline (Sigma) om de cellen voor het activeren van het Tet-induceerbare CFP-actine-gen.

Opmerkingen:
* Het is belangrijk om niet te zeer hoge expressie van de getransfecteerde eiwitten te komen, zodat er geen van de signalen die speciaal verkregen uit de transcriptie site, ten opzichte van de achtergrond signaal masker. Niveaus van expressie kan worden gecontroleerd door: a) het instellen van de tijd tussen transfectie en het experiment, b) het veranderen van de sterkte van de promotor (bijv. CMV is sterker dan de L30 promotor), c) het toevoegen van een nucleaire export-signaal (NES) om de YFP-MS2-NLS eiwit, dat zal helpen verspreiden van de YFP signaal in de hele cel.

* De fluorofoor gebruikt voor de metingen dienen bij voorkeur fotostabiel zijn in de hele lange overnames, dus groen / geel emitting fluoroforen zijn beter dan rood fluoroforen. Informatie over de verschillende fluoroforen kan gevonden worden in ref 10.

* Bepaal dat de verschillende kanalen licht niet-bleed door naar elkaar. Gebruik dia's met daarin exemplaren voorzien van elk van de markers afzonderlijk, te meten in elke dia de intensiteit van beide kanalen, en vervolgens het berekenen van de doorbloeding.

2. FRAP:

Het experiment kan worden uitgevoerd op elke microscoop die in staat is zowel het verwerven van afbeeldingen en het uitvoeren van fotobleking met een laserstraal. Meestal worden FRAP experimenten uitgevoerd met een confocale laser scanning microscoop (CLSM). Echter, omdat in ons geval het experiment is relatief lang (15-30 min), en we zijn na een klein locus binnen de kern is het belangrijk om te kunnen het gen locus / transcriptie plaats te houden in focus in het hele experiment. Dit vereist een snelle beeldvorming in drie dimensies in de tijd (4D), en dergelijke acquisitie tarieven zijn moeilijk te verkrijgen met behulp van een scanning confocale microscoop. Daarom maken we gebruik van een 3D-FRAP systeem (Photometrics) gebouwd op een breed terrein Olympus IX81 microscoop (63x Plan-Apo, 1.4 NA) zijn uitgerust met een EM-CCD (Quant-EM, Roper), die beelden kunnen verwerven op hoge snelheid (tot 30 beelden / sec). Het systeem heeft 405 nm en 491 nm lasers die kunnen worden gesynchroniseerd met de camera in staat te stellen fotobleken op een bepaalde regio van belang (ROI) van het monster. De microscoop is uitgerust met een Lambda DG-4 lichtbron (Sutter) en een XY-en Z-stage (Prior) dat de snelle en accurate beeldvorming in de Z-as maakt. Alle apparatuur is geïntegreerd en gecontroleerd door Metamorph (Molecular Devices). De live-cell experimenten worden uitgevoerd bij 37 ° C met 5% CO 2 met behulp van een live-cell kamersysteem (Tokai).

