Summary
Aquí proponemos métodos sencillos para inducir la hipoxia en cultivos de células y pruebas sencillas para evaluar el estado de hipoxia de los cultivos.
Abstract
La hipoxia se define como la reducción o falta de oxígeno en órganos, tejidos o células. Esta disminución de la tensión de oxígeno puede ser debido a una reducción del suministro de oxígeno (causas incluyen la red insuficiente de los vasos sanguíneos, los vasos sanguíneos defectuosos, y anemia) o de un mayor consumo de oxígeno en relación con la oferta (causado por una tasa más alta proliferación de las células) . La hipoxia puede ser fisiológico o patológico como en tumores sólidos, etc 1-3, aterosclerosis artritis reumatoide, ... Cada uno de los tejidos y las células tienen una capacidad diferente para adaptarse a esta nueva condición. Durante la hipoxia, la hipoxia inducible factor alfa (HIF) se estabiliza y regula varios genes como los que participan en la angiogénesis o el transporte de oxígeno 4. La estabilización de esta proteína es una característica de la hipoxia, por lo tanto, la detección de HIF se utiliza habitualmente para la detección de la hipoxia 5-7.
En este artículo, se proponen dos métodos sencillos para inducir la hipoxia en cultivos celulares de mamíferos y pruebas sencillas para evaluar el estado de hipoxia de estas células.
Protocol
1. La hipoxia inducida por CoCl 2 solución
Cobalto (II) hexahidratado Cloruro (CoCl 2 • 6H 2 O, PM = 237,9) es un inductor químico del factor inducible por hipoxia 1,3 8. Este producto es soluble en agua (100 mg / ml), dando una solución clara, de color rojo.
- Prepare una solución madre 25 mM en agua estéril dd, (prepararse inmediatamente antes de su uso)
- Use CoCl 2 en la concentración final de 100μM en sus medios regulares de cultivo de células para inducir la hipoxia.
- Agregue el CoCl 2 medios que contienen a las células y se incuban los cultivos durante 24 horas en una incubadora convencional (37 ° C, 5% C0 2).
A la concentración de obras para las líneas celulares que hemos probado, pero cada línea celular debe ser probado en diferentes concentraciones (para establecer una curva dosis-dependiente), así como en diversos tiempos de incubación con el fin de limitar la toxicidad relacionada con las drogas y optimizar el ensayo.
2. Hipoxia inducida en Modular cámara de la incubadora
- Preparar al menos dos cultivos celulares idénticos (la cultura twin). Los cultivos de células pueden ser en cofres, los platos o la cultura. Para abrir la cámara, abrir por primera vez las dos abrazaderas de plástico blanco se encuentra en los tubos conectados a la cámara (tubos utilizados para la inyección / purgar el gas hipóxico) y abra suavemente el anillo de sujeción de acero.
- Suelte la abrazadera. La tapa y bandejas de ahora se puede quitar.
- Coloque el cultivo de células en la cámara de hipoxia. También colocar una placa de Petri que contiene agua estéril en la cámara para proporcionar humidificación adecuada de los cultivos.
- Coloque el "gemelo" de cultivo de células en normoxia como control.
- Asegúrese de que las bandejas están garantizados y no se mueve, y luego cerrar la cámara con su tapa. Correctamente la posición del anillo de sujeción de acero para garantizar el cierre hermético de la cámara y ciérrelo.
- Para crear la hipoxia, conectar el tubo a un "tanque de hipoxia", que contiene un 1% O 2 mezcla de gases. Si usted tiene un medidor de flujo conectado al tanque de su cámara se puede conectar directamente a él (el tanque de gas de flujo metros de la cámara). Nosotros utilizamos un medidor de flujo incorporado en nuestro organismo regulador.
- Es importante para la mayoría, si no eliminar todos los presentes oxígeno en la cámara y en sus medios de comunicación, para hacerlo al ras de la cámara mediante la apertura del tanque de gas con un caudal de 20 litros por minuto durante 7-10 minutos, y luego rápidamente apagar el flujo de gas y se cierra completamente la cámara mediante el cierre de dos pinzas blancas.
