Summary
Eine Methode zur Entwicklung Zellkultursubstraten mit der Fähigkeit zur Topographie während der Kultur ändern beschrieben. Die Methode nutzt intelligente Materialien wie Formgedächtnis-Polymere, die die Fähigkeit, eine permanente Form auswendig gekannt haben. Dieses Konzept ist anpassungsfähig zu einer breiten Palette von Materialien und Anwendungen.
Abstract
Formgedächtnis-Polymere (SMP) sind eine Klasse von "smart" Materialien, die Fähigkeit, aus einem festen, temporäre Form zu einem vorher festgelegten permanente Form nach der Anwendung eines Reizes wie Hitze 1-5 ändern. In einer typischen Form-Gedächtnis-Zyklus ist der SMP zunächst auf eine erhöhte Temperatur, die höher als seine Sprungtemperatur T trans [entweder die Schmelztemperatur (T m) oder der Glasübergangstemperatur (T g)] ist verformt. Die Verformung ist elastisch in der Natur und vor allem zu einer Reduktion in Konformationsentropie der konstituierenden Netz-Ketten (nach dem Gummielastizität Theorie). Die deformierte SMP wird dann auf eine Temperatur unterhalb seines T trans abgekühlt unter Beibehaltung der äußeren Belastungen oder Stress konstant. Beim Abkühlen des Materials Übergänge zu einer starren Zustand (semi-kristallinen oder glasartigen), die kinetisch-Traps oder "friert" das Material in diesem Zustand niedriger Entropie führt zu makroskopischen Form Befestigung. Shape-Erholung ist durch eine kontinuierliche Erwärmung des Materials durch T trans unter einen stressfreien (unbeschränkt) Zustand ausgelöst. Indem das Netzwerk-Ketten (mit wieder gewonnener Bewegungsfreiheit), um ihre thermodynamisch begünstigt, maximal Entropie Zustand, das Material von der temporären Form in die permanente Form zu entspannen.
Die Zellen sind in der Lage Vermessung der mechanischen Eigenschaften der sie umgebenden Umwelt 6. Die Mechanismen, durch die mechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer physischen Umgebung zu kontrollieren das Verhalten der Zelle sind Bereiche der aktiven Forschung. Substrate definierter Topographie sind als leistungsfähige Werkzeuge in der Untersuchung dieser Mechanismen entstanden. Mesoscale, mikro-und nanoskaligen Strukturen von Substrat Topographie haben gezeigt, dass Zellausrichtung, Zelladhäsion und Zell Zugkräfte 7-14 direkt. Diese Ergebnisse haben das Potenzial für Substrat Topographie zu kontrollieren und Test der mechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer physischen Umgebung während der Zellkultur unterstrichen, aber die verwendeten Substrate bis dato wurden in der Regel passiv und konnte nicht so programmiert werden, erheblich verändern während der Kultur werden. Diese physikalische Stase hat das Potenzial, topographische Substrate, um Zellen in Kultur-Steuerung begrenzt.
Hier werden aktive Zellkultur (ACC) SMP Substrate eingeführt, beschäftigen Oberflächenform Speicher programmierte Steuerung der Substrat Topographie und Verformung. Diese Substrate die Fähigkeit nachweisen, um den Übergang von einem temporären gerillten Topographie auf eine zweite, fast flach auswendig Topographie. Diese Änderung in der Topographie kann verwendet werden, um das Verhalten der Zelle unter Standard-Zellkultur-Bedingungen zu kontrollieren.
Protocol
1. Isotherme UV-Härtung von NOA63
- Eine benutzerdefinierte Trockenkammer wurde mit einem Objektträger aus Glas (75 mm x 25 mm x 1 mm), eine 1 mm dicke Teflon Spacer und einer Aluminium-Platte (75 mm x 25 mm x 3 mm), wie in Abbildung 1 dargestellt. Die Kammer wird zusammen mit kleinen Binder Clips gehalten.
- Spritzen Sie die NOA63 in die Kammer durch ein Loch in die Teflon spacer mit einer 18-Gauge-Nadel. Die NOA63 schonend erhitzt werden, um Injektion zu erleichtern.