  1. Procedure: Een half uur voor het experiment, zet de verwarming apparaat, microscoop en laser. Tijdens de ervaringment van de temperatuur moet constant blijven, anders zou kunnen veroorzaken focus verandert tijdens de lange overname tijden. Laser macht moet stabiel zijn voor een consistente vermogen.
  2. Synchroniseer de laser met de camera:
    1. Zoek naar een gebied in de plaat die niet bevat cellen (met behulp van DIC).
    2. Gebruik hetzelfde licht kanaal dat zal worden gebruikt voor de experimenten. Hier gebruiken we de 491 nm laser voor de YFP kanaal.
    3. Richt de laser naar het midden van de afbeelding.
    4. Gebruik de knop Synchroniseren (op voorwaarde dat macro).
    5. Probeer verschillende plekken in het veld om ervoor te zorgen dat de laser en de camera worden gesynchroniseerd.
  3. Kies een goede kandidaat cel voor het experiment. Hoewel we werken met stabiele cellijnen, vinden we dat niet alle cellen dezelfde expressie hebben. Goede kandidaten zouden zijn cellen die: a) een duidelijke YFP-MS2-gelabeld transcriptie plaats boven de diffuse YFP-MS2 achtergrond vertonen, en b) hebben voldoende vrije YFP-MS2 eiwit in de cel om zo te kunnen herstellen volledig nadat de fotobleken (voorbeeld in figuur 1B - vergelijk de twee cellen, de linker cel is niet een goede kandidaat voor het bleken).
  4. Kies de juiste meetomstandigheden. De FRAP procedure vereist het verwerven van vele beelden, en daarom is het belangrijk om evenwicht te vinden tussen een redelijke belichting tijden en het gebruik van zo weinig licht mogelijk te houden. Hoge lichtniveaus invloed kunnen zijn op de cel als gevolg van fototoxiciteit, en zal leiden tot fotobleking. Het wordt aanbevolen om imaging parameters constant tussen de verschillende experimenten.
    Cellen zijn afgebeeld in de YFP kanaal met 150 msec belichtingstijden, en in het GVB kanaal voor de detectie van CFP-Laci (genomische locus). Naar aanleiding van de CFP-Laci gelabeld locus kan de detectie van het gen, zelfs wanneer de YFP-MS2 mRNA signaal photobleached (optioneel). Voor elke aankoop, 7 Z-schijfjes worden elke 350 nm. De actieve transcriptie site is gebleekt met behulp van de 491 nm laser.
  5. Voer de volledige experiment, maar zonder bleken. De FRAP experiment meet de tijd die het duurt voor de transcriptie site om terug te keren naar steady-state. Allereerst willen we controleren of de actieve transcriptie site is functioneel en stabiel bij steady state. Daarom voeren we een compleet FRAP experiment, maar zonder bleken om ervoor te zorgen dat de gemeten intensiteit van de transcriptie site niet veranderen tijdens het experiment tijdsbestek. We maken gebruik van dit experiment om ook onze beeldvorming omstandigheden te testen door het meten van de totale fotobleken veroorzaakt door de volledige imaging-serie. Als een vuistregel, moet de volledige film photobleach niet meer dan 30% van de oorspronkelijke intensiteit. Dit kan worden gemeten met behulp van de intensiteit verhouding van dezelfde plek in de kern van het laatste beeld, gedeeld door eerste beeld (verhouding moet groter zijn dan 0,7).
  6. FRAP: De YFP-MS2 signaal op de actieve transcriptie site is gebleekt met behulp van de 491 nm laser. 6 pre-bleach beelden worden verkregen. Post-bleekmiddel beelden worden verworven in een reeks van 3 keer frequenties: 15 foto's om de 3 sec, 15 afbeeldingen om de 6 sec, en 26 (of 45 voor lange experimenten) beelden om de 30 sec. De veranderingen in de frequentie van het verwerven van foto's maakt het mogelijk om meer afbeeldingen te verwerven in de tijd dat de hoogste intensiteit te veranderen (eerste herstel), en minder foto's aan het einde laten zien wanneer de veranderingen in de signaal zijn minder prominent aanwezig.

Opmerkingen: Dit experiment verschilt van "gewone" FRAP in dat:
* FRAP van mRNA aan de transcriptie locatie meet de binding van YFP-MS2 eiwitten om de ontluikende mRNA, terwijl de typische FRAP experimenten van de mobiliteit van verschillende eiwitten te meten in de cel. Daarom is er geen interesse in het meten van de diffusie pool van YFP-MS2 eiwitten. Wanneer de tijd tussen bleken en de eerste verworven afbeelding is relatief lang is het mogelijk om negeren dit diffunderende pool van free YFP-MS2 eiwitten.

* Sinds het herstel van de YFP-MS2 signaal is relatief lang (15-30 min), is het belangrijk om de transcriptie plaats te houden in focus. Daarom is een reeks van Z-schijfjes wordt verkregen op elk tijdstip.

3. Normalisering van de FRAP gegevens:

De 4D FRAP gegevens worden geanalyseerd met behulp van de gratis Image analyse software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Hieronder vindt u de analyse uitgevoerd met macro's beschikbaar via de ImageJ software, maar uiteraard zelf geschreven macro's kunnen worden gegenereerd.

