Summary
문화 중에 지형을 변경할 수있는 능력을 가진 세포 배양 기판을 개발하기위한 방법을 설명합니다. 방법은 영구적인 모양을 기억하는 능력을 가지고 형상 기억 고분자로 알려진 스마트 물질을 사용합니다. 이 개념은 물질과 애플 리케이션의 다양한 적응합니다.
Abstract
형상 기억 폴리머 (SMPS)는 같은 열이 1-5으로 자극의 응용 프로그램에 따라 미리 정해진 영구 모양 고정, 임시 모양에서 바꿀 수있는 능력이있다 "스마트"자료의 수업입니다. 일반적인 형상 기억 사이클에서 SMP 먼저 그 전이 온도, T 트랜스 [중 용융 온도 (T m) 또는 유리 전이 온도 (T g)]보다 높은 고온 변형입니다. 변형은 자연 탄성이며 주로 구성 네트워크 체인 (고무 탄성 이론 아래)의 conformational 엔트로피의 감소로 연결됩니다. 외부 응력 또는 응력 상수를 유지하면서 변형 SMP 그 다음 트랜스는 T 이하 온도 냉각됩니다. 냉각하는 동안, 더 단단한 상태로 (세미 - 결정 또는 유리), kinetically 트랩 또는 "정지"매크로 모양 고치로 이어지는이 낮은 엔트로피 상태에서 재료에 재료 전환. 모양 복구가 지속적으로 스트레스 무료 (거리낌없는) 조건하에 T 트랜스를 통해 자료를 가열에 의해 트리거됩니다. 네트워크 체인이 (회복 모바일로)은 thermodynamically 선호, 최대한의 - 엔트로피 상태, 영구 모양 임시 형태의 물질 변화에 휴식을 취할 수 있도록함으로써.
세포들은 주변 환경 6 기계적 특성을 조사 수 있습니다. 메커니즘은이를 통해 세포 및 물리적 환경 제어 셀 동작 사이의 기계적 상호 작용은 활성 연구 분야입니다. 정의된 지형의 기판이 메커니즘의 조사에 강력한 도구로 등장했습니다. Mesoscale, microscale 및 기판 지형의 nanoscale 패턴이 셀 정렬, 셀 부착 및 세포 트랙션 세력 7-14을 직접하기 위해 표시되었습니다. 이러한 연구 결과는 제어 및 분석 세포 배양 기간 동안 세포와 그들의 물리적 환경 사이의 기계적 상호 작용을하는 기판 지형에 대한 가능성을 강조했지만 날짜에 사용되는 기판은 일반적으로 수동되었습니다 문화 중에 현저하게 변경 프로그램 수 없습니다. 이것은 물리적 스테이 시스는 문화의 세포를 통제하는 지형 기판의 잠재력을 제한하고 있습니다.
여기 활성 세포 배양 (ACC) SMP 기판은 기판 지형과 변형의 제어 프로그램을 제공하기 위해 표면 형상 기억을 채용 것을 소개하고 있습니다. 이 기판은 임시 홈 붙이 지형에서 두 번째, 거의 평평 기억된 지형으로 전환하는 능력을 보여줍니다. 지형에이 변경 사항은 표준 세포 배양 조건 하에서 세포의 행동을 제어하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. NOA63의 등온 UV - 경화
- 맞춤 치료 챔버는 유리 슬라이드 (X 25mm X 1mm 75mm), 1mm 두께 테플론 스페이서 및 알루미늄 플레이트 (75mm X 25mm X 3mm) 그림 1과 같이 사용하여 개발되었다. 챔버는 작은 바인더 클립을 사용하여 함께 개최됩니다.
- 18 게이지 바늘을 사용하여 테플론 스페이서의 구멍을 통해서 챔버에 NOA63를 주사. NOA63가 부드럽게 주사를 쉽게하기 위해 가열 수 있습니다.
- ° C 5 분 균일한 온도로 가열 수 있도록 125으로 설정 뜨거운 접시에 챔버를 놓습니다.
- 유리의 표면에서 램프 6.5 cm 20 분, UV 램프 챔버 (표 참조 λ = 365 nm의 최대)의 NOA63를 미리 치료.
- 따뜻한는 면도날을 사용하는 동안 챔버에서 NOA63를 제거합니다.
- 125에서 뜨거운 접시 3 H 40m ° C.에 대한 자외선 아래 NOA63을 포스트 - 치료
- -20 ° C.에 desiccated NOA63를 저장
2. NOA63의 형상 기억 특성
- 하여 덤벨 표본을 준비 핫 키를 눌러인인 차원 그림 2에 표시된 사용자 정의 펀치 (표 참조)와 함께 치료 NOA63 영화.