- Setzen Sie die Kammer auf einer Heizplatte bei 125 ° C eingestellt und lassen auf eine einheitliche Temperatur für 5 min erhitzen.
- Pre-Heilung der NOA63 in einer UV-Lampe Kammer (λ max = 365 nm, siehe Tabelle) für 20 min mit der Lampe 6,5 cm von der Oberfläche des Glases.
- Entfernen Sie die NOA63 aus der Kammer, während warme mit einer Rasierklinge.
- Post-Heilung der NOA63 unter dem UV-Licht für 3 h 40 m auf der Heizplatte bei 125 ° C.
- Bewahren Sie die NOA63 bei -20 ° C getrocknet
2. Shape Memory Charakterisierung von NOA63
- Bereiten Sie eine Hantel Probe durch Heißpressen einer gehärteten NOA63 Film mit einer kundenspezifischen Stanze (siehe Tabelle), deren Abmessungen sind in Abbildung 2 dargestellt.
- Legen Sie die Probe in eine dynamisch-mechanischen Analysator (DMA, siehe Tabelle) mit Zug-Vorrichtung. Stellen Sie das Gerät auf "Kraft gesteuert"-Modus, dann Programm das Testverfahren wie folgt:
- Äquilibrieren bei 95,00 ° C
- Isotherme für 10,00 min
- Ramp Kraft 0,300 N / min bis 2.500 N
- Isotherme für 5,00 min
- Ramp 2,00 ° C / min bis 20,00 ° C
- Isotherme für 10,00 min
- Ramp Kraft 0,300 N / min bis 0.015 N
- Isotherme für 5,00 min
- Ramp 2,00 ° C / min bis 95,00 ° C
- Wiederholen Sie die Schritte 2-9 noch zwei weitere Male
3. Vorbereitung von Active Zellkultursubstraten
- Einzelne Proben aus dem isotherm geheilt SMP Film hergestellt werden. Schneiden Sie die SMP-Film mit einer Rasierklinge auf die gewünschte Stichprobengröße. Legen Sie die SMP auf einer heißen Platte bei einer Temperatur höher als die T g gesetzt mit dem Modul zu reduzieren und einfache Schneiden.
- Die temporäre Form kann in einer Reihe von verschiedenen Arten fixiert werden. Hier verwenden wir ein Tischgerät hydraulische Presse mit beheizten / gekühlten Platten in ein temporäres Topographie prägen. Stellen Sie die Temperatur der Platten bei einer Temperatur oberhalb des T g.
- Ein Braille wurde von Härtet auf einer Schallplatte gemacht. Dadurch wird eine temporäre Form von parallelen Rillen. Hier hatten die embosser Dreieckpeaks 35 bis 40 mu m hoch und 60 pm breit, im Abstand von 80 um auseinander. Der Drucker kann aus anderen Materialien und mit unterschiedlichen Topografien gemacht werden, sondern muss steifer als NOA63 am Prägetemperatur. Legen Sie die SMP Proben Gesicht nach unten auf den Drucker und legen Sie die Proben und Braille in der Presse.
- Apply a ~ 100 kPa Vorspannung um den Kontakt zwischen den Heizplatten und die Proben machen und halten für ca. 5 Minuten, bis die Proben auf eine gleichmäßige Temperatur zu erreichen.
- Bewerben 1-6 MPa zu den Proben und halten Sie für 1 Minute. Eine Belastung von 4,7 MPa führt zu einer unvollständigen Replikation des Druckers Topographie. Die temporäre Topographie hervorgebracht hat Spitzen von 25 bis 35 mu m hohe und 150 um breit abgerundet. Die SMP wird Fraktur, wenn eine größere Belastung angewendet wird. Übernehmen kleinerer Belastungen Topographien mit kleineren Amplituden einzuführen.
- Reduzieren Sie die Temperatur unterhalb der T g. Hier verwenden wir die Wasserkühlung Fähigkeit der Pressplatten.