- Devolver la cámara a una incubadora convencional para el período de tiempo deseado. Si utiliza grandes culturas, que el material de las culturas de gas de 1 a 2 horas y luego repetir color.
Los pasos anteriores se basan en las recomendaciones constructor '(Billups-Rothenberg, Inc). Asegúrese de que el tanque de gas se fijan correctamente en todo momento.
Notas:
- Con el fin de eliminar el O 2 contenido en los medios de comunicación, se aconseja volver a la cámara de gas una vez después de 3 horas 1.
- Para el tiempo de incubación más largo que 48 horas también se recomienda a la cámara de re-gas.
- Los sensores de oxígeno (electrodos / manómetro) que permiten la medición de la O 2 contenido en células / cámara proporcionará una medición más precisa de la O intracelular / cámara de 2 contienen).
- El cultivo de células en diferentes longitudes de tiempo para hacer una curva de tiempo-podría ayudar a determinar el momento óptimo de expresión de HIF-1α en células específicas.
3. Evaluación de la hipoxia
- HIF-1 α detección por Western blot.
- Volver a abrir su cámara como se describe en la sección 2.2 e inmediatamente colocar sus cultivos en el hielo.
- Lisis de la hipoxia células tratadas y no tratadas con 5% de solución de SDS en las placas luego transferir el lyzate celular a los tubos, ultrasonidos, spindown los restos celulares y recoger el sobrenadante.
- Mediciones de concentración de proteínas utilizando BCA kit, preparar la muestra mediante la adición de tampón de carga y la calefacción a 95 º C durante 5 min.
- Electroforesis de proteínas en un 8% SDS-gel de poliacrilamida y la transferencia a membranas de nitrocelulosa.
- Bloquear la membrana en PBS que contenía 5% sin grasa leche en polvo y 0,1% Tween 20 a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 ° C durante la noche en la coctelera.
- Durante la noche con anti-HIF-1α anticuerpo monoclonal primario (1 / 600) en el mismo buffer inmunoblot a 4 ° C.
- Lavar 3 veces en PBS que contenía 0,1% de Tween 20 a temperatura ambiente, 5 minutos cada vez y se incuban con HRP-secundaria de anticuerpos (1 / 2000) en PBS + 0,1% Tween 20 durante 45 minutos.
- Lavar 3 veces en PBS que contenía 0,1% de Tween 20 a temperatura ambiente, 5 minutos / hora.
- Use Pierce ECL kit y películas de rayos X para mostrar la banda de la proteína
- Elemento Sensible hipoxia (HRE).
HIF-1α regula numerosos genes (es decir, VEGF, OEP), mediante la unión a una secuencia denominada Elemento de Regulación de hipoxia (HRE). Educación en derechos humanos asociados al uso de un gen marcador it es posible detectar la actividad de HIF 9. Para utilizar este método, primero que hay que transfectar las células con un plásmido de luciferasa HRE mediante un método de transfección adaptado a las células. Por ejemplo, podemos utilizar Lipofectamine 2000. Las células necesitan para ser transfectadas por lo menos 4 horas antes de ser incubados en hipoxia y normoxia. Este tiempo permite que el ADN de entrar en las células de modo que este primer paso no se ve afectada por la hipoxia. La señal de luciferasa se detectó mediante un Kit de ensayo de luciferasa.- Incubar la educación en derechos humanos, las células transfectadas en la hipoxia en la cámara modular o el uso de EDH-transfectadas las células se incubaron con CoCl 2, incluir un control de normoxia.
- Después del período de incubación se desea, eliminar el medio de cultivo de las células.
- Enjuague las células en PBS, retire la PBS.
- Dispensar 400μl del reactivo de lisis 1X en placa de cultivo y raspar las células adheridas, y luego los transferirá a un tubo de micro.
- Pellet los escombros por centrifugación breve.
- 20μl mezcla de lisados celulares sobrenadante con 100μl del reactivo de ensayo de luciferasa y medir la luminiscencia usando un luminómetro.
4. Los resultados representativos:
En las células K562 (línea de células humanas de leucemia) cultivadas en dos días con poco oxígeno, en comparación con normoxia, la hipoxia induce un aumento de HIF-1α proteína que se detectó por Western blot (Figura 1).