- 인장 고정물로, 동적 기계적 분석기 (표 참조 DMA)로 표본을로드합니다. 다음과 같이 프로그램이 후, 테스트 절차를 모드 "제어를 강제로"로 악기를 설정합니다 :
- 95.00에서 평형 ° C
- 10.00 분 등온선
- 램프 힘 0.300 N / 분에 2.500 N
- 5.00 분 등온선
- 램프 2.00 ° 20.00 C / 분 ° C
- 10.00 분 등온선
- 램프 힘 0.300 N / 분 0.015로 N
- 5.00 분 등온선
- 램프 2.00 ° 95.00로 C / 분 ° C
- 반복 2-9 두 번 더 단계를
3. 활성 세포 배양 기판의 준비
- 개별 샘플은 isothermally 치료 SMP 필름에서 준비하실 수 있습니다. 원하는 샘플 크기로 레이저와 SMP 필름 컷. 계수를 줄이고 절단을 쉽게하기 위해 T g보다 높은 온도로 설정 뜨거운 접시에 SMP를 놓습니다.
- 임시 모양이 다른 여러 가지 방법으로 해결할 수 있습니다. 여기서 우리는 일시적으로 지형을 양각으로 냉각 / 가열 platens와 벤치 최고 액압 프레스를 사용합니다. T G 이상의 온도에서 platens의 온도를 설정합니다.
- embosser는 비닐 기록에 경화 에폭시로 만들어졌습니다. 이것은 병렬 홈의 임시 모양을 생산합니다. 여기, embosser는 35-40 μm의 높이 삼각형 봉우리를했고 차별 60 μm의 폭, 간격 80 μm의. embosser 다른 재료와 다른 topographies로 만들 수 있지만, 엠보싱 온도 NOA63보다 stiffer해야합니다. SMP 샘플이 embosser 엎드려서 얼굴을하고 언론의 샘플 및 embosser 배치 장소.
- 가열 platens과 샘플 사이의 접촉을하고 샘플이 균일 온도에 도달하도록 ~ 5 분 동안 유지 ~ 100 kPa의 미리을 적용합니다.
- 샘플에 1-6 MPA를 적용하고 1 분 만요. 4.7 MPA의 스트레스는 embosser의 지형의 불완전한 복제로 연결됩니다. 생산 일시적인 지형은 25-35 μm의 높이 150 μm의 넓은 봉우리를 반올림합니다. 큰 응력이 적용되는 경우에는 SMP가 파괴됩니다. 작은 amplitudes와 topographies을 소개하는 작은 응력을 적용합니다.
- T g 아래의 온도를 줄입니다. 여기서 우리는 언론 platens의 물을 냉각 기능을 사용합니다.
- 온도가 T g 아래의 경우, 적용 력을 제거합니다.
- 샘플은 -20 ° C.에 desiccated 저장할 수 있습니다 이러한 조건에서 저장하면, 우리는 비닐 레코드 embosser과 양각 샘플 달이 진폭 회복에 1 μm의 감소보다 적은을 관찰했습니다.
4. 활성 세포 배양 실험
- 생물 학적 안전 캐비닛 (BSC)의 자외선은 샘플을 소독하는 데 사용됩니다. 샘플 뚜껑없이 멸균 요리 아래로 얼굴 6 H.위한 BSC의 UV 라이트 켜고 정렬
- 새로운 무균 요리 뒤집기 샘플가 얼굴. 6 H.위한 BSC의 UV 라이트를 켭니다
- 샘플은 이제 세포와 도금 전에 비교적 안정적인 상태로 equilibrated해야합니다. 96 잘 접시에 샘플을 놓고 완전한 성장 매체 150 μl를 추가합니다.
- 원하는 부분 회복을 도달하기 전까지 5 % CO 2와 30 ° C 배양기에서 접시를 넣어. 여기 우리는 세포를 정렬하는 큰 충분한 진폭과 샘플을 생산 30 H를 사용합니다.
- 샘플은 현재 전지와 도금 수 있습니다. 새로운 96 잘 플레이트에 샘플을 놓으십시오.
- 샘플에 세포 용액 150 μl를 추가합니다. 여기 격리 세포를 (일반적으로하지 다른 세포와 접촉) 달성을 20,000 셀 / ML에서 마우스 배아 섬유아 세포 C3H/10T1/2을 사용합니다.