- Wenn die Temperatur unterhalb der T g ist, entfernen Sie die angelegte Kraft.
- Die Proben sind ausgetrocknet bei -20 ° C werden Wenn unter diesen Bedingungen gelagert, haben wir weniger als eine 1 um Abnahme der Amplitude Erholung nach zwei Monaten für die Proben mit eingeprägtem Schallplatte embosser beobachtet.
4. Aktive Cell Culture Experiment
- Das UV-Licht einer biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) wird verwendet, um die Proben zu sterilisieren. Ordnen Sie die Proben dem Gesicht nach unten in sterile Schalen ohne Deckel und schalten Sie den BSC UV-Licht für 6 h
- Flip-Proben, neue sterile Gerichten offen. Schalten Sie den BSC UV-Licht für 6 h
- Die Proben müssen nun ins Gleichgewicht gebracht werden, um einen relativ stabilen Zustand vor dem Ausplattieren mit Zellen. Legen Sie die Proben in einem 96-Well-Platte und fügen 150 ul komplettem Wachstumsmedium.
- Legen Sie die Platte in einem 30 ° C Inkubator mit 5% CO 2 bis zum Erreichen der gewünschten teilweisen Erholung. Hier verwenden wir 30 h Proben mit groß genug Amplitude Zellen ausrichten zu produzieren.
- Die Proben können nun mit Zellen beschichtet werden. Legen Sie die Proben in eine neue 96-Well-Platte.
- Add 150 ul Zell-Lösung zu den Proben. Hier verwenden wir C3H/10T1/2 embryonalen Maus-Fibroblasten mit 20.000 Zellen / ml zu isolierten Zellen (in der Regel nicht in Kontakt mit anderen Zellen) zu erreichen.
- Um die Zellen zu befestigen und zu verbreiten über die vorübergehende Topographie, in einem 30 ° C Inkubator für 9,5 h
- Um Assay Zelle Morphologiegie vor dem Übergang, entfernen Proben und führen Färbung und Fluoreszenz-Bildgebung der Proben. Dieses Material weist durch die meisten der UV-und sichtbaren Bereich Autofluoreszenz. Fluorophore im hohen roten Ende des Spektrums, wie Alexa Fluor 647 werden empfohlen, um Hintergrund zu reduzieren.
- Zum Auslösen Proben zu erholen, bewegen Sie die Platte um 37 ° C Inkubator und die Kultur für 19 h, um das Material zu erholen und damit die Zellen ihrer Morphologie auf die neue Topographie anpassen können.
- Nehmen Sie Proben und Anwendung geeigneter Färbung (Phalloidin für filamentöse Aktin Bildgebung) und bildgebende Verfahren.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Ausgehärtete NOA63 ist eine transparente, glasartige Feststoff, der ausgezeichnete Formgedächtniseigenschaften wie in Abbildung 3 gezeigt hat. In diesem Fall wurde das Material wie im Protokoll Nr. 1 über ausgehärtet und zeigt eine gleichmäßige T g von 51,1 ° C (ermittelt aus dem Beginn der E 'drop). Es ist aus der Einbahnstraße Formgedächtnis-Zyklen (Heizung, Verformen, Kühlung, erholt, Abbildung 3), dass ein großer Prozentsatz der Belastung nach dem Entladen bei 20 ° C wurde behoben, das entspricht einer Fixierung Verhältnis 15 (R f) von 89,3 beobachtet % (gemittelt über drei Zyklen, das gleiche unten R r). Der feste Stamm wieder auf eine Erholung Verhältnis (R r) von 84,4% in einem relativ kleinen Temperaturbereich während der Erwärmung. Darüber hinaus zeigte die Form-Gedächtnis Leistung keine Verschlechterung von bis zu drei Zyklen, in die alle Kurven fast genau folgen aufeinander.
