Summary
Här föreslår vi enkla metoder för att framkalla syrebrist i cellodlingar och enkla tester för att utvärdera hypoxiska status kulturer.
Abstract
Syrebrist definieras som en minskning eller syrebrist i organ, vävnader eller celler. Minskningen av syre spänning kan bero på ett minskat utbud i syre (orsaker är otillräckligt nätverk blodkärl, defekta blodkärl, och anemi) eller till en ökad konsumtion av syre i förhållande till utbudet (orsakad av en plötslig ökad cellproliferation ränta) . Hypoxi kan vara fysiologiska eller patologiska som i fast cancer 1-3, reumatoid artrit, åderförkalkning etc. ... Varje vävnader och celler har olika förmåga att anpassa sig till denna nya tillstånd. Under hypoxi är hypoxi inducerbara faktor alfa (HIF) stabiliserats och reglerar olika gener som de som är inblandade i angiogenes eller transport av syre 4. Stabiliseringen av detta protein är ett kännetecken för hypoxi, därför upptäcka HIF rutinmässigt används för att screena för hypoxi 5-7.
I den här artikeln föreslår vi två enkla metoder för att framkalla syrebrist i däggdjursceller kulturer och enkla tester för att utvärdera hypoxiska status av dessa celler.
Protocol
1. Hypoxi orsakad av CoCl 2-lösning
Kobolt (II) klorid hexahydrat (CoCl 2 • 6H 2 O, MW = 237,9) är en kemisk inducerare av hypoxi inducerbara factor-1,3 8. Produkten är löslig i vatten (100 mg / ml), vilket ger en klar, röd lösning.
- Förbered en 25mm stamlösning i sterilt dd vatten, (förbereder omedelbart före användning)
- Använd CoCl 2 vid den slutliga koncentrationen 100μM i din vanliga media cellodling för att framkalla syrebrist.
- Tillsätt CoCl 2 innehåller media till dina celler och inkubera kulturer för 24 timmar i en konventionell kuvös (37 ° C, 5% C0 2).
Ovanstående koncentrationen arbetar för cellinjer som vi har testat men varje cellinje skall testas vid olika koncentrationer (för att fastställa en dosberoende kurva) samt vid olika inkubationstiderna för att begränsa narkotikarelaterad toxicitet och optimera analysen.
2. Hypoxi inducerad i Modular Incubator avdelningen
- Bered minst två identiska (twin kultur) cellkulturer. Cellkulturer kan i behållare, tallrikar eller fat kultur. För att öppna kammaren, först öppnar de två vita plast klämmor sitter på rören ansluten till kammaren (rör som används för injektion / avinstallera hypoxisk gas) och försiktigt öppna klämman stålring.
- Släpp klämman. Locket och brickor kan nu tas bort.
- Placera cellodling i hypoxisk kammaren. Också placera en petriskål med sterilt vatten i kammaren att ge adekvat befuktning av kulturer.
- Placera "tvilling" cellodling i normoxia som kontroll.
- Se till att dina brickor är säkrade och inte röra sig, och sedan Stäng kammaren med locket. Korrekt ställning klämman stålring för att säkerställa hermetisk stängning av kammaren och stänga den.
- För att skapa hypoxi, fästa slangen till en "hypoxi tank" som innehåller en 1% O 2 gasblandning. Om du har en flödesmätare ansluten till din tank din kammare kommer att vara direkt ansluten till den (gas tank-flödesmätare-kammare). Vi använder en flödesmätare som ingår i våra regulator.
- Det är viktigt att ta bort de flesta om inte alla syre närvarande i kammaren och i media, att göra så spola kammaren genom att öppna bensintank med en flödeshastighet på 20 liter per minut i 7-10 minuter och sedan snabbt stänga av gasflöde och helt Stäng kammaren genom att stänga båda vita klämmorna.
- Återgå kammaren till en konventionell kuvös för önskad tid. Om du använder stora kulturer, låta media i kulturer avgasa 1 - 2 timmar och upprepa sedan spola.
