Summary
Hier schlagen wir einfache Methoden, um eine Hypoxie in Zellkulturen und einfache Tests veranlassen, die hypoxischen Zustand der Kulturen zu bewerten.
Abstract
Hypoxie ist die Reduzierung oder das Fehlen von Sauerstoff in Organe, Gewebe oder Zellen definiert. Dieser Rückgang der Sauerstoffspannung kann durch eine reduzierte Versorgung mit Sauerstoff (Ursachen sind unzureichende Blutgefäß-Netzwerk, defekte Blutgefäß, und Anämie) oder zu einem erhöhten Verbrauch von Sauerstoff im Verhältnis zum Angebot (verursacht durch eine plötzliche höhere Zellteilungsrate) . Hypoxie kann physiologische oder pathologische wie in soliden Tumoren 1-3, rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose usw. ... Jedes Gewebe und Zellen haben eine andere Fähigkeit, sich an diesem neuen Zustand anzupassen. Während Hypoxie, ist Hypoxie-induzierbaren Faktors alpha (HIF) stabilisiert und reguliert verschiedene Gene, wie sie in der Angiogenese oder den Transport von Sauerstoff 4 beteiligt. Die Stabilisierung dieses Proteins ist ein Markenzeichen von Hypoxie, also Erkennen HIF routinemäßig zum Screening auf Hypoxie 5-7 verwendet.
In diesem Artikel schlagen wir zwei einfache Methoden, um eine Hypoxie in Säugetier-Zellkulturen und einfache Tests veranlassen, die hypoxischen Status dieser Zellen zu evaluieren.
Protocol
1. Hypoxie durch CoCl 2-Lösung induzierte
Cobalt (II)-Chlorid Hexahydrat (CoCl 2 • 6 H 2 O, MG = 237,9) ist eine chemische Induktor von Hypoxie-induzierbaren Faktor-1.3 8. Dieses Produkt ist in Wasser löslich (100 mg / ml), wodurch eine klare, rote Lösung.
- Bereiten Sie eine 25mM Stammlösung in sterilem dd Wasser (unmittelbar vor Gebrauch vorbereitet)
- Verwenden Sie CoCl 2 in der endgültigen Konzentration von 100 &mgr; in Ihrem normalen Zellkulturmedien auf Hypoxie zu induzieren.
- Fügen Sie die CoCl 2 mit Medien, um Ihre Zellen und inkubieren Sie die Kulturen für 24 Stunden in einem herkömmlichen Inkubator (37 ° C, 5% C0 2).
Die oben genannten Konzentration arbeitet für die Zell-Linien die wir getestet haben aber jede Zelllinie sollte in verschiedenen Konzentrationen (um eine Dosis-abhängige Kurve zu etablieren) getestet sowie auch in unterschiedlichen Inkubationszeiten um Drogenkriminalität Toxizität zu begrenzen und Optimierung der Assays.
2. Hypoxie in Modular Incubator Chamber induzierten
- Bereiten Sie mindestens zwei identisch (twin Kultur) Zellkulturen. Zellkulturen können in Flaschen, Teller oder Kulturschalen werden. Zum Öffnen der Kammer, öffnen Sie zunächst die beiden weißen Kunststoff-Schellen an den Rohren befestigt, um die Kammer (Rohre für die Injektion / Spülen der hypoxischen Gas) und öffnen Sie vorsichtig den Stahlring Klemme befindet.
- Lösen Sie die Klemme. Der Deckel und Schalen können nun entfernt werden.
- Legen Sie die Zellkultur in der hypoxischen Kammer. Auch Platz eine Petrischale mit sterilem Wasser in die Kammer eine ausreichende Befeuchtung der Kulturen.
- Platzieren Sie den "Zwilling" der Zellkultur in Normoxie als Kontrolle.
- Stellen Sie sicher, Schalen befestigt sind und sich nicht bewegt, und schließen Sie dann die Kammer mit dem Deckel. Richtig zu positionieren den Stahlring Haken, um den hermetischen Verschluss der Kammer zu gewährleisten und zu schließen.
- So erstellen Sie eine Hypoxie, bringen Sie den Schlauch mit einer "Hypoxie-Tank" mit einer 1% O 2-Gasgemisch. Wenn Sie ein Durchflussmesser angeschlossen, um den Tank Ihre Kammer wird direkt an ihn (Gas-Tank-Flow-Meter-Kammer) angeschlossen werden. Wir verwenden ein Durchflussmesser in unserem Regler eingebaut.
- Es ist wichtig, die meisten zu entfernen, wenn nicht alle vorhandenen Sauerstoff in die Kammer und in Ihren Medien, dies zu tun bündig die Kammer durch Öffnen des Gas-Tank mit einer Flussrate von 20 Litern pro Minute für 7-10 Minuten, dann schnell schalten Sie die Gasfluss und vollständig schließen die Kammer durch Schließen sowohl weiße Klammern.
