Summary
כאן אנו מציעים שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים ו בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תרבויות.
Abstract
היפוקסיה מוגדרת הפחתה או חוסר חמצן איברים, רקמות, או תאים. זו ירידה של מתח החמצן יכול להיות בשל אספקת חמצן מופחת (סיבות כוללות כלי דם מספקת הרשת, כלי דם פגומים, ואנמיה) או לצריכה מוגברת של חמצן ביחס לאספקת (הנגרם על ידי קצב התפשטות פתאומית גבוהה התא) . היפוקסיה יכול להיות פיזיולוגי או פתולוגי כגון סרטן מוצק 1-3, וכו 'שגרונית, דלקת פרקים טרשת עורקים ... כל רקמות ותאים יש יכולת שונה להסתגל למצב החדש הזה. במהלך היפוקסיה, גורם היפוקסיה ועין מתנהלת אלפא (HIF) הוא התייצב מסדיר גנים שונים כגון המעורבים אנגיוגנזה או הובלה של חמצן 4. ההתייצבות של חלבון זה הוא סימן ההיכר של היפוקסיה, ולכן גילוי HIF משמש באופן שגרתי למסך עבור 5-7 היפוקסיה.
במאמר זה, אנו מציעים שתי שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים יונקים בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תאים אלה.
Protocol
1. היפוקסיה המושרה על ידי פתרון 2 CoCl
קובלט (II) hexahydrate כלוריד (CoCl 2 • 6 שעות 2 O, מגה = 237.9) הוא inducer הכימי של היפוקסיה, גורם ועין מתנהלת 1.3-8. מוצר זה הוא מסיס במים (100 מ"ג / מ"ל), מניב פתרון ברור, אדום.
- הכן פתרון מניות 25mm במים dd סטרילי, (להכין מיד לפני השימוש)
- השתמש CoCl 2 בריכוז הסופי של 100μM בתרבות המדיה שלך סדיר תא לגרום היפוקסיה.
- מוסיפים את CoCl 2 מדיה המכילה תאים שלך דגירה התרבויות עבור 24hours בתוך חממה קונבנציונאלי (37 ° C; 2 C0 5%).
הריכוז הנ"ל עובד עבור שורות תאים בדקנו אבל כל שורת תאים יש לבדוק בריכוזים שונים (להקים עקומת המינון תלוי), כמו גם בזמנים דגירה שונים, במטרה לצמצם רעילות התרופה הקשורות לייעל את assay.
2. היפוקסיה המושרה מודולרי החממה הקאמרית
- הכן לפחות שני בתרביות תאים זהים (תרבות תאומים). תרביות תאים יכול להיות צלוחיות, צלחות או כלים התרבות. כדי לפתוח את החדר, פתח תחילה את שני מהדק פלסטיק לבן הממוקם על צינורות המחוברים תא (צינורות המשמשים הזריקה / טיהור הגז hypoxic) בעדינות לפתוח את מהדק טבעת פלדה.
- שחרר את מהדק. המכסה ומגשים כעת ניתן להסיר.
- מניחים את התרבות התאים בתא hypoxic. כמו כן במקום צלחת פטרי המכילה מים סטריליים בחדר לספק humidification נאותה התרבויות.
- מניחים את תרבות "התאום" תא normoxia כמו שליטה.
- ודא המגשים שלך מובטחות ולא נעים, ולאחר מכן סגור את תא עם מכסה שלו. נכונה עמדת מהדק טבעת פלדה כדי להבטיח את סגירת hermetical של החדר וסגור אותו.
- כדי ליצור היפוקסיה, לצרף את צינורות עד "טנק היפוקסיה" המכיל 1% O 2 תערובת הגזים. אם יש לך מד זרימת מחובר הטנק שלך בחדר שלך יהיה מחובר ישירות אליו (טנקים זרימת הגז מטר קאמרית). אנו משתמשים מד זרימת שולבו הרגולטור שלנו.
- חשוב להסיר את רוב אם לא כל הנוכחים חמצן בתא ובתקשורת שלך, לעשות זאת לשטוף את החדר על ידי פתיחת מיכל הדלק בקצב זרימה של 20 ליטר דקות 70-10 דקות, ואז מהר לכבות את דלק הזרימה לגמרי לסגור את חדר על ידי סגירת שני מלחציים לבן.
- החזר את תא אל חממה קונבנציונאלי לתקופה הרצויה של זמן. אם אתה משתמש תרבויות גדולות, לאפשר התקשורת בתרבויות דה גז במשך 1-2 שעות ולאחר מכן חזור על לשטוף.