  1. Z-stacks zijn maximale geraamd op elke keer-punt, wat resulteert in een 2D-film na verloop van tijd voor verdere analyse.
  2. De transcriptie site is bijgehouden in elk frame en de gemiddelde intensiteit wordt gemeten met behulp van de Spot Tracker tool. 11 De gegevens worden opgeslagen in een Excel-sheet voor verdere analyse.
  3. Voor elke keer-punt, zijn de gemiddelde intensiteiten op andere regio's van belang (ROI) als volgt gemeten (met behulp van de Time Series Analyzer plug-in van ImageJ): a) De rugde grond is afkomstig uit een ROI buitenkant van de cel = B (t). b) Een ROI in de nucleoplasm, maar zo ver mogelijk van het bleekmiddel site = C (t). c) De transcriptie site = S (t) (zoals gemeten door de spot tracker).
  4. Corrigeer de gegevens voor fotobleken veroorzaakt tijdens beeldvorming: Trek de achtergrond van alle andere metingen en vervolgens te corrigeren het bleekmiddel. Sc (t) is de gecorrigeerde intensiteit van de transcriptie plaats op tijdstip t.

eq. 1:
Vergelijking 1

  1. Normaliseren van de gegevens: in de eerste berekent het gemiddelde van de pre-bleekmiddel beelden, die de intensiteit van de transcriptie site toont bij steady-state (= <Sc (pre-bleach)>).

Vervolgens normaliseren van de gegevens:

eq. 2
Vergelijking 2

De gegevens worden genormaliseerd voor ten minste 10 experimenten. Bereken het gemiddelde van de experimenten en de standaard deviatie (STD) voor de fout-bars op elk tijd-punt (figuur 1C).

Opmerkingen:
De verspreiding van de YFP-MS2 eiwit tijdens de FRAP analyse buiten beschouwing gelaten, omdat de diffusiesnelheid van de vrije nucleoplasmatische YFP-MS2 is zeer snel, terwijl de gebonden YFP-MS2 is geassocieerd met een hoge affiniteit voor het mRNA, en niet vast aan de transcriptie site. Dit is de reden waarom het eerste beeld na het bleken moet worden verwijderd voordat de analyse.

4. Het analyseren van de gegevens met behulp van een wiskundig model:

Met het oog op de kinetische parameters van dit soort gegevens op te halen, hebben we de eenvoudigste beschreven model dat dit soort gegevens kunnen passen. De volledige uitleg van dit specifieke model kan hier 5 te lezen. Het model bevat de volgende vergelijkingen dat de regeling beschreven in figuur 2A:

Vergelijking 3
Vergelijking 4

Het hebben van de modelparameters, is het mogelijk om de berekening van de rek tarief:

Vergelijking 5

Analyseerden we de curve met behulp van Berkeley Madonna ( http://www.berkeleymadonna.com ), zoals eerder gemodelleerd 5, maar andere opties zijn beschikbaar (MatLab, Virtual Cell, COPASI etc.). De gegevens geschikt was om het model en de snelheidsconstanten werden geëxtraheerd. Wij hechten de code in Berkeley Madonna. Met het oog op de beste passen bij de gegevens die we berekend dat de steady state en dan passen de genormaliseerde experimentele data om de genormaliseerde model.

5. Representatieve resultaten:

We photobleached de gelabelde mRNA signaal op de actieve transcriptie website met behulp van high power laser, en volgde het herstel van de YFP-MS2-signaal in de tijd. De fluorescerende signaal bij de transcriptie site bestaat uit de steady-state kinetiek van mRNA-synthese en mRNA vrijgelaten uit de site. Het meten van transcriptie locatie de intensiteit in de tijd zonder bleken geeft een 'constante' signaal (figuur 1C, de rode stippen), dat betekent dat dit gen zich momenteel in een relatief stabiele toestand. Dit betekent dat het signaal dat zich ophoopt op de nieuw getranscribeerde mRNA is gelijk aan het signaal dat laat wanneer een mRNA wordt vrijgelaten uit de transcriptie site. Wanneer photobleached, dit systeem verder in de steady-state, maar is het nu mogelijk om te meten de tijd die het duurt voor het signaal om te herstellen. Daarom is het herstel van de fluorescentie hangt meestal af van de rek eigenschappen van het polymerase. Het 3D-FRAP systeem kon de overname van het volledige 3D-nucleaire volume tijdens FRAP herstel, en daardoor geen signaal verloren is gegaan tijdens de experimenten. Voor de berekening van de kinetische parameters van de gegevens, was de genormaliseerde curve gemonteerd op de kinetische model beschrijft rek, die gebaseerd is op differentiaalvergelijkingen. 5 Het voordeel van het gebruik van een eenvoudige ODE-model is dat het kan geschikt zijn om slechts een klein aantal parameters . De eerste stap van het model (entry point) is rek, namelijk het proces verantwoordelijk is voor het synthetiseren van nieuwe MS2-bindingsplaatsen. Het einde stap (uitgang) is mRNA introductie in het nucleoplasm. Het model is gebaseerd op het herstel curves, die bestaan ​​uit twee componenten kinetisch opgelost, een snelle en een langzamere. De snelle component verwijst naar de rek, terwijl de langzamere component werd gemodelleerd als polymerase te pauzeren tijdens het rek. De twee polymerase staten werden gemodelleerd als rek met een stochastisch overgang naar pauzeren. We geoptimaliseerd de differentiaalvergelijkingen van dit model, dat een verlenging snelheid van 3,3 kb / minuut leverde met een stochastisch overgang naar een langzamer synthese tarief (pauzeren voor een cumulatieve tijd van 2,5 minuten). Modellering toonde that deze overgang van rek tot pauzeren aangetast slechts 11% van de polymerasen die rek ingevoerd.