- 세포가 9.5 H.위한 30 ° C 배양기에서, 장소를 첨부하여 임시 지형에 확산 수 있도록하려면
- 분석 셀 morphol하기전환하기 전에 ogy는 샘플을 제거하고 얼룩과 샘플 형광 이미징을 수행합니다. 이 물질은 자외선과 가시 범위의 대부분을 통해 autofluorescence 전시하고있다. 이러한 알렉사 플루어 647으로 스펙트럼의 맨 붉은 결국 Fluorophores는 배경을 줄이기 위해 권장합니다.
- 복구 샘플을 실행하려면 37 ° C 배양기에 플레이트를 이동하고 새로운 지형 자신의 형태를 적응하는 세포를 복구하고 수 있도록 자료를 수 있도록 19 H에 대한 문화를 계속합니다.
- 샘플을 제거하고 적절한 얼룩 (filamentous 굴지 영상에 대한 phalloidin) 및 이미징 절차를 적용할 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
NOA63을 치료하면 그림 3과 같이 뛰어난 형상 기억 특성을 가진 투명 유리 고체이다. 이 경우에는 자료가 위의 프로토콜 1과 같은 치료와 51.1의 유니폼 T g를 보여줍니다되었습니다 ° C (E '드롭의 시작에서 결정). 이것은 변형의 큰 비율은 20 하역 후 고정되었다, 그 한 방법 형상 기억주기 (난방, 그림 3, deforming 냉각, 회복) ° C, 89.3의 고정 비율 15 (R F)에 해당하는에서 관찰됩니다 % (세명주기 동안 평균, R R에 대해 동일 아래). 고정 변형은 가열 중에 비교적 작은 온도 범위에서 84.4 %의 복구 비율 (R R)에서 복구. 모든 곡선이 서로 거의 정확하게 수행한다는 점에서 또한, 형상 기억 성능이 세주기 전혀 저하 나타났 없습니다.
NOA63 그것은 제조 업체에서 즉시 사용할 수 있기 때문에이 프로토콜의 사용 photoinitiator로 쉽게 치유 솔벤트가없는 예비 중합체로 제공되었습니다. 그러나, 그 구성은 공급 업체에 의해 공개되지 않습니다. 이것은 높은 세포 부착과 생존을 허용 발견되었습니다. 마지막으로, 천이 온도는 두 세포 호환 온도 사이의 회복의 의미있는 크기를 허용하도록 조정 될 수 있습니다. 천이 온도는 세포 배양과 호환되는 경우에는 그들이 세포 부착과 생존을 촉진하면 다른 폴리머 시스템의 번호는이 프로토콜과 함께 사용할 수 있습니다.
임시 지형 (홈)의 진폭은 30 시간이 지남에 따라 감소 ° C. 30 ° C 30 H으로 진폭은 ~ 50 % (그림 4 시간 0) 16 감소되었습니다. 그것은 다음 9.5 H. 이상의 또 다른 10 % 감소 복구는 37로 온도를 증가하여 실행하면 ° C, 진폭은 9.5 H. 이내의 초기 진폭의 0.5 %로 감소 사용 embosser 및 4.9 MPA의 엠보싱 스트레스 들어, 해당 페이지는 거의 평면 13 μm의 홈의 기능 변화에 해당합니다.
활성 세포 배양 기판의 사용을 통해 제어 셀 동작의 예를 들어 cytoskeleton 조직의 변화이다. 복구가 실행되기 전에 임시 홈 붙이 기판에서 굴지의 microfilaments은 홈 (그림 5A) 16의 방향을 따라 정렬합니다. 온도 증가에 의해 복구 후 microfilaments는 개편하고 무작위로 방향 있습니다. 정적 홈 또는 정적 평면을 제어 샘플 온도의 증가 (그림 5B, C) 다음에 재구성하지 않습니다.
그림 1 : NOA63 경화 챔버에 대한 도식. 단면보기 (왼쪽)와 유리 커버 (오른쪽)없이 하향식 볼 수 있습니다.
그림 2 : 대량 형상 기억 특성화에 사용되는 덤벨 기하학 W :. 좁은 부분의 길이, G : 게이지 길이, WO : 폭 전체, LO : 전체 길이, D : 그립, R 사이의 거리 좁은 섹션 L의 폭 : 필릿 반경 및 RO : 외부 반경.
그림 3 : 단일 NOA63 치료의 대량 편도 모양 메모리, 3 번 (별표 실험 증상을 나타냅니다) 반복했다. 별표로 표시된 시점에서, 고분자는 그 임시 모양을 정의하는 응력을 적용하여 가열되어 그리고 변형입니다. 이 변형은 일정한 개최하고, 온도는 고분자의 T g 아래의 임시 모양을 수정하는 감소됩니다. 온도는 다음 증가하고, 임시 부담이 줄어 듭니다으로 재료는 영구 모양 복구합니다.