Stegen ovan är baserade på konstruktören rekommendationer "(Billups-Rothenberg, Inc). Se till att du bensintank är ordentligt säkrade hela tiden.
Anmärkningar:
- För att eliminera O 2 som finns i media är det tillrådligt att åter gasen i kammaren en gång efter 1-3 timmarna.
- För inkubationstid längre än 48hours Det är också tillrådligt att åter gas kammaren.
- Syre sensorer (elektroder / manometer) som tillåter mätningar av O 2 som finns i celler / kammare kommer att ge en mer exakt mätning av den intracellulära / kammare O 2 innehåller).
- Odling celler vid olika tidpunkter längder för att göra en tid-kurva skulle hjälpa bestämma den optimala tiden uttryck för HIF-1α i din celler.
3. Utvärdering av Hypoxia
- HIF-1 α upptäckt av Western Blot.
- Åter öppna din kammare beskrivs i avsnitt 2,2 och omedelbart placera kulturer på is.
- Lyse hypoxi behandlade och obehandlade celler med 5% SDS-lösning i plattorna sedan överföra cellen lyzate till rör, Sonikera, spindown cellen skräp och samla in supernatanten.
- Mät proteinkoncentration använda BCA kit, förbereda prov genom att lägga till buffert och värme vid 95 ° C i 5 min.
- Elektrofores proteiner på en 8% SDS-polyakrylamidgel och transfer till Nitrocellulosa membran.
- Blockera membranet i PBS som innehåller 5% fettfri torrmjölk och 0,1% Tween 20 i rumstemperatur i 1 timme eller vid 4 ° C över natten på shaker.
- Immunoblot natten med anti-HIF-1α primära monoklonal antikropp (1 / 600) i samma buffert vid 4 ° C.
- Tvätta tre gånger i PBS som innehåller 0,1% Tween-20 i rumstemperatur, 5min varje gång och inkubera med HRP-sekundär antikropp (1 / 2000) i PBS + 0,1% Tween 20 för 45 min.
- Tvätta tre gånger i PBS som innehåller 0,1% Tween-20 i rumstemperatur, 5min / tid.
- Använd Pierce ECL kit och röntgenfilm att visa proteinet bandet
- Hypoxi Lyhörd Element (HRE).
HIF-1α reglerar ett flertal gener (dvs VEGF, EPO) genom att binda till en sekvens som kallas Hypoxi Reglering Element (HRE). Använda HRE associeras till en markör gen jagt är möjligt att upptäcka HIF aktivitet 9. För att använda den här metoden måste du först transfektera dina celler med HRE-luciferas plasmid med en transfektion metod anpassad till dina celler. Till exempel använde vi Lipofectamine 2000. Celler måste transfekterade minst 4 timmar innan ska inkuberas i hypoxi och normoxia. Den här gången gör att DNA att gå in i cellerna så att detta första steg inte påverkas av hypoxi. Den luciferas signal upptäcks med hjälp av en luciferas Assay Kit.- Inkubera din HRE-transfekterade celler i hypoxi i modulära kammare eller använda HRE-transfekterade celler inkuberas med CoCl 2, inkluderar en normoxia kontroll.
- Efter att önskad inkubationstid, ta bort odlingsmedium från celler.
- Skölj cellerna i PBS, ta bort PBS.
- Tillsätt 400μl 1X lyseringsreagenset i kulturen skålen och skrapa bifogade celler och sedan överföra dem till en micro-slang.
- Pellets skräp med kort centrifugering.
- Blanda 20μl av cell lysates supernatanten med 100μl av luciferas analys Reagens och mäta ljusflöde med en luminometer.
4. Representativa resultat:
I K562 celler (mänskliga leukemi cellinje) odlade 2 dagar i låg syrehalt, jämfört med normoxia, inducerar hypoxi en ökning med HIF-1α protein som påvisades med Western blot (Figur 1).