K uit 0.0112
K pause_in 0.0015
K pause_out 0.0067
Rek de tijd (K op + k pause_out) -1 56 sec
Pauzetijd (K pause_out) -1 2,5 minuten
Pauze waarschijnlijkheid (K pause_in) / (K + k pause_in uit) 11%

Tabel 1. Het model resulteert in een parameter tabel.

Figuur 1
Figuur 1. (A) Het experimentele cel systeem dat gebruikt wordt voor de volgende genexpressie in vivo. Schematische weergave van het GVB-actine-gen te bouwen. Het 5'-uiteinde bevat een reeks van 256 Laco herhalingen die gebonden zijn door RFP-Laci (rood) en markeert de plaats van gen-integratie. Transcriptionele inductie van de minimale CMV promoter wordt bereikt door de binding van omgekeerde tetracycline transcriptionele activator (rtTA of Tet-On) naar Tet-responsieve elementen (tres) in de aanwezigheid van DOX. De getranscribeerde mRNA bevat de coderende sequentie voor het GVB-β-actine, en 24 MS2 herhaalt die gebonden zijn door de YFP-MS2 fusie-eiwit. Aan het 3'-uiteinde, is een gedeelte van een konijn β-globine-exon-intron-exon-module, gevolgd door een decollete-polyA signaal. De regeling beschrijft ook de rek test met fluorescerende eiwitten MS2 (geel) aangesloten op de nieuw uitgeschreven mRNA getranscribeerd door RNA-Pol II. (B) Een actieve transcriptie site (YFP-MS2, rechterhand cel) was photobleached en de fluorescentie herstel werd gevolgd na verloop van tijd (frames op de bodem). We maten de fluorescentie-intensiteit van de beide bleekmiddel (middelste lijn) en niet-gebleekt (onderste lijn) actief transcriptie sites. Let op de linker cel is niet geschikt voor een photobleaching experiment. (C) Het experimentele metingen uitgevoerd op de GVB-actine-gen transcriptie sites. In blauw het herstel rondingen van de YFP-MS2 FRAP metingen. In rood, een niet-gebleekte cel van hetzelfde experiment met de YFP-MS2 signaal op de transcriptie plaats bij steady state.

Figuur 2
Figuur 2. (A) Schema van het model beschrijft de ingang en uitgang kinetiek van mRNA's zijn gemarkeerd met YFP-MS2 moleculen op de transcriptie site. (B) YFP-MS2 FRAP gegevens en het voorzien van simulatie (het gemiddelde van de tien experimenten was aangebracht op het model) . De berekende residuen van de fit worden gepresenteerd aan de onderkant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De methode voor het meten van polymerase kinetische activiteit in levende cellen kunnen worden onderverdeeld in twee delen. Het eerste deel beschrijft de 'natte' procedure die het meten en het ophalen van de kinetische gegevens van mRNA transcriptie mogelijk maakt, terwijl in het tweede deel, de gegevens worden geanalyseerd met behulp van een ODE-model. 5 Een aantal studies hebben inmiddels deze aanpak voor de extractie gebruikt transcriptie kinetiek in levende cellen 5, 6, 8, 12-14. Het grote verschil tussen deze studies was de manier waarop de FRAP herstel curve werd omgezet in kinetische parameters. In veel gevallen is een wiskundig model wordt gebruikt. Een model moet een beschrijving van de biologisch proces op een eenvoudige manier en het is vervolgens vergeleken met de FRAP gegevens. Zodra er een goede correlatie tussen de gegevens en het model, moet men het model te verifiëren door extra biologische experimenten zoals het meten van effecten van geneesmiddelen of het vergelijken tussen de verschillende genen.

