Summary
En metod för att utveckla substrat cellodling med förmågan att förändra topografin under kulturen beskrivs. Metoden använder sig av smarta material som kallas polymerer form minne som har en förmåga att memorera en permanent form. Detta koncept kan anpassas till en mängd olika material och applikationer.
Abstract
Form minne polymerer (SMPS) är en klass av "smarta" material som har förmågan att byta från en fast, tillfällig form till en förutbestämd fast form på ansökan av en retning såsom värme 1-5. I en typisk form minne cykel, är SMP first deformerad vid förhöjd temperatur som är högre än sin övergång temperatur, T trans [antingen smälttemperatur (T m) eller Glasningstemperaturen (T g)]. Deformationen är elastisk i naturen och främst leder till en minskning konformationsanalys entropi av de ingående nätverk kedjorna (efter gummi elasticitetsteori). Den deformerade SMP kyls sedan till en temperatur under sin T trans samtidigt som yttre påfrestning eller stress konstant. Under kylning, materialet övergångar till en styvare tillstånd (halvkristallint eller glasartad), som kinetiskt fällor eller "fryser" materialet i denna låg entropi tillstånd som leder till makroskopiska formen fastställande. Shape återhämtning utlöses genom att kontinuerligt uppvärmning av materialet genom T trans under en stressfri (obegränsad) skick. Genom att låta nätverket kedjorna (med återvunna rörlighet) att koppla till sina termodynamiskt gynnad, max-, entropi stat, väsentliga förändringar från den tillfälliga formen till det fasta form.
Celler kan kartlägga de mekaniska egenskaperna hos den omgivande miljön 6. De mekanismer genom vilka mekanisk växelverkan mellan celler och deras fysiska miljön kontroll cellens beteende är områden för aktiv forskning. Substrat definieras topografi har dykt upp som kraftfulla verktyg i utredningen av dessa mekanismer. Mesoskaliga, mikroskala, och nanoskala mönster av substrat topografi har visat sig direkt celljustering, cell adhesion och cell krafter dragkraft 7-14. Dessa resultat har understrukit potential för substratet topografi att kontrollera och analys den mekaniska interaktionen mellan celler och deras fysiska miljön under cellodling, men det substrat som hittills använts har i allmänhet varit passiv och inte kunde programmeras att förändras kraftigt under kultur. Denna fysiska stasis har begränsad potential topografiska underlag för att styra celler i kultur.
Här är aktiva cellkultur (ACC) SMP substrat införs som använder minnet ytan utformade att de ger programmerad kontroll av substrat topografi och deformation. Dessa substrat visa förmåga att övergången från en tillfällig räfflad topografi till en andra, nästan platt memorerat topografi. Denna förändring i topografi kan användas för att kontrollera cellens beteende under normala förhållanden cellkultur.
Protocol
1. Isotermiska UV-härdande av NOA63
- En anpassad bota kammare har utvecklats med en glasskiva (75 mm x 25 mm x 1 mm), en 1 mm tjock Teflon spacer, och en aluminiumplåt (75 mm x 25 mm x 3 mm) som visas i figur 1. Kammaren hålls samman med hjälp av små bindemedel klipp.
- Injicera NOA63 in i kammaren genom ett hål i Teflon spacer med en 18 gauge nål. Den NOA63 kan försiktigt värmas för att underlätta injektionen.
- Placera kammaren på en värmeplatta inställd på 125 ° C och låt värme till en jämn temperatur i 5 min.
- Pre-bota NOA63 i en UV-lampa kammare (λ max = 365 nm, se tabell) i 20 minuter med lampan 6,5 cm från ytan av glaset.
- Ta bort NOA63 från kammaren när det är varmt med hjälp av ett rakblad.
- Post-bota NOA63 under UV ljus för 3 h 40 m på värmeplattan till 125 ° C.
- Förvara NOA63 uttorkad vid -20 ° C.
2. Shape Memory Karakterisering av NOA63
- Förbered en hantel prov genom varmpressning en härdad NOA63 film med en anpassad slag (se tabell), vars dimensioner visas i figur 2.
