Biology

Een geoptimaliseerde protocol voor het kweken van Fopius arisanus, Een Parasitaire van Tephritid Fruit Flies

Published: July 2, 2011 doi: 10.3791/2901

Nicholas Manoukis¹, Scott Geib¹, Danny Seo¹, Michael McKenney¹, Roger Vargas¹, Eric Jang¹

¹Agricultural Research Service, US Dept. of Agriculture, US Pacific Basin Agricultural Research Center

Summary

Fopius arisanus is een ei-larve-parasiet van Tephritid fruitvliegen die met succes wordt toegepast in de biologische bestrijding van deze belangrijke tropische ongedierte. We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol voor het kweken van F. arisanus op kleine schaal met behulp van gemakkelijk beschikbare materialen.

Abstract

Fopius arisanus (Sonan) is een belangrijke parasieten van Tephritid fruitvliegen ten minste twee redenen. Ten eerste is het een van de slechts drie opiine parasitoïden bekend zijn bij de gastheer te infecteren tijdens de ei-fase ^1. Ten tweede, het heeft een breed scala van mogelijke fruitvlieg hosts. Misschien te wijten aan haar levensgeschiedenis, F. arisanus is een succes gebruikt voor biologische bestrijding van fruitvliegen in meerdere tropische gebieden ^2-4. Een belemmering voor het ruime gebruik van F. arisanus voor de fruitvlieg controle is dat het moeilijk is om een stabiele kolonie laboratorium ^5-9 vast te stellen. Ondanks deze moeilijkheid, in de jaren 1990 USDA onderzoekers ontwikkelden een betrouwbare methode om het laboratorium populaties van F. te behouden arisanus ^10-12. Er is grote interesse in F. arisanus biologie ^13,14, in het bijzonder met betrekking tot zijn vermogen om een breed scala van Tephritid gastheren ^14-17 koloniseren; belang is vooral gedreven door de alarmerende verspreiding van Bactrocera fruitvlieg plagen om nieuwe continenten in de laatste tien jaar ^18. Verder onderzoek naar F. arisanus en extra inzet van deze soort als een biologisch bestrijdingsmiddel zal profiteren van optimalisaties en verbeteringen van het houden van methoden. In dit protocol en de bijbehorende video-artikel beschrijven we een optimale methode voor het kweken van F. arisanus op basis van een eerder beschreven aanpak ^12. De methode die we beschrijven hier maakt het fokken van F. arisanus in een kleine schaal zonder het gebruik van fruit, gebruik van materialen die beschikbaar zijn in tropische gebieden over de hele wereld en met relatief weinig manuele arbeid.

Protocol

1. Bereid gastheer fruitvlieg eieren voor parasitering

Bereiden op een substraat voor fruitvlieg eieren worden geparasiteerd door het bereiden van agar (alternatief Gelcarin GP812, FMC Biopolymer, Ewing NJ; een meer kosteneffectieve optie) gevulde gerechten, 10 cm in lengte per kant en 1,5 cm diepte. Bereid agar bij een concentratie van 9 g per liter water.
Vul gerechten tot de rand met vloeibare agar (ongeveer 70 ml), en laat ze afkoelen en stollen (minstens 45 minuten).
Zodra de agar blokken zijn solide, breng dan een enkele laag van weefsel papier (een enkele laag van de partij Georgia Pacific 'Voorkeur' weefsel), die de bovenkant van elk blok. Het weefsel moet gemakkelijk te houden aan de agar als gevolg van het oppervlak vocht.
Breng een 0,5 ml volume fruitvlieg eieren gesuspendeerd in water om het weefsel overdekte oppervlakte van de agar blokken. In onze insectary, dit is gelijk aan ongeveer 6000 eieren van Bactrocera dorsalis (12.000 eieren per ml).
Gebruik een schone 2,5 cm brede kwast gedoopt in water gelijkmatig verspreiden van de fruitvlieg eieren over het weefsel oppervlak.
Plaats de fruitvlieg eieren onder het onderste scherm van de sluipwesp kooien te ovipositie mogelijk te maken. Tik op de onderkant van het onderste scherm om de dode parasieten die kunnen belemmeren de eieren te verwijderen. Het is het beste als het onderste scherm niet raakt de eieren.
Laat de parasieten om 's nachts en in de volgende dagen eieren leggen, ongeveer 21 uur. Dit is voldoende tijd voor een hoog percentage van de eieren te geparasiteerd. Langere belichtingstijd risico's superparasitization.