- Return der Kammer zu einer herkömmlichen Inkubator für den gewünschten Zeitraum. Wenn Sie große Kulturen verwendet werden, können Medien in den Kulturen zu de-Gas für 1 bis 2 Stunden und wiederholen Sie dann die Spülung.
Die oben genannten Schritte sind auf den Konstruktor Empfehlungen "(Billups-Rothenberg, Inc) basiert. Stellen Sie sicher, Gas-Tank ordnungsgemäß zu jeder Zeit gesichert.
Notes:
- Um die O 2 in den Medien enthalten sie wieder Gas geraten ist die Kammer wieder nach 1-3 Stunden zu beseitigen.
- Für Inkubationszeit länger als 48 Stunden ist es auch wieder Gas in die Kammer beraten.
- Oxygen Sensoren (Elektroden / Manometer), dass Messungen des O 2 in Zellen / Kammer enthaltene ermöglichen wird eine genauere Messung der intrazellulären / Kammer O 2 enthalten).
- Kultivieren von Zellen in verschiedenen Zeitspannen zu einem Zeit-Kurve machen würde helfen, die optimale Zeit Expression von HIF-1α in Ihren Zellen.
3. Evaluation von Hypoxie
- HIF-1 α-Erkennung mittels Western Blot.
- Re-open deine Kammer, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben und sofort platzieren Sie Ihre Kulturen auf Eis.
- Lyse Hypoxie behandelten und nicht behandelten Zellen mit 5% SDS-Lösung in die Platten übertragen Sie dann die Zelllysat zu Rohren, beschallen, spindown die Zelltrümmer und den Überstand.
- Messen Proteinkonzentration mit BCA-Kit, bereiten Probe durch Zugabe von Ladepuffer und Erhitzen auf 95 ° C für 5 min.
- Elektrophorese Proteine auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel und Transfer auf Nitrozellulose-Membranen.
- Blockieren Sie die Membran in PBS mit 5% fettfreier Trockenmilch und 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht auf Schüttler.
- Immunoblot Übernachtung mit anti-HIF-1α primären monoklonalen Antikörper (1 / 600) im gleichen Puffer bei 4 ° C.
- Wash 3 mal in PBS mit 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur 5min jeder Zeit und inkubieren mit HRP-Sekundärantikörper (1 / 2000) in PBS + 0,1% Tween 20 für 45 min.
- Wash 3 mal in PBS mit 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur 5min / Zeit.
- Verwenden Sie Pierce ECL-Kit und Röntgenfilm auf die Protein-Bande zeigen
- Hypoxie Responsive Element (HRE).
HIF-1α reguliert zahlreiche Gene (dh VEGF, EPO) durch die Bindung an eine Sequenz namens Hypoxie regulierendes Element (HRE). Mit HRE verbunden mit einem Marker-Gen it ist möglich, HIF Aktivität 9 zu erkennen. Um diese Methode verwenden, müssen Sie zuerst Ihre Zellen mit einem HRE-Luciferase-Plasmid mit einem Transfektionsmethode angepasst an Ihre Zellen zu transfizieren. Zum Beispiel haben wir genutzt Lipofectamine 2000. Zellen benötigen, um transfizierte mindestens 4 Stunden vor dem in Hypoxie und Normoxie inkubiert werden. Dieses Mal kann die DNA in die Zellen eindringen, so dass dieser erste Schritt ist nicht durch Hypoxie beeinflusst. Die Luciferase-Signal erkannt wird mit Hilfe eines Luciferase Assay Kit.- Inkubieren Sie HRE-transfizierten Zellen in Hypoxie in modularen Kammer oder benutzen HRE-transfizierten Zellen mit CoCl 2 inkubiert, eine Normoxie Kontrolle.
- Nachdem die gewünschte Inkubationszeit entfernen Wachstumsmedium von den Zellen.
- Rinse-Zellen in PBS, entfernen Sie die PBS.
- Dispense 400μl 1X Lyse-Reagenz in Kulturschale und kratzen die anhaftenden Zellen, übertragen sie dann auf eine Mikro-Schlauch.
- Pellet Schmutz durch kurze Zentrifugation.
- Mix 20 &mgr; l der Zelllysate Überstand mit 100 &mgr; l des Luciferase Assay Reagent und messen Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer.
4. Repräsentative Ergebnisse:
In K562-Zellen (humane Leukämie-Zelllinie) kultiviert 2 Tage in geringem Sauerstoffgehalt, im Vergleich zu Normoxie, Hypoxie induziert eine Erhöhung der HIF-1α Protein, das durch Western-Blot (Abbildung 1) erkannt wurde.
Mit HRE-Luciferase modifizierten 293-Zellen (embryonale Nieren-Zelllinie) kultiviert in Hypoxie eine signifikante erhöht wurde von HIF-1α Aktivität in hypoxischen Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 2).