NOA63 wurde in diesem Protokoll verwendet, weil es leicht beim Hersteller erhältlich ist und geliefert als leicht geheilt lösemittelfreie Prepolymer mit Photoinitiator. Allerdings ist seine Zusammensetzung nicht durch den Lieferanten weitergegeben. Es wurde festgestellt, dass hohe Zelladhäsion und Lebensfähigkeit zu ermöglichen. Schließlich könnte die Sprungtemperatur abgestimmt, um eine sinnvolle Größenordnung der Erholung zwischen zwei Zellen verträglichen Temperaturen zu ermöglichen. Eine Reihe von anderen Polymer-Systeme können auch mit diesem Protokoll verwendet werden, wenn die Sprungtemperatur ist kompatibel mit Zellkultur und wenn sie zu fördern Zelladhäsion und Lebensfähigkeit.
Die Amplitude der temporären Topographie (Rillen) nimmt mit der Zeit bei 30 ° C. Mit 30 h bei 30 ° C, hat die Amplitude von ~ 50% (Abbildung 4, Zeit 0) 16 reduziert worden. Es reduziert die anderen 10% über die nächsten 9,5 h Als Erholung ist durch eine Erhöhung der Temperatur auf 37 ° C ausgelöst, reduziert die Amplitude auf 0,5% des ursprünglichen Amplitude innerhalb von 9,5 h Für den Drucker eingesetzt und eine Prägung Stress von 4,9 MPa, dies entspricht einer funktionellen Veränderung von 13 um Nuten zu einer nahezu ebenen Fläche.
Ein Beispiel für ein Verhalten der Zelle durch den Einsatz von aktiven Zellkultursubstraten gesteuert wird eine Änderung in Zytoskelett-Organisation. Auf temporäre gerillten Substraten vor der Verwertung ausgelöst wird, richten Sie die Aktin-Mikrofilamente entlang der Richtung der Rillen (Abbildung 5a) 16. Nach der Erholung von der Temperatur zu erhöhen, haben die Mikrofilamente reorganisiert und sind zufällig orientiert. Kontrollproben, die statische Rillen oder eine statische ebene Oberfläche haben, nicht nach der Erhöhung der Temperatur (Abb. 5b, c) zu reorganisieren.
Abbildung 1: Schematische für NOA63 Trockenkammer. Querschnitt (links) und top-down Ansicht ohne Glasabdeckung (rechts).
Abbildung 2: Die Hantel Geometrie für Bulk-Form-Gedächtnis Charakterisierung W:. Breite des schmalen Abschnitt L: Länge des schmalen Abschnitt G: Messlänge, WO: Gesamtbreite, LO: Länge über alles, D: Abstand zwischen Griff, R: Radius von Filet und RO: Außenradius.
Abbildung 3: Der Großteil one-way Formgedächtnis einer einzigen NOA63 heilen, 3 mal wiederholt (das Sternchen zeigt experimentelle onset). An der Stelle, die mit einem Stern bezeichnet, hat das Polymer erhitzt und dann verformt, indem eine Spannung an seiner temporären Form zu definieren. Dieser Stamm wird konstant gehalten, und die Temperatur sank auf die temporäre Form unterhalb der T g des Polymers zu beheben. Anschließend wird die Temperatur erhöht, und das Material wieder zu seiner permanenten Form als temporäre Belastung wird reduziert.
Abbildung 4: SMP Erholung kann unter Zellkultur-kompatible Temperaturen ausgelöst werden. Die Amplitude von 25,6 ± 0,8 &mgr; präsentieren folgende Prägung recovered auf 12,6 ± 1,5 um nach 30 h Äquilibrierung bei 30 ° C (Zeitpunkt 0, schwarze Kreise). Nachdem die Proben auf eine 37 ° C Inkubator (9,5 h) bewegt wurden, erholten sich die Amplitude auf 1,1 ± 0,2 um innerhalb von 3,5 h Die Amplitude wieder auf ~ 0,3 ± 0,1 um innerhalb von 9,5 h und keine nachweisbaren Rückgang in den letzten 9,5 h beobachtet wurde (rote Dreiecke). Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung (n = 4-6). Die Spuren sind, kontaktieren Sie Profilometrie Scans von repräsentativen Stichproben.
