Summary
여기서 우리는 문화의 hypoxic 상태를 평가하는 세포 문화와 간단한 테스트에 hypoxia를 유발하는 간단한 방법을 제안합니다.
Abstract
Hypoxia는 기관, 조직 또는 세포에 산소의 감소 또는 결여로 정의됩니다. 산소 장력의이 감소는 산소의 감소 공급 장치 (원인이 부족한 혈관 네트워크 결함이 혈관과 빈혈을 포함)하거나 공급 장치 (갑자기 높은 세포 증식 률에 의한)에 상대적으로 산소의 증가 소비로 인해 수 . Hypoxia는 1-3, 류마티스 관절염, 죽상 경화증 등 고체 암에서와 같이 physiologic 또는 pathologic 수 있습니다 ... 각 조직과 세포는이 새로운 조건에 적응하기 위해 다른 기능이 있습니다. hypoxia 동안, hypoxia inducible 요인 알파 (HIF)를 안정화와 같은 산소 4 angiogenesis 또는 운송에 관련된 사람 등 다양한 유전자를 조절합니다. 이 단백질의 안정화 따라서 HIF가 일상적으로 hypoxia 5-7위한 화면으로 사용됩니다 감지, hypoxia의 특징이다.
이 문서에서는, 우리는 이들 세포의 hypoxic 상태를 평가하는 포유 동물 세포 배양 및 간단한 테스트에 hypoxia를 유도하기 위해 두 가지 간단한 방법을 제안합니다.
Protocol
1. CoCl이 솔루션 유도 Hypoxia
코발트 (II) 염화물 hexahydrate은 (CoCl 2 • 6H 2 O, MW = 237.9) hypoxia - inducible 인자 - 1.3 8 화학 유도합니다. 이 제품은 명확하고 붉은 솔루션을 항복, 물 (100 MG / ML)에 용해됩니다.
- 무균 DD 물에 25mM 재고 솔루션을 준비, (사용하기 전에 바로 준비)
- hypoxia를 유발하여 일반 세포 배양 매체 100μM의 최종 농도에서 CoCl 2를 사용하십시오.
- 당신의 세포에 CoCl이 포함된 미디어를 추가하고 기존의 인큐베이터에 24시간에 대한 문화를 품다 (37 ° C; 5% C0 2).
위의 농도는 우리가 테스트를했지만 각 세포주 마약 관련 독성을 제한하고 분석을 최적화하기 위해 다양한 배양 시간뿐만 아니라 다양한 농도 (복용 종속 곡선을 설정)에서 테스트해야하는 세포 라인에 적용됩니다.
2. 모듈형 보육 회의소에서 유도된 Hypoxia
- 적어도 두 개의 동일한 (트윈 문화) 세포의 문화를 준비합니다. 세포 배양 Flasks, 접시 또는 문화 요리하실 수 있습니다. 챔버를 열려면 먼저 챔버 (hypoxic 가스를 정화 주입 / 튜브 사용)하고 부드럽게 철강 링 클램프를 열고 연결된 튜브에있는 두 개의 하얀 플라스틱 클램프를 엽니다.
- 클램프를 풀어. 뚜껑과 쟁반 이제 제거할 수 있습니다.
- hypoxic 챔버에서 세포 배양을 놓습니다. 또한 문화의 적절한 가습을 제공하기 위해 챔버에 멸균 물이 들어있는 페트리 접시를 놓습니다.
- 컨트롤로 normoxia에서 "쌍둥이"세포 배양를 놓습니다.
- 귀하의 트레이가 안전하게 움직이지 않고 다음의 뚜껑이있는 곳에는 가까이 있는지 확인합니다. 제대로 챔버의 hermetical 폐쇄를 보장하고 닫습니다 철강 링 클램프 위치를.
- hypoxia을 만들려면, 1 %의 O 2 기체 혼합물을 포함하는 "hypoxia 탱크"로 튜빙을 연결합니다. 당신의 탱크에 연결된 유량계가있다면 귀하의 챔버는 직접 (가스 탱크 - 유량계 - 챔버)에 연결됩니다. 우리는 감독 당국에 통합 유량계를 사용합니다.
- 7-10분 분 동안 당 20 리터 유량의 가스 탱크를 열어 챔버를 플러시 이렇게하려면 챔버와 미디어의 모든 산소 존재가있다면 대부분을 제거하는 것이 중요하다, 그리고 신속하게 해제 가스 흐름과 완전히 흰색 클램프를 모두 닫아 챔버를 닫습니다.
- 시간의 원하는 기간 동안 기존의 인큐베이터로 챔버를 반환합니다. 2 시간 후 물을 반복 - 당신이 큰 문화를 사용하는 경우, 1 드 가스 문화 미디어가 수 있습니다.