Utilizando HRE-luciferasa modificados células 293 (línea de células embrionarias de riñón) se cultivan en la hipoxia, un significativo aumento de HIF-1α se detectó actividad en las células hipóxicas (Figura 2).
Figura 1: Aumento de HIF-1α en células hipóxicas. K562 células fueron la cultura en normoxia e hipoxia (cámara de hipoxia) durante 48 horas y se analizaron por Western blot utilizando un anticuerpo específico para HIF-1α. Un anticuerpo específico para la actina se utilizó para el control de carga.
Figura 2: HIF-1α actividad. Educación en derechos humanos-luciferasa modificados 293 células fueron cultivadas en hipoxia y normoxia durante 48 horas y luego se lisaron para detectar la señal de luciferasa utilizando un kit de ensayo de luciferasa y un luminómetro. Los resultados se expresan como la unidad de luminiscencia relativa (RLU).
Discussion
La proliferación celular y la viabilidad en condiciones de hipoxia varían mucho en función de los tipos de células. Por lo tanto, usted debe ajustar el número de células o el número de placas de cultivo se comienza con asegurarse de que tendrá suficientes células / proteínas para sus experimentos.
El método de cloruro de cobalto tiene la ventaja de ser barato y rápido. Este producto reproduce mediante la inducción de hipoxia HIF-1/3α pero también pueden regular otros genes, asegúrese de que este producto se adapta a su proyecto mediante la comprobación de lo que otros efectos que podría tener sobre la función y el fenotipo de las células en particular, independientemente de la "imitar- hipóxica "efecto. Otro medicamento también se utiliza para imitar la hipoxia es el mesilato de deferoxamina (DFO, que se utiliza en 100 mM concentración final). El uso de estos fármacos permite al experimentador para abrir la placa de cultivo / plato / frasco muchas veces sin afectar a la "condición de hipoxia".
El nivel de oxígeno contenido en la mezcla de gas puede variar en función de sus experimentos y tipos de células como los valores de la hipoxia varían dependiendo de los tejidos y tipos celulares. De hecho, algunas células hipóxicas en el 5% O 2 necesidad de otras menos del 1% de O 2 a la hipoxia. 5% de CO 2 se añade a la mezcla de gases para estabilizar el pH de los cultivos, el resto del gas es generalmente nitrógeno.
Cámaras hipóxicas tiene la ventaja de no utilizar medicamentos que pueden alternar el comportamiento celular, independientemente de la tensión de oxígeno. Sin embargo, no todos los tipos de experimentación se puede hacer como el oxígeno vuelve a entrar en la cámara en cada abertura y por lo tanto disminuye la hipoxia. Debe tener en cuenta este factor en sus experimentos, la hipoxia / re-oxigenación es una condición específica que puede afectar a algunos tipos de células. Una alternativa es el uso de estaciones de trabajo de la hipoxia (conectados a los tanques de gas premezclado o los sistemas de mezcla de gases) o mayores hipoxia incubadora (cámara de tratamiento con la hipoxia de la guantera), que permite la experimentación de cambiar los medios de comunicación y de manipular las células en el ambiente hipóxico continua. Varias cámaras de hipoxia se han comercializado durante la última década y se debe elegir de acuerdo a su laboratorio utilizados, los proyectos, el espacio, tamaño y presupuesto. Asegúrese siempre de que el buen uso y condición de su cámara para garantizar las condiciones correctas de la cultura. En general cuando se utiliza una cámara, el nivel de hipoxia puede ser modulada por la selección de las mezclas de gases diferentes (es decir, un 1%, 5% al 10% de oxígeno).
En cuanto a la detección de HIF-1α, es importante saber que algunas líneas celulares cancerosas expresan HIF-1α en normoxia. Por tanto, es fundamental utilizar un normoxia-control para determinar el nivel basal de HIF en estas líneas celulares. HIF-1α también pueden estar presentes en normoxia en las células no malignas después de la estimulación de células o el estrés. Esto también podría ocurrir si estas células están hambrientas, asegúrese de que los cultivos celulares se alimentan adecuadamente y se mantiene.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma-Aldrich | C8661-25G | |
| Incubator Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| HRE-Luciferase plasmid | Addgene | Plasmid 26731 |
References
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