2. Broedeieren en verpopping van parasitering gastheer fruitvliegen

Bereid opvoeding container door het plaatsen van 3 tot 3,5 voorbereid agar blokken van parasitering eieren per 1,25 liter fruitvlieg dieet ¹⁹ met eieren naar boven.
Plaats het dieet bak met eieren op een riser over een 1,5 cm diepe laag van fijn vermiculiet of gewassen zand in een grotere verpopping container. Bedek de verpopping container met een deksel en tape de randen van de met plakband. Vermiculiet kan worden hergebruikt na zeven (zie hieronder).
Ervoor te zorgen dat er voldoende ruimte tussen de bovenkant van het dieet container en de verpopping deksel voor de fruitvlieg larven kruipen uit en 'pop' ²⁰ in de vemiculite hieronder.
Verhuizen verpopping containers naar een kamer bij 27 ° C en 80% relatieve vochtigheid (RH) voor een week. Bedek containers met een donkere doek voor de eerste vier dagen verwijder vervolgens de doek voor de resterende dagen.
Verwijder de larvale voeding na een week, zodra larven dook en ging de vermiculiet voor de verpopping. Als er larven in het vermiculiet, hen in staat stellen om zich te verpoppen 's nachts.
Zeef de poppen uit de vermiculiet. Begin met een grove zeef (ongeveer 3 mm), gebruik dan een hand zeef om alle resterende klonten van vermiculiet te verwijderen.

3. Sortering en selectie

Pupa met F. arisanus kan gedeeltelijk worden gescheiden van unparasitized fruitvliegjes op grootte. Verzamel pop tussen de 1,65 en 2,26 mm in diameter, omdat deze zullen worden verrijkt voor geparasiteerd vliegen. ¹² Puparia die kleiner zijn bevatten meestal ondermaats parasitoïden grotere pop meestal bevatten vliegen. Merk ook op dat voor de geparasiteerde poppen het percentage van de vrouwen positief correleert met maat ^12.
Een verscheidenheid van methoden kunnen worden gebruikt om poppen sorteren op grootte. We beschrijven een mechanische methode met behulp van een aangepast formaat sorter ^21.
Plaats poppen in de trechter aan de bovenkant van een trilling feeder die langzaam voedt de grootte van sorter.
Voer de poppen in de omvang sorter, die bestaat uit een paar van iets uiteenlopende rollen bars in een hoek van 30 °. De poppen daling van individueel naar grootte in een array van slots die lege in tien aparte containers door middel van een trechter.
Verzamel poppen van de bekers in de orde van grootte van 1,65 tot 2,26 mm en leg ze in een kooi opkomst voor 7 dagen tot de meeste vliegen zijn voortgekomen uit de unparasitized poppen.
Vervolgens gebruikt u een ventilator te legen puparia scheiden van degenen die nog met insecten.

4. F. arisanus opkomst en onderhoud

Om de kolonie van F. te behouden arisanus gebruik maken van een sluipwesp kooi met een verwijderbaar glazen front, ongeveer 25 cm in lengte per zijde. De kooi is 1 mm ² screening op de top en twee van de zijden. De achterkant van de kooi is bedekt met een rubber plaat met een 9 cm gat voor toegang. De bodem van de kooi heeft een uitgesneden aan de binnenkant bedekt met een 1-2mm ² scherm groot genoeg om de plaatsing van twee agar blokken mogelijk is met fruitvlieg eieren voor parasitoid ovipositie.
De holding kooien moet ook een getinte gedeelte langs de onderkant kwart van de glazen pui aan het licht die parasitaire verdringing kan maken langs de voorkant van de kooi, wat resulteert in een verhoogde mortaliteit te minimaliseren.
Plaats ongeveer 11 g van deze selectieTed poppen in plastic containers van ongeveer 9 cm in diameter. Dit moet produceren ongeveer 600-700 parasieten per kooi. Maat selectie zou moeten resulteren in ongeveer 60% vrouwen.
Bevestig gescreend deksels van de containers. De deksels moeten worden gedekt met een 2 mm ² screening, waardoor volwassen F. arsianus om de containers te verlaten na opkomst, maar bevat alle resterende fruitvliegen.
Handhaving van de parasieten bij 24 ° C en ongeveer 45% RH met een 12:12 fotoperiode en goede ventilatie. Als hoge sterfte wordt waargenomen, kan het verplaatsen van de kooien buiten voor een paar uur per dag of meer ventilatie te verminderen. Parasieten moet klaar om eieren leggen in een extra week en moet productief voor twee weken.
Streak onverdund gesponnen honing langs de bovenkant van de kooien ten minste drie keer per week of wanneer de beschikbare honing droog is. Breng de gesponnen honing in de smalle strepen met behulp van een vingertop. Merk op dat als de strepen zijn te zwaar de honing komt in de kooi, indien te licht de honing zal snel uitdrogen en vereisen regelmatig opnieuw aanbrengen.
Plaats agar blokken (10 cm x 10 cm x 4 cm) op de toppen van de kooien om vocht te verstrekken aan de parasieten. Deze moeten worden gewijzigd twee keer per week.