Använda HRE-luciferas modifierad 293 celler (embryonala njur cellinje) odlas i hypoxi, en betydande ökning av den HIF-1α aktiviteten upptäcktes i hypoxiska celler (Figur 2).
Figur 1: Öka HIF-1α i hypoxiska celler. K562 celler kultur i normoxia och hypoxi (hypoxiska kammare) för 48 timmar och analyseras av Western Blot med en antikropp som är specifik för HIF-1α. En antikropp specifik för aktin användes för lastning kontroll.
Figure2: HIF-1α aktivitet. HRE-luciferas modifierad 293 celler odlades i hypoxi och normoxia för 48 timmar och sedan lyseras för att upptäcka luciferas signal med hjälp av en luciferas analys-kit och en luminometer. Resultaten uttrycks som den relativa luminiscens enheten (RLU).
Discussion
Celltillväxt och lönsamhet hypoxiska förhållanden varierar mycket beroende på vilka celltyper. Därför bör du justera mobilnummer eller antalet kulturer plattor du börja med att se till att du har tillräckligt med celler / proteiner för ditt experiment.
Den koboltklorid Metoden har fördelen att vara billig och snabb. Denna produkt härmar hypoxi genom att inducera HIF-1/3α men kan också reglera andra gener, se till att denna produkt är anpassad till ditt projekt genom att kontrollera vilka andra effekter det kan ha på funktion och fenotyp din celler oberoende av "härma- hypoxisk "effekt. Annat läkemedel används också för att efterlikna hypoxi är deferoxamin mesylate (DFO, som används vid 100 mikroM slutlig koncentration). Användningen av dessa läkemedel gör att experimentator att öppna kultur plattan / skål / kolv många gånger utan att påverka den "hypoxiska tillstånd".
Nivån av syre i gasblandningen kan variera beroende på dina experiment och celltyper som hypoxi värdena varierar beroende på vävnader och celltyper. En del celler hypoxisk i 5% O 2 andra behöver mindre än 1% O 2 att vara hypoxisk. 5% CO 2 läggs till gasblandningen för att stabilisera pH-värdet i kulturer, är resten av gasen oftast Nitrogen.
Hypoxiska kamrarna har fördelen av att inte använda läkemedel som kan växla cellens beteende oberoende av syre spänning. Dock kan inte alla typer av experiment göras som syre åter kommer in i kammaren vid varje öppning och därmed minskar hypoxi. Du bör överväga denna faktor i dina experiment, hypoxi / re-syresättning är en specifik tillstånd som kan påverka vissa celltyper. Ett alternativ är att använda hypoxi arbetsstationer (ansluten till färdigblandade gastankar eller gas blandning system) eller större hypoxi inkubator (hypoxi bearbetning kammare med handskfacket) som gör att experimentera för att ändra media och manipulera celler i ständig hypoxisk miljö. Olika hypoxiska kamrarna har kommersialiserats under det senaste decenniet och bör väljas i enlighet med laboratoriets används, projekt, utrymme, storlek och budget. Se alltid till god användning och skick din kammare för att garantera korrekt odlingsbetingelser. I allmänhet när du använder en kammare kan graden av hypoxi anpassas genom att välja olika gasblandningar (dvs 1%, 5% 10% syre).
När det gäller detektion av HIF-1α, är det viktigt att veta att vissa cancer cellinje uttrycka HIF-1α i normoxia. Det är därför viktigt att använda en normoxia-kontroll för att fastställa den basala nivån av HIF i dessa cellinjer. HIF-1α kan också finnas i normoxia i icke-maligna celler efter cell stimulering eller stress. Detta kan också inträffa om dessa celler är svalt, se till att din cellkulturer ordentligt foder och upprätthålls.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma-Aldrich | C8661-25G | |
| Incubator Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| HRE-Luciferase plasmid | Addgene | Plasmid 26731 |
References
- Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).
- van Laarhoven, H. W. Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).
- Hockel, M. Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix. Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).
- Semenza, G. L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor. Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis. Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. HIF at a glance. J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).
- Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2. Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).
- Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a). Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).