위의 단계는 생성자 추천 '(빌럽스 - 로텐버그, 부동산)을 기반으로합니다. 당신은 가스 탱크가 제대로 모든 시간에 안전하게 있는지 확인합니다.
참고 :
- 그것이 1-3시간 후 챔버 번 다시 가스 좋습니다 미디어에 포함된 O 2를 제거하기 위해서는.
- 이상 48시간보다 배양 시간에 그것은 또한 다시 가스 챔버에 좋습니다.
- O 2의 측정 셀 / 챔버에 포함된 수 있도록 산소 센서 (전극 / 혈압계) 챔버 / 세포 O 2가 포함된)의보다 정확한 측정을 제공합니다.
- 시간 곡선을 만들어 여러 시간 길이에 Culturing 세포는 특정 세포에서 HIF - 1α의 최적의 시간 표현을 결정하는 데 도움 것입니다.
3. Hypoxia 평가
- 서양 얼룩에 의해 HIF - 1 α 검출.
- 다시 열고 챔버는 섹션 2.2에서 설명한 즉시 얼음에 문화를 놓으십시오.
- 접시에 5% SDS 솔루션 hypoxia 처리 및 비 치료 세포를 Lyse하면 다음 튜브에 sonicate, spindown 세포 파편을 세포 lyzate를 전송하고 표면에 뜨는를 수집합니다.
- BCA 키트를 사용하여 측정 단백질 농도는 5 분 95시 로딩 버퍼와 난방 ° C를 추가하여 샘플을 준비합니다.
- 8% SDS - polyacrylamide 젤 및 Nitrocellulose의 점막에 전송에 Electrophorese 단백질.
- 1 시간이나 쉐이크 4 ° C에서 하룻밤 상온에서 5% 아닌 지방 건조 우유를 포함하는 PBS에 막과 0.1 % 트윈 20 차단합니다.
- 4 같은 버퍼에 방지 HIF - 1α 기본 단클론 항체 (1 / 600)와 함께 밤새 Immunoblot ° C.
- PBS는 PBS에서 HRP - 이차 항체 (1 / 2000) + 0.1 % 45 분 트윈 20과 실내 온도, 5 분마다 시간과 부화에 트윈 20 0.1 %를 포함하는 3 번 씻으십시오.
- PBS는 실온, 5 분 / 시간에 트윈 20 0.1 %를 포함하는 3 번 씻으십시오.
- 단백질 밴드를 표시 피어스 ECL Kit 및 X - 선 필름을 사용
- Hypoxia 시브 요소 (HRE).
HIF - 1α는 Hypoxia 레굴라팅 요소 (HRE)라는 순서에 바인딩하여 수많은 유전자 (즉 VEGF, EPO)을 규정합니다. 마커 유전자에 관련된 HRE를 사용하여 It 9 HIF 활동을 감지할 수 있습니다. 이 방법을 사용하려면 먼저 귀하의 세포에 적응 transfection 방법을 사용하여 HRE - 루시페라제 플라스미드와 세포 transfect해야합니다. 예를 들어, 우리는 Lipofectamine 2000를 사용합니다. 세포는 hypoxia과 normoxia에 incubated 수 전에 최소한 4 시간 transfected해야합니다. 이번이 첫 번째 단계는 hypoxia에 의해 영향을받지 않는다 있도록 DNA가 세포를 입력할 수 있습니다. 루시페라제 신호 루시페라제 어세이 키트를 사용하여 감지됩니다.- 모듈 챔버에서 hypoxia에 HRE - transfected 세포를 품어 또는 CoCl 2 incubated HRE - transfected 세포를 사용 normoxia 컨트롤을 포함합니다.
- 원하는 잠복기 후, 세포의 성장 매체를 제거합니다.
- PBS로 세포를 린스, PBS를 제거합니다.
- 문화 접시에 400μl 1X 용해 시약을 조제하고 첨부된 세포를 긁어 다음, 마이크로 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 간단한 원심 분리하여 펠렛의 잔해.
- 세포의 믹스 20μl는 루시페라제 분석 시약의 100μl로 뜨는 lysates과 luminometer를 사용하여 발광을 측정합니다.
4. 대표 결과 :
K562 세포 (인간 백혈병 세포주)에서 normoxia에 비해 낮은 산소 교양 이일, hypoxia 서양 얼룩 (그림 1)에 의해 감지되었습니다 HIF - 1α 단백질의 증가를 유도.