그림 4 : SMP 복구가 세포 문화 호환 온도에 따라 실행하실 수 있습니다. 25.6의 진폭 ± 0.8 μm의는 다음과 엠보싱 우물을 제시± 1.5 μm의 30에서 30 H의 평균 후 12.6로 overed ° C (시간이 0, 검은 원). 샘플 37 ° C 배양기 (9.5 H)로 이동 후에, 진폭 3.5 H. 이내에 1.1 ± 0.2 μm의로 회복 진폭 ~ 0.3 ± 0.1 9.5 H 내에서 μm의 및 최종 9.5 H 이상 감지 감소 없음이 관찰되었다 (빨간색 삼각형)로 회복되었습니다. 오차 막대는 하나의 표준 편차 (n은 = 4-6)를 나타냅니다. 성분은 대표적인 샘플 profilometry 스캔 연락을하고 있습니다.
그림 5 : 셀 굴지의 cytoskeleton는 지형 변화 다음 다시 배열 양각 기판에 phalloidin 물들일 세포, 공촛점 이미지 전환 및 온도 증가하기 전에 개선 방향 (흰색 화살표)로 정렬 microfilaments을 보여줍니다.. 전환 후, microfilaments가 무작위로 방향 뜯어 있습니다. B는, 평면 제어 기판에 세포가 온도 상승 전후 무작위로 지향 microfilaments을 보여줍니다. C, 홈 붙이 제어 기판의 셀 온도가 증가 전후 홈 방향에 부합 microfilaments 보여줍니다. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. 성분은 그림 4에서와 같이됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NOA63의 T g는 쉽게 치료를 통해 온도를 제어할 수 있습니다. 우리는 셀 호환 범위에서 실행 될 수있는 SMP 기판을 생성하기 위해이를 사용합니다. NOA63가 건조 T g을 절감 물로 plasticized이기 때문에, 우리는 ° C 30 및 37 ° C. 사이 젖은 TG 범위를 이동 125에서 경화하여 건조 T g 증가
시연 활성 세포 배양 기판은 셀 동작을 제어할 수 있습니다. microfilament 재편성의 결과는 제어 및 동적 기판에 셀 동작을 시금 모두의 잠재력을 강조 표시합니다. ACC 기판 topographies의 준비 경화 금형 및 embosser 모양에 따라 간단하고 확장합니다. , nanoscale microscale 및 mesoscale에서 Topographies는 임시 형태에 대한 영구적인 형상이나 양각으로 치료하실 수 있습니다. 또한, 전지는 높은 경쟁력을 유지하고 준수하고 NOA63 16 퍼졌다.
SMP로 NOA63의 사용 개선을위한 몇 가지 영역을 제안 않습니다. 눈에 보이는 스펙트럼의 넓은 범위를 통해 Autofluorescence 높은 콘트라스트와 함께 사용할 수있는 프로브의 수를 제한합니다. 또한, 재료는 30에서 부분적인 회복을 보여줍니다 ° 세포를 도금하기 전에 C, 그럼 양각 지형이 변경됩니다. 이것은 물질 T g, 물 이해의 역학, 그리고 고정 스트레스의 기능입니다. 따라서, 기능 회복의 금액은 고정된 지형에 따라 달라집니다. 그러나, 주어진 지형에 대해, 체적 변형의 크기를 변화하는 지형 복구의 속도 제어를 허용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자 ACC 기판 준비 기술 지원 켈리 A. 버크 감사드립니다. . 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, 저작권 Elsevier (2011) : Biomaterials에 게시된 기사 데이비스 KA, 외, 형상 기억 폴리머 기판, Biomaterials, 도이의 다이나믹 셀 동작에 따라 달라집니다. 이 자료는 그랜트 번호 DMR - 0907578 이하 NSF에 의해 지원 작업을 기반으로합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
- Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. Review of progress in shape-memory polymers. J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).
- Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A. Shape Memory Polymer Research. Annu. Rev. Mater. Res. 39, 445-445 (2009).
- Lendlein, A., Kelch, S. Shape Memory Polymers. Angew. Chem. Int. Edit. 41, 2034-2034 (2002).
- Ratna, D., Karger-Kocsis, J. Recent advances in shape memory polymers and composites: a review. J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).
- Rousseau, I. A. Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations. Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).
- Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces. Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).
- du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. Force mapping in epithelial cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).
- Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography. Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).
- Stevens, M. M., George, J. H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science. 310, 1135-1135 (2005).
- Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical. 100, 1484-1484 (2003).
- Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates. J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).
- Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces. Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).
- Zhao, Y., Zhang, X. Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array. Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).
- DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. A Functionally Graded Shape Memory Polymer. Soft Matter. 7, 68-68 (2011).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).