- Ladda provet till en dynamisk mekanisk analysator (DMA, se tabell) med drag-fixtur. Ställ in instrumentet för att "tvinga kontrollerad"-läge, då programmet testproceduren enligt följande:
- Utjämna till 95,00 ° C
- Isotermiska för 10,00 min
- Ramp kraft 0,300 N / min till 2,500 N
- Isotermiska för 5,00 min
- Ramp 2,00 ° C / min till 20,00 ° C
- Isotermiska för 10,00 min
- Ramp kraft 0,300 N / min till 0,015 N
- Isotermiska för 5,00 min
- Ramp 2,00 ° C / min till 95,00 ° C
- Upprepa steg 2-9 ytterligare två gånger
3. Beredning av Aktiv Substrat Cell Culture
- Enskilda prover kan framställas från isothermally botas SMP-film. Skär SMP-film med en rakkniv till önskad urvalsstorlek. Placera SMP på en värmeplatta inställd på en högre temperatur än T g att minska modul och skärförmåga.
- Den tillfälliga formen kan fastställas på ett antal olika sätt. Här använder vi en bänk hydraulisk press med uppvärmd / kyld plattor för att skriva en tillfällig topografi. Ställ in temperaturen på plattor vid en temperatur över T g.
- En punktskrivare gjordes av härdning epoxi på en vinylskiva. Detta ger en tillfällig form av parallella spår. Här hade skrivaren triangulära toppar från 35 till 40 ìm hög och 60 ìm breda, radavstånd 80 ìm isär. Skrivaren kan göras från andra material och med olika kretsmönster, men måste vara styvare än NOA63 vid prägling temperatur. Placera SMP proverna nedåt på skrivaren och placera proverna och punktskrivare i pressen.
- Applicera en ~ 100 kPa förspänning att få kontakt mellan den värme-plattor och proverna och håll nere i ~ 5 minuter så att proverna för att nå en jämn temperatur.
- Applicera 1-6 MPa till proverna och hålla i 1 minut. Ett tryck på 4,7 MPa leder till ofullständiga replikering av skrivaren topografi. Den tillfälliga topografi produceras har rundade toppar från 25 till 35 ìm hög och 150 ìm breda. SMP kommer att spricka om en större stress tillämpas. Applicera mindre betonar att införa kretsmönster med mindre amplituder.
- Minska temperatur under T g. Här använder vi möjlighet vattenkylning av pressen plattor.
- När temperaturen ligger under T g, ta bort den applicerade kraft.
- Proverna kan förvaras uttorkad vid -20 ° C. Vid förvaring under dessa förhållanden, har vi observerat mindre än 1 mikrometer minskning i amplitud återhämtning efter två månader för prover präglad med vinylskivor skrivaren.
4. Aktiva cellen Kultur Experiment
- UV-ljuset av ett biologiskt säkerhetsskåp (BSC) används för att sterilisera proverna. Ordna prover nedåt i sterila rätter utan lock och slå på BSC UV-ljus för 6 h.
- Vänd prover till ny steril rätter uppåt. Slå på BSC UV-ljus för 6 h.
- Proverna måste nu återfå en relativt stabil tillstånd innan plätering med celler. Placera proverna i en 96 brunnar och tillsätt 150 l av kompletta tillväxt medium.
- Sätt plattan i ett 30 ° C inkubator med 5% CO 2 tills att nå den önskade partiell återhämtning. Här använder vi 30 timmar att producera prover med tillräckligt stor amplitud för att justera celler.
- Proverna kan nu klädd med celler. Placera proverna i en ny 96 brunnar.
- Tillsätt 150 l av cell lösning på proverna. Här använder vi C3H/10T1/2 musen embryonala fibroblaster på 20.000 celler / ml för att nå isolerade celler (i allmänhet inte i kontakt med andra celler).
- Om du vill att cellerna att fästa och sprids på den tillfälliga topografin, plats i en 30 ° C inkubator för 9,5 h.