הצעדים שלעיל מבוססים על המלצות בנאי "(Billups-רוטנברג, Inc). הקפד מיכל הדלק מאובטחים כראוי בכל עת.
הערות:
- כדי לחסל את O 2 הכלול התקשורת מומלץ גז מחדש את החדר פעם אחת לאחר 1-3hours.
- זמן הדגירה יותר 48hours מומלץ גם לחדר מחדש גז.
- חיישני חמצן (אלקטרודות / מד הלחץ), אשר מאפשרים מדידות של O 2 הכלול תאים / תא תספק מדידה מדויקת יותר של תאיים / תא O 2 מכילים).
- תאים culturing ב אורכים זמן שונים כדי ליצור זמן עקומת יעזור לקבוע את הביטוי זמן אופטימלי של HIF-1α בתאים הספציפית שלך.
3. הערכה של היפוקסיה
- HIF-1 α זיהוי על ידי כתם המערבי.
- פתח מחדש החדר שלך כמתואר בסעיף 2.2 ומיד המקום תרבויות שלך על קרח.
- Lyse תאים שטופלו ולא טופלו היפוקסיה עם פתרון SDS 5% הצלחות מכן להעביר את lyzate התא צינורות, sonicate, spindown פסולת התא לאסוף את supernatant.
- מדידת ריכוז חלבון באמצעות ערכת BCA, להכין מדגם ידי הוספת מאגר טעינת וחימום ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- Electrophorese חלבונים על ג'ל SDS-polyacrylamide 8% ולהעביר ממברנות Nitrocellulose.
- חסום את הממברנה ב PBS המכילה 5% שומן חלב שאינו יבש 0.1% Tween 20 בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C במשך הלילה על שייקר.
- Immunoblot לילה עם נוגדן אנטי-HIF 1α חד שבטיים העיקרית (1 / 600) במאגר באותו 4 ° C.
- לשטוף 3 פעמים PBS המכיל 0.1% Tween 20 בטמפרטורת החדר, 5min כל זמן דגירה עם נוגדן HRP-משנית (1 / 2000) ב-PBS + 0.1% Tween 20 דקות 45.
- לשטוף 3 פעמים PBS המכיל 0.1% Tween 20 בטמפרטורת החדר, 5min / שעה.
- השתמש פירס ECL ערכת רנטגן הסרט להראות את הלהקה חלבון
- אלמנט Responsive היפוקסיה (HRE).
HIF-1α מסדיר גנים רבים (כלומר VEGF, EPO) על ידי קשירה רצף שנקרא אלמנט הסדרת היפוקסיה (HRE). HRE שימוש הקשורים לגן סמן iלא ניתן לזהות פעילות HIF 9. כדי להשתמש בשיטה זו, תחילה עליך transfect התאים שלך עם HRE-בלוציפראז הפלסמיד בשיטת transfection מותאם לתאים. לדוגמה השתמשנו Lipofectamine 2000. תאים צריכים להיות transfected לפחות 4 שעות לפני כדי להיות מודגרות ב היפוקסיה ו normoxia. זמן זה מאפשר ה-DNA כדי להזין את התאים כך זה הצעד הראשון אינו מושפע היפוקסיה. האות בלוציפראז מזוהה באמצעות ערכת Assay בלוציפראז.- דגירה תאים HRE-transfected שלך היפוקסיה בתא מודולרי או להשתמש HRE-transfected תאים מודגרות עם CoCl 2, כוללים שליטה normoxia.
- לאחר תקופת הדגירה הרצויה, להסיר בינוני צמיחה של תאים.
- יש לשטוף את התאים PBS, להסיר את PBS.
- לוותר 400μl מגיב תמוגה 1X לתוך צלחת תרבות לגרד תאים המצורפת, ולאחר מכן להעביר אותם צינורית המיקרו.
- גלולה פסולת על ידי צנטריפוגה קצר.
- 20μl מיקס של התא lysates supernatant עם 100μl של מגיב Assay בלוציפראז ולמדוד את הארה באמצעות luminometer.
4. נציג תוצאות:
ב K562 תאים (קו אנושי תא לוקמיה) בתרבית 2 ימים חמצן נמוכה, לעומת normoxia, היפוקסיה גורם גידול של החלבון HIF-1α כי זוהה על ידי כתם המערבי (איור 1).
שימוש ב-HRE בלוציפראז שונה 293 תאים (קו עובריים כליות) בתרבית היפוקסיה, עלייה משמעותית של פעילות HIF-1α זוהתה בתאי hypoxic (איור 2).