HRE - 루시페라제은 hypoxia에 교양 (배아 신장 세포 라인) 293 세포를 수정이 중요한이 HIF - 1α 활동의 증가 hypoxic 세포에서 발견되었다 (그림 2). 사용
그림 1 : hypoxic 세포에서 HIF - 1α 늘립니다. K562 세포는 48 시간을위한 normoxia 및 hypoxia (hypoxic 챔버)에 문화되었으며 HIF - 1α에 대한 특정 항체를 사용하여 서양 얼룩으로 분석했다. 굴지에 대한 항체 특정은 로딩 제어 사용되었다.
Figure2 : HIF - 1α 활동. HRE - 루시페라제는 293 세포는 48 시간을위한 hypoxia과 normoxia에 교양되었습니다 수정한 다음 루시페라제 분석 키트와 luminometer를 사용하여 루시페라제 신호를 감지하는 lysed. 결과는 상대적인 발광 장치 (RLU)로 표현됩니다.
Discussion
hypoxic 조건에서 세포 증식과 생존은 세포 종류에 따라 많이 다릅니다. 따라서, 당신은 전화 번호 또는 귀하의 실험에 대한 충분한 세포 / 단백질을해야합니다 있는지 확인으로 시작 문화 접시의 수를 조정해야합니다.
코발트 클로라이드 방법은 저렴한 가격과 빠른 될 수있는 장점이 있습니다. 이 제품은 HIF-1/3α 유도하여 hypoxia 일일뿐만 아니라이 제품은 그것의 '모방 - 독립적으로 특정 세포의 기능과 표현형에 미칠 수있는 다른 어떤 효과를 선택하여 프로젝트에 맞게되어 있는지 확인, 다른 유전자를 조절 할 수 hypoxic "효과. 또한 hypoxia을 모방하는 데 사용되는 다른 약물은 Deferoxamine 메실레이트 (돌연사 했을까, 100 μm의 최종 농도에서 사용)입니다. 이러한 약물의 사용은 experimentator가 "hypoxic 상태"에 영향을주지 않고 문화 판 / 요리 / 술병을 여러 번 열 수 있습니다.
가스 혼합물에 포함된 산소의 수준은 hypoxia 값이 조직 및 세포 유형에 따라 다릅니다로 실험 및 세포 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 사실, 몇몇 세포는 O 2 기타 필요한 1 % 미만 O 2 hypoxic로 5 % hypoxic 있습니다. 5 % CO 2는 문화의 산도를 안정화하기 위해 가스 혼합물에 추가, 가스의 나머지 부분은 보통 질소이다.
Hypoxic 챔버 스는 독립적으로 산소 장력의 세포 행동을 대체 할 수 의약품을 사용하지 않는 장점이 있습니다. 산소가 각 오프닝에서 챔버를 다시 입력하고 따라서 hypoxia을 lessens 그러나, 실험의 모든 유형의 작업을 수행할 수 있습니다. 귀하의 실험이 요소를 고려해야한다 hypoxia / 다시 산소 일부 세포 유형에 영향을 미칠 수있는 특정 조건입니다. 대안 hypoxia 워크 스테이션 (미리 혼합 가스 탱크 또는 가스 혼합 시스템에 연결된) 또는 실험 미디어를 변경하고 지속적인 hypoxic 환경에서 세포를 조작할 수 있도록 큰 hypoxia 인큐베이터 (글러브 박스와 hypoxia 처리 챔버)를 사용하는 것입니다. 다양한 hypoxic 챔버 스는 지난 10 년간 상용화되었습니다 귀하의 연구실에 사용, 프로젝트, 공간, 크기 및 예산에 따라 선택되어야합니다. 항상 올바른 문화 조건을 보장하여 챔버 잘 사용하고 조건을 보장합니다. 일반적으로 챔버를 사용하는 경우, hypoxia의 수준은 다양한 가스 혼합 (예 : 1퍼센트, 5 % 10 % 산소)를 선택하여 변조된 수 있습니다.
HIF - 1α의 검색에 대해서는 아는 것이 중요합니다 일부 암 세포주 normoxia에서 HIF - 1α 표현. 그러므로 이러한 세포 라인에서 HIF의 기초 수준을 결정하는 normoxia - 컨트롤을 사용하는 것이 중요합니다. HIF - 1α는 또한 세포 자극이나 스트레스 다음 이외의 악성 세포 normoxia에 존재하실 수 있습니다. 이것은 또한이 세포는 굶어 죽었을 경우 발생하는 휴대폰의 문화가 적절하게 공급, 유지되어 있는지 확인 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma-Aldrich | C8661-25G | |
| Incubator Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| HRE-Luciferase plasmid | Addgene | Plasmid 26731 |
References
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