- För analys cell morpholnik före övergången, ta prover och utföra färgning och fluorescens avbildning av proverna. Detta material uppvisar autofluorescens under större delen av UV-och synliga området. Fluoroforer längst röda änden av skalan som Alexa Fluor 647 rekommenderas för att minska bakgrunden.
- Att utlösa prover att återhämta sig, flytta plattan till 37 ° C inkubator och fortsätt kultur för 19 h för att låta materialet återhämta sig och låta cellerna att anpassa sin morfologi till den nya topografi.
- Ta prover och tillämpa lämpliga bets (phalloidin för fintrådiga aktin bildframställning) och bildbehandling förfaranden.
5. Representativa resultat:
Härdad NOA63 är ett öppet, glasartad fast som har goda egenskaper formar minnen som visas i Figur 3. I detta fall materialet var frisk som i protokoll nr 1 ovan och visar en enhetlig T g 51,1 ° C (bestämd från början av E "drop). Det har konstaterats från ett minne väg form cykler (värme, deformerande, kyla, återvinning, figur 3) att en stor del av stammen har fastställts efter lossning vid 20 ° C, vilket motsvarar ett fastställande ratio 15 (R f) på 89,3 % (genomsnitt över tre cykler, samma nedan för R R). Den fasta stammen återhämtat sig till en återhämtning ratio (R R) på 84,4% i ett relativt litet temperaturintervall under uppvärmning. Vidare visade formen minne avkastning är inte en försämring upp till tre cykler, i att alla kurvorna följer nästan exakt med varandra.
NOA63 användes i detta protokoll för att det är lätt tillgänglig från tillverkaren och levereras som en lätt botas utan lösningsmedel prepolymer med fotoinitiator. Men dess sammansättning inte avslöjas av leverantören. Det visade sig att låta höga cellbindning och livskraft. Slutligen kunde övergången temperaturen ställas in så att en meningsfull storlek återhämtning mellan två cell-kompatibel temperaturer. Ett antal andra polymera system skulle också kunna användas med detta protokoll om övergången temperaturen är kompatibel med cellkultur och om de främjar cell adhesion och livskraft.
Amplituden av den tillfälliga topografin (grooves) minskar med tiden vid 30 ° C. Genom 30 tim vid 30 ° C, har amplituden minskat med ~ 50% (Figur 4, tid 0) 16. Det minskar ytterligare 10% under de kommande 9,5 h. När återvinningen utlöses genom att öka temperaturen till 37 ° C, minskar amplituden till 0,5% av den ursprungliga amplituden inom 9,5 h. För den använda skrivaren och en prägling stress 4,9 MPa motsvarar detta en funktionell förändring av 13 ìm spår till en nästan plan yta.
Ett exempel på en cell beteende kontrolleras genom användning av aktiva substrat cellodling är en förändring i cytoskelettet organisationen. På tillfälliga räfflade underlag innan återhämtningen utlöses anpassa aktin microfilaments längs riktningen av spåren (Figur 5a) 16. Efter återhämtning genom temperaturhöjning har microfilaments omorganiserats och är slumpmässigt orienterade. Kontrollprover som har statiska kammar eller en statisk plan yta gör omorganisera inte efter den ökning av temperaturen (figur 5b, c).
Figur 1: Schematisk för NOA63 bota kammare. Tvärsnitt vy (vänster) och uppifrån och ned, utan skyddsglas (höger).
Figur 2: hantel geometri som används för bulk-form minne karakterisering W:. Bredden av smala avsnitt, L: längd smala avsnitt, G: gage längd, WO: bredd totalt, LO: längd, D: avståndet mellan handtag, R: radie av filé, och RO: yttre radie.
Figur 3: Större delen enkelriktade form minne av en enda NOA63 botemedel, upprepas 3 gånger (asterisk indikerar experimentell debut). Vid den punkt markeras med en asterisk har polymer värmts upp och sedan deformeras genom att tillämpa en stress för att definiera sin tillfälliga form. Denna sort är konstant och temperaturen sänks för att åtgärda den tillfälliga formen under T g av polymeren. Den höjs temperaturen och materialet återfår till sin permanenta form som den tillfälliga belastningen minskar.