Abbildung 1: Zunahme HIF-1α in hypoxischen Zellen. K562-Zellen wurden in Kultur Normoxie und Hypoxie (Hypoxie-Kammer) für 48 Stunden und analysiert durch Western-Blot mit einem Antikörper, der spezifisch für die HIF-1α. Ein Antikörper, der spezifisch für Aktin wurde für die Be-Kontrolle eingesetzt.
Abbildung 2: HIF-1α Aktivität. HRE-Luciferase modifizierten 293-Zellen in Hypoxie und Normoxie für 48 Stunden kultiviert und anschließend lysiert, um Luciferase-Signal mit Hilfe eines Luciferase-Assay-Kit und einem Luminometer zu erkennen. Die Ergebnisse werden als relative Lumineszenz-Einheit (RLU) angegeben.
Discussion
Zellproliferation und Lebensfähigkeit in hypoxischen Bedingungen variieren stark in Abhängigkeit von der Zelltypen. Daher sollten Sie die Zelle oder die Nummer der Kulturen Platten starten Sie mit, damit Sie genügend Zellen / Proteine für Ihre Experimente haben.
Kobaltchlorid-Methode hat den Vorteil, kostengünstig und schnell. Dieses Produkt imitiert Hypoxie durch Induktion HIF-1/3α können aber auch andere Gene regulieren, stellen Sie sicher, dass dieses Produkt für Ihr Projekt wird durch die Überprüfung, was andere Effekte könnte auf die Funktion und Phänotyp der bestimmte Zellen unabhängig sind von der "Mimik-adaptierten hypoxischen "-Effekt. Ein weiteres Medikament auch zur Hypoxie nachahmen ist Deferoxamin Mesylat (DFO, verwendet bei 100 uM Endkonzentration). Der Einsatz dieser Medikamente kann der Experimentator die Kultur Platte / Schale / Kolben mehrmals ohne Beeinträchtigung der "hypoxischen Zustand" zu öffnen.
Der Gehalt an Sauerstoff in dem Gasgemisch enthalten ist, kann abhängig von Ihren Experimenten und Zelltypen als Hypoxie-Werte in Abhängigkeit von der Gewebe-und Zelltypen variieren. Tatsächlich sind einige Zellen in 5% hypoxische O 2 andere brauchen weniger als 1% O 2 bis hypoxisch sein. 5% CO 2, das Gasgemisch wird hinzugefügt, um den pH-Wert der Kulturen zu stabilisieren, ist der Rest des Gases in der Regel Stickstoff.
Hypoxische Kammern haben den Vorteil, nicht mit Medikamenten, die das Verhalten der Zelle wechseln kann unabhängig von der Sauerstoff-Partialdruck. Allerdings können nicht alle Arten von Experimenten durchgeführt, wie Sauerstoff wieder in die Kammer bei jeder Öffnung und damit verringert Hypoxie werden. Sie sollten diesen Faktor in Ihrer Experimente betrachten, Hypoxie / re-Oxygenierung ist eine bestimmte Bedingung, dass einige Zelltypen beeinflussen können. Eine Alternative ist die Hypoxie-Workstations (verbunden mit vorgemischten Gas-Tanks oder Gas Mischsysteme) oder größer Hypoxie Inkubator (Hypoxie Verarbeitung Kammer mit Handschuhfach), dass die Experimente zu den Medien zu ändern und zu manipulieren Zellen in kontinuierlichen hypoxische Umgebung ermöglicht den Einsatz. Verschiedene hypoxischen Kammern haben in den vergangenen zehn Jahren kommerzialisiert worden und sollte nach Ihrem Labor eingesetzt, Projekte, Raum, Größe und Budget gewählt werden. Achten Sie immer darauf den guten Zweck und Bedingung für die Kammer zu korrigieren Kultur zu garantieren. Im Allgemeinen, wenn Sie eine Kammer, kann der Grad der Hypoxie moduliert werden, indem Sie die verschiedenen Gasgemischen (dh 1%, 5% 10% Sauerstoff).
In Bezug auf den Nachweis von HIF-1α, ist es wichtig zu wissen, dass einige Krebszellen line express HIF-1α in Normoxie. Es ist daher entscheidend für eine Normoxie-Steuerelement verwenden, um das Grundniveau von HIF in diesen Zelllinien zu bestimmen. HIF-1α kann auch in Normoxie bei nicht-malignen Zellen nach Zell-Stimulation oder Stress. Dies könnte auch auftreten, wenn diese Zellen verhungert sind sicher, dass Ihr Zellkulturen richtig ernähren und unterhalten.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
| Cobalt (II) Chloride | Sigma-Aldrich | C8661-25G | |
| Incubator Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| HRE-Luciferase plasmid | Addgene | Plasmid 26731 |
References
- Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).
- van Laarhoven, H. W. Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).
- Hockel, M. Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix. Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).
- Semenza, G. L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor. Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis. Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. HIF at a glance. J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).
- Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2. Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).
- Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a). Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).