5. Representatieve resultaten:

Wij rapporteren hier de resultaten van procedures voor kwaliteitscontrole uitgevoerd op de USDA-ARS F. arisanus opvoeding operatie in Hilo, Hawaii tussen 05 januari en juni 22, 2010. Opvoeding op de Hilo locatie op de schaal zoals beschreven in dit artikel en video-protocol werd in augustus 2009, en de initiële problemen en aanpassingen aan de nieuwe locatie was grotendeels opgelost januari. Daarom zijn deze gegevens representatief zijn voor de resultaten andere onderzoekers zouden kunnen verkrijgen van de aanvang van hun kolonie als ze volgen het protocol zoals beschreven en hebben ervaring met opvoeden insecten in het algemeen. In deze periode waren we het handhaven van een kleine kolonie van F. arisanus: 4 parasitaire holding kooien geproduceerd per week, wat overeenkomt met ongeveer 3.600 F. arisanus.

Een eerste controle van de verrijkte parasitering tarieven werd uitgevoerd door het nemen van een 2 g monster van poppen in de orde van grootte van 1,65 tot 2,26 mm (verrijkt) voor een extra week van de ontwikkeling in een kooi (dat wil zeggen onmiddellijk na de larvale dieet werd verwijderd en de poppen gezeefd en grootte gesorteerd. We verwijzen naar deze als 'early poppen'). Tijdens de eerste drie maanden van 2010 de gemiddelde verhouding parasieten in de verrijkte monster was 0,46 (SD = 0,18). Tijdens het volgende kwartaal betekent dit was 0,58 (SD = 0,08), als gevolg van de stabilisatie van de kolonie en opvoeding procedures op de nieuwe locatie. Merk op dat de verrijkte poppen, die niet werden met succes geparasiteerd die niet produceren Emergents en degenen die geproduceerd vliegt bevatten.

Na een extra week in de kooi verwijderen van lege puparia nog eens twee gram monster werd genomen ('late poppen'). Fruitvliegen vertegenwoordigden minder dan 1% van dit tweede monster. Het lage percentage van fruitvliegen is deels te wijten aan de eerdere opkomst van vliegen in vergelijking met parasieten, dus de meeste vliegen bleef in de holding container.

Tot slot, Figuur 1 geeft de opbrengst in popstadium massa van januari tot juni 2010. De opbrengsten zijn gemeten van poppen verrijkt in de orde van grootte van belang, 1.65-2.26 mm. De grote massa van de 'vroege poppen' aan het begin van het jaar geeft een groot deel van de fruitvliegjes en unemerged poppen in die tijd, terwijl aanpassingen werden gedaan om de nieuwe faciliteit.

Figuur 1. Opbrengst van verrijkte (popstadium een diameter van 1.65-2.26mm) vroeg (direct na size selectie) en 'late' (na het houden van een week en het verwijderen van lege darmen) poppen aan het ARS-USDA F. ariasnus kolonie in Hilo, Hawaii , januari-juni 2010

Discussion

In dit protocol en de bijbehorende video-artikel hebben we beschreven en aangetoond een geoptimaliseerd protocol voor het kweken van F. ariasnus, een parasitoïde van Tephritid fruitvliegen, in een laboratorium setting. Dit protocol werd verfijnd door de jaren heen naar de hoeveelheid arbeid en gespecialiseerde apparatuur die nodig is om een kolonie te behouden te minimaliseren. Wij constateren dat een gevestigde, productieve en stabiele kolonie van gastheer fruitvliegen is vereist voor elke poging tot opvoeding sluipwespen. In onze insectary gebruiken we Bactrocera dorsalis als gastheer fruitvlieg, maar ook andere soorten is aangetoond dat ze bevoegd zijn gastheren en ^14-17.

Verschillende aspecten van F. arisanus kolonie onderhoud moeten nog worden onderzocht. Deze omvatten de snelheid van het laboratorium aanpassing in deze soort ^10, mechanismen van het leren ²² en de genetische veranderingen die zich kunnen voordoen met aanpassing en mechanismen die een rol kunnen spelen in gastheer fruitvlieg plasticiteit.

De afgelopen tien jaar zijn er meerdere voorbeelden van de verspreiding van Dacine vliegt de hele wereld, vooral die in het geslacht Bactrocera: B. dorsalis in Frans Polynesië, B. carambolae in delen van Zuid-Amerika, B. invadens in Afrika en B. zonata in Afrika en Noord-Middellandse Zee. ^3,23,18 Het testen van de effectiviteit van biologische bestrijdingsmiddelen zoals F. arisanus tegen andere Bactrocera soorten moeten een hoge prioriteit, en het is onze hoop dat de toepassing van de methoden beschreven in dit protocol en de bijbehorende video-artikel, zal versnellen onderzoek naar de F. arisanus in een breder scala van locaties ^24. Tenslotte kan nader onderzoek met deze methode als uitgangspunt ook belangrijke informatie voor de kolonisatie van nieuwe ei sluipwespen ^25,1

Disclosures

We hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

Wij danken Keith Shigeteni voor hulp bij het insectary en Natasha Sostrom voor hulp bij computer graphics. Dit werk werd gefinancierd door USDA-ARS. Meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen in deze publicatie zijn die van de auteurs en komen niet noodzakelijk overeen met de standpunten van de USDA. USDA is een gelijke kansen provider en werkgever.