Figur 4: SMP återhämtning kan utlösas i cell-kultur-kompatibel temperaturer. Amplituden på 25,6 ± 0,8 ìm närvarande följande prägling recovered till 12,6 ± 1,5 ìm efter 30 h jämvikt vid 30 ° C (tid 0, svarta cirklar). Efter att proverna flyttades till ett 37 ° C inkubator (9,5 h), återhämtade amplituden till 1,1 ± 0,2 ìm inom 3,5 h. Amplituden återhämtat till ~ 0,3 ± 0,1 ìm inom 9,5 h och ingen mätbar minskning under de sista 9,5 h observerades (röda trianglar). Felstaplar representerar en standardavvikelse (n = 4-6). Spår är kontakt Profilometrimätningar skanningar av representativa prov.
Figur 5: Cell aktin cytoskelettet ordnar efter topografiska övergången en, Confocal bilder av celler färgas med phalloidin på präglade substrat visa microfilaments linje med spår riktning (vit pil) före övergången och temperaturökning.. Efter övergången har microfilaments omarrangerade är slumpmässigt orienterade. B, Celler på platt-kontroll substrat visa slumpmässigt orienterade microfilaments före och efter temperaturökning. C, Celler på räfflade kontroll substrat visa microfilaments linje med spår riktning före och efter temperaturökning. Skala bar är 100 ìm. Spår är som i Figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T g NOA63 kan enkelt styras via härdningstemperaturen. Vi använde detta för att generera SMP substrat som kan utlösas i en cell kompatibla sortiment. NOA63 är plastad med vatten vilket sänker den torra T g, så vi ökade torra T g genom härdning vid 125 ° C för att flytta den blöta Tg varierar mellan 30 och 37 ° C.
Den aktiva cellkultur visade substrat kan kontrollera cellens beteende. Resultaten av microfilament omorganisation belysa möjligheterna för både styrning och testmetoder för cell beteenden på dynamiska substrat. Beredningen av ACC substrat kretsmönster är enkelt och utbyggbart utifrån bota mögel och punktskrivare form. Kretsmönster på nanonivå, mikroskala, och mesoskaliga kan botas som permanent form eller präglade för tillfällig form. Dessutom celler hålla en hög lönsamhet och hålla sig och sprids på NOA63 16.
Användningen av NOA63 som SMP tyder flera områden för förbättringar. Autofluorescens genom ett stort utbud av det synliga spektrumet begränsar antalet givare som kan användas med hög kontrast. Dessutom visar det material som partiellt återhämtande vid 30 ° C, så den präglade topografin kommer att ha förändrats innan cellerna är klädd. Detta är en funktion av material T g, dynamik vattenupptagning, och fasta stress. Som sådan kommer mängden av funktionell återhämtning varierar beroende på den fasta topografi. Men för en given topografi, kommer att variera mängden bulk stam möjliggör kontroll av graden av topografiska återhämtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Kelly A. Burke för tekniskt bistånd med ACC substratet. Baserat på artikel i Biomaterial, Davis KA, et al, Dynamisk cellens beteende på form minne polymera substrat, biomaterial, doi:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Detta material är baserat på arbete som stöds av NSF enligt bidragsavtal nr DMR-0.907.578.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
- Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. Review of progress in shape-memory polymers. J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).
- Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A. Shape Memory Polymer Research. Annu. Rev. Mater. Res. 39, 445-445 (2009).
- Lendlein, A., Kelch, S. Shape Memory Polymers. Angew. Chem. Int. Edit. 41, 2034-2034 (2002).
- Ratna, D., Karger-Kocsis, J. Recent advances in shape memory polymers and composites: a review. J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).
- Rousseau, I. A. Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations. Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).
- Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces. Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).
- du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. Force mapping in epithelial cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).
- Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography. Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).
- Stevens, M. M., George, J. H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science. 310, 1135-1135 (2005).
- Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical. 100, 1484-1484 (2003).
- Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates. J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).
- Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces. Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).
- Zhao, Y., Zhang, X. Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array. Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).
- DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. A Functionally Graded Shape Memory Polymer. Soft Matter. 7, 68-68 (2011).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).