איור 1: הגדלת HIF-1α בתאים hypoxic. K562 התאים היו תרבות normoxia ו היפוקסיה (חוסר חמצן קאמרית) עבור 48 שעות ונותחו על ידי כתם המערבי באמצעות נוגדן ספציפי HIF-1α. נוגדנים ספציפיים עבור אקטין שימש לשלוט הטעינה.
Figure2: HIF-1α פעילות. HRE-בלוציפראז שונה היו 293 תאים בתרבית היפוקסיה ו normoxia עבור 48 שעות ו lysed אז לזהות אות בלוציפראז באמצעות ערכת assay בלוציפראז ו luminometer. תוצאות באים לידי ביטוי כיחידה הארה יחסית (RLU).
Discussion
התפשטות תאים הכדאיות בתנאים hypoxic להשתנות הרבה בהתאם לסוגי תאים. לכן, כדאי להתאים את מספר הנייד או מספר צלחות תרבויות אתה מתחיל עם לוודא יהיה לך מספיק תאים / חלבונים עבור הניסויים שלך.
השיטה קובלט כלוריד יש את היתרון להיות זול ומהיר. מוצר זה מחקה היפוקסיה ידי גרימת HIF-1/3α אך ניתן גם להסדיר גנים אחרים, יש לוודא כי מוצר זה להתאים את הפרוייקט על ידי בדיקת מה תופעות אחרות זה היה יכול להיות על התפקוד ואת הפנוטיפ של תאים מסוימים באופן עצמאי של "לחקות- אפקט hypoxic ". עוד תרופה המשמשת גם לחקות היפוקסיה היא mesylate Deferoxamine (DFO, השתמשו בריכוז 100 מיקרומטר הסופי). השימוש בתרופות אלה מאפשר experimentator כדי לפתוח את צלחת תרבות / תבשיל / בקבוקון פעמים רבות מבלי להשפיע על "מצב hypoxic".
רמת החמצן הכלול תערובת הגז יכול להשתנות בהתאם הניסויים שלך סוגי תאים כערכים היפוקסיה להשתנות בהתאם הרקמות סוגי תאים. ואכן, תאים מסוימים hypoxic ב 5% O 2 צריך אחרים פחות מ 1% O 2 להיות hypoxic. 5% CO 2 הוא הוסיף תערובת הגז כדי לייצב את pH של התרבויות, שאר הגז הוא בדרך כלל חנקן.
לתאי hypoxic יש את היתרון של שימוש בסמים לא יכול חלופי התנהגות התא עצמאי של מתח החמצן. עם זאת, לא כל סוגי ניסויים אפשר לעשות כמו חמצן החוזרת בפתיחת כל תא ובכך מפחית היפוקסיה. אתה צריך לשקול גורם זה בניסויים שלך; היפוקסיה / מחדש חמצון הוא מצב ספציפי אשר יכולים להשפיע על כמה סוגי תאים. חלופה היא להשתמש בתחנות עבודה היפוקסיה (מחובר טרום מעורבת בלוני גז או למערכות גז ערבוב) או היפוקסיה אינקובטור גדול (תא עיבוד היפוקסיה עם תא הכפפות) המאפשר ניסויים לשנות את התקשורת ולטפל תאים בסביבה hypoxic רציפה. לתאי hypoxic שונים כבר ממוסחר בעשור האחרון ו צריכים להיבחר על פי המעבדה שלך בשימוש, פרויקטים, מרחב, גודל התקציב. תמיד להבטיח את השימוש במצב טוב של החדר שלך כדי להבטיח את התנאים תרבות נכונה. באופן כללי בעת שימוש קאמרית, רמת היפוקסיה יכול להיות מווסתת על ידי בחירת תערובות גזים שונות (כלומר 1%, 5% -10% חמצן).
לגבי זיהוי של HIF-1α, חשוב לדעת כי חלק קו תאים סרטניים לבטא HIF-1α ב normoxia. לכן זה קריטי להשתמש normoxia שליטה לקבוע את רמת הבסיס של HIF אלה שורות תאים. HIF-1α יכול גם להיות נוכח normoxia שאינם תאים ממאירים הבאים גירוי התא או מתח. זה יכול להתרחש גם אם תאים אלה הם מורעבים, ודא בתרביות תאים שלך כמו שצריך להאכיל ומתוחזק.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma-Aldrich | C8661-25G | |
| Incubator Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| HRE-Luciferase plasmid | Addgene | Plasmid 26731 |
References
- Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).
- van Laarhoven, H. W. Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).
- Hockel, M. Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix. Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).
- Semenza, G. L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor. Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis. Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. HIF at a glance. J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).
- Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2. Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).
- Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a). Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).