Abbildung 5: Cell Aktin-Zytoskelett ordnet folgende topographische Übergang a, konfokale Aufnahmen von Zellen mit Phalloidin auf geprägtem Substrate gefärbt zeigen Mikrofilamente mit Nut-Richtung (weißer Pfeil) vor dem Übergang und Temperaturanstieg ausgerichtet.. Nach Übergang Mikrofilamente umgestellt haben, sind zufällig orientiert. B, Zellen auf flachen Substraten Kontrolle zufällig orientierten Mikrofilamente zeigen vor und nach der Temperatur zu erhöhen. C zeigen Cells auf gerillten Kontrolle Substrate Mikrofilamente mit Nut vor und nach Temperaturerhöhung ausgerichtet. Scale-Bar ist 100 um. Die Spuren sind wie in Abbildung 4.
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Discussion
Die T g NOA63 kann leicht über die Härtungstemperatur gesteuert werden. Wir nutzten diese zu SMP Substrate, die in einer Zelle kompatibel Bereich ausgelöst werden kann, zu generieren. NOA63 durch Wasser, das die trockene T g senkt plastifiziert, so steigerten wir das trockene T g durch Härtung bei 125 ° C auf dem nassen Tg Bereich zwischen 30 und 37 ° C bewegen
Die aktive Zellkultursubstraten nachgewiesen werden können, das Verhalten der Zelle steuern. Die Ergebnisse der Mikrofilament Reorganisation zeigen das Potential für die Kontrolle und Untersuchung Zelle Verhaltensweisen auf dynamischen Substraten. Die Vorbereitung des ACC Substrat Topographien ist einfach und erweiterbar auf Basis der Aushärtungsform und Braille-Form. Topographien auf der Nanometerskala, mikro-und mesoskaligen kann als die permanente Form oder geprägt für die temporäre Form geheilt werden. Darüber hinaus pflegen Zellen eine hohe Lebensfähigkeit und halten und die Ausbreitung auf NOA63 16.
Die Verwendung von NOA63 als SMP legt nahe, mehrere Bereiche für Verbesserungen. Autofluoreszenz durch einen großen Bereich des sichtbaren Spektrums beschränkt die Anzahl der Sonden, die mit hohem Kontrast verwendet werden können. Darüber hinaus zeigt das Material teilweise Erholung bei 30 ° C, so das geprägte Topographie verändert, bevor Zellen ausplattiert werden müssen. Dies ist eine Funktion des Materials T g, Dynamik der Wasseraufnahme und feste Stress. Als solche wird die Menge der funktionellen Erholung auf dem festen Topographie variieren. Doch für eine bestimmte Topographie, wird die Variation der Menge an Schüttgut Belastung für die Steuerung der Geschwindigkeit der topographischen Erholung zu ermöglichen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Kelly A. Burke für die technische Unterstützung danken, mit ACC Untergrundvorbereitung. Basierend auf den Artikel Biomaterialien veröffentlicht, Davis KA, et al, Dynamic Verhaltens von Zellen auf Formgedächtnispolymer Substrate, Biomaterialien, doi:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Dieses Material ist auf der Arbeit von NSF unter Grant No DMR-0907578 unterstützt werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
- Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. Review of progress in shape-memory polymers. J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).
- Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A. Shape Memory Polymer Research. Annu. Rev. Mater. Res. 39, 445-445 (2009).
- Lendlein, A., Kelch, S. Shape Memory Polymers. Angew. Chem. Int. Edit. 41, 2034-2034 (2002).
- Ratna, D., Karger-Kocsis, J. Recent advances in shape memory polymers and composites: a review. J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).
- Rousseau, I. A. Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations. Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).
- Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces. Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).
- du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. Force mapping in epithelial cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).
- Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography. Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).
- Stevens, M. M., George, J. H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science. 310, 1135-1135 (2005).
- Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical. 100, 1484-1484 (2003).
- Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates. J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).
- Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces. Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).
- Zhao, Y., Zhang, X. Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array. Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).
- DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. A Functionally Graded Shape Memory Polymer. Soft Matter. 7, 68-68 (2011).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).