Het is mogelijk om de bovenstaande analyse verder te nemen om extra kinetische resultaten te verkrijgen. Bijvoorbeeld door middel van een fotoactiveerbare vorm van het MS2 fluorescent eiwit is het mogelijk om al gegenereerd mRNA transcripten photoactivate en hun vrijlating (= afname van de intensiteit versus het herstel van het signaal gemeten door FRAP) volgen uit de transcriptie site. 5 Bovendien, terwijl de FRAP van MS2 gelabelde mRNA's maatregelen rek kinetiek alleen FRAP van GFP-RNA Pol II op de transcriptie plaats levert de kinetiek van het hele proces van transcriptie, namelijk pre-initiatie, initiatie, rek en beëindiging 5, 13, 15, 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

YS-T wordt ondersteund door de European Research Council (ERC), de Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Israël Cancer Research Fund (ICRF), Duits-Israëlische Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek en Ontwikkeling (GIF ), de VS-Israel Binationale Science Foundation (BSF), Duits-Israëlische Project Samenwerking (DIP), en de Israëlische ministeries van Wetenschap en Gezondheid, en is het Jane Stern Lebell Familie Fellow in Life Sciences aan de Bar-Ilan Universiteit. YB is dankbaar voor de Azrieli Stichting voor de toekenning van een Azrieli gemeenschap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxycycline Sigma-Aldrich
FuGENE 6 transfection reagent Roche Group

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wada, Y. A wave of nascent transcription on activated human genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 18357-18361 (2009).
  2. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol. 16, 1128-1133 (2009).
  3. Brody, Y., Shav-Tal, Y. Visualizing transcription in real-time. Cent Eur J Biol. 3, 11-18 (2008).
  4. Lamond, A. I., Swedlow, J. R. RNA polymerase II transcription in living color. Nat Struct Mol Biol. 14, 788-790 (2007).
  5. Darzacq, X. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 14, 796-806 (2007).
  6. Boireau, S. The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol. 179, 291-304 (2007).
  7. Janicki, S. M. From silencing to gene expression; real-time analysis in single cells. Cell. 116, 683-698 (2004).
  8. Ben-Ari, Y. The life of an mRNA in space and time. J Cell Sci. 123, 1761-1774 (2010).
  9. Shav-Tal, Y. Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. Science. 304, 1797-1800 (2004).
  10. Kremers, G. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J. Cell Sci. 124, 157-160 (2011).
  11. Sage, D., Neumann, F. R., Hediger, F., Gasser, S. M., Unser, M. Automatic tracking of individual fluorescence particles: application to the study of chromosome dynamics. IEEE Trans Image Process. 14, 1372-1383 (2005).
  12. Yunger, S., Rosenfeld, L., Garini, Y., Shav-Tal, Y. Single-allele analysis of transcription kinetics in living mammalian cells. Nat Methods. 7, 631-633 (2010).
  13. Brody, Y. The in vivo kinetics of RNA polymerase II elongation during co-transcriptional splicing. PLoS Biol. 9, e1000573-e1000573 (2011).
  14. Munoz, M. J. DNA damage regulates alternative splicing through inhibition of RNA polymerase II elongation. Cell. 137, 708-720 (2009).
  15. Hieda, M., Winstanley, H., Maini, P., Iborra, F. J., Cook, P. R. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. Chromosome Res. 13, 135-144 (2005).
  16. Kimura, H., Sugaya, K., Cook, P. R. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. J Cell Biol. 159, 777-782 (2002).
Het meten van de kinetiek van mRNA transcriptie in Single levende cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brody, Y., Shav-Tal, Y. Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells. J. Vis. Exp. (54), e2898, doi:10.3791/2898 (2011).More

Brody, Y., Shav-Tal, Y. Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells. J. Vis. Exp. (54), e2898, doi:10.3791/2898 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter