Summary
Een methode voor het ontwikkelen van celkweek substraten met het vermogen om te veranderen tijdens topografie cultuur is beschreven. De methode maakt gebruik van slimme materialen bekend als vormgeheugen polymeren die de mogelijkheid om een permanente vorm te onthouden zijn. Dit concept is aanpasbaar aan een breed scala van materialen en toepassingen.
Abstract
Vormgeheugen polymeren (SMP) zijn een klasse van "slimme" materialen die de mogelijkheid om van een vaste, tijdelijke vorm te veranderen in een vooraf bepaalde vaste vorm van de toepassing van een stimulus, zoals warmte 1-5 hebben. In een typische vorm geheugen cyclus, is het SMP eerste vervormd bij een verhoogde temperatuur die hoger is dan de overgang temperatuur, T trans [ofwel de smelttemperatuur (T m) of de glasovergangstemperatuur (T g)]. De vervorming is elastisch in de natuur en vooral leidt tot een vermindering van de conformationele entropie van de samenstellende netwerk ketens (naar aanleiding van de rubber elasticiteitstheorie). De vervormde SMP wordt vervolgens afgekoeld tot een temperatuur onder het T trans met behoud van de externe druk of stress constant. Tijdens het afkoelen, het materiaal overgangen naar een meer rigide staat (semi-kristallijn of glasachtige), die kinetisch vallen of "bevriest" het materiaal in dit lage entropie toestand leidt tot macroscopische vorm te fixeren. Vorm van het herstel wordt geactiveerd door het continu verwarmen van het materiaal via T trans onder een stress-vrije (onbeperkte) staat. Doordat het netwerk ketens (met herwonnen mobiliteit) om te ontspannen met hun favoriete thermodynamisch, maximale entropie-staat, de materiële wijzigingen van de tijdelijke vorm aan de permanente vorm te geven.
Cellen zijn in staat van landmeetkundige de mechanische eigenschappen van hun omgeving 6. De mechanismen waardoor de mechanische interacties tussen cellen en hun fysieke omgeving controle cel gedrag zijn gebieden van actief onderzoek. Substraten van gedefinieerde topografie hebben zich ontwikkeld tot krachtige tools in het onderzoek naar deze mechanismen. Mesoschaal, microschaal, en nanoschaal patronen van substraat topografie is aangetoond dat celuitlijning, celadhesie, en cel trekkrachten 7-14 direct. Deze bevindingen hebben onderstreept het potentieel voor substraat topografie te controleren en test de mechanische interacties tussen cellen en hun fysieke omgeving tijdens celkweek, maar de substraten gebruikt tot op heden zijn over het algemeen passief en kon niet worden geprogrammeerd om aanzienlijk kunnen veranderen tijdens cultuur. Deze fysieke stasis heeft beperkt de mogelijkheden van topografische ondergronden aan cellen controle in cultuur.
Hier zijn actieve cel cultuur (ACC) SMP substraten geïntroduceerd die in dienst oppervlak vorm van geheugen om geprogrammeerde controle van de ondergrond topografie en vervorming te bieden. Deze substraten demonstreren de mogelijkheid om de overgang van een tijdelijke gegroefde topografie van een seconde, bijna vlak opgeslagen topografie. Deze verandering in de topografie kan worden gebruikt om cel gedrag onder normale celcultuur condities te controleren.
Protocol
1. Isotherme UV-uithardende van NOA63
- Een aangepaste curing kamer werd ontwikkeld met behulp van een glasplaatje (75 mm x 25 mm x 1 mm), een 1 mm dikke teflon spacer, en een aluminium plaat (75 mm x 25 mm x 3 mm) zoals weergegeven in figuur 1. De kamer wordt bij elkaar gehouden met behulp van kleine bindmiddel clips.
- Injecteer de NOA63 in de kamer door een gat in de Teflon spacer met behulp van een 18 gauge naald. De NOA63 kan voorzichtig worden verwarmd tot injectie te verlichten.
- Plaats de kamer op een hete plaat ingesteld op 125 ° C en laat tot een uniforme temperatuur warmte gedurende 5 minuten.
- Pre-cure de NOA63 in een UV-lamp kamer (λ max = 365 nm, zie tabel) voor 20 min met de lamp 6,5 cm van het oppervlak van het glas.
- Haal de NOA63 uit de kamer tijdens het warme gebruik van een scheermesje.
- Post-cure de NOA63 onder het UV-licht gedurende 3 h 40 m op de hete plaat bij 125 ° C.
- Bewaar de gedroogde NOA63 bij -20 ° C.
2. Vormgeheugen Karakterisering van NOA63
- Bereid een halter exemplaar van heetpersen een uitgeharde NOA63 film met een op maat gemaakte punch (zie tabel), waarvan de afmetingen zijn weergegeven in figuur 2.
- Laad het specimen in een dynamische mechanische analyse (DMA, zie tabel) met trek-armatuur. Stel het instrument "force gecontroleerde" modus, dan is het programma van de testprocedure als volgt:
- Evenwicht bij 95,00 ° C
- Isotherme voor 10.00 min
- Ramp kracht 0.300 N / min tot 2.500 N
- Isotherme voor 5.00 min
- Ramp 2,00 ° C / min tot 20,00 ° C
- Isotherme voor 10.00 min
- Ramp kracht 0.300 N / min tot 0.015 N
- Isotherme voor 5.00 min
- Ramp 2,00 ° C / min tot 95,00 ° C
- Herhaal de stappen 2-9 nog twee keer
3. Voorbereiding van de actieve cel Cultuur Substrates
- Individuele monsters kunnen worden bereid uit de isotherm uitgeharde SMP film. Snijd de SMP film met een scheermes om de gewenste steekproefomvang. Plaats de SMP op een hete plaat die op een temperatuur hoger dan de T g om de modulus te verminderen en het snijden te vergemakkelijken.
- De tijdelijke vorm kan worden vastgesteld in een aantal verschillende manieren. Hier gebruiken we een bench top hydraulische pers met verwarmd / gekoeld platen om een tijdelijke topografie reliëf. Stel de temperatuur van de platen bij een temperatuur boven de Tg.
- Een Brailleprinter werd gemaakt door uithardende epoxy op een vinyl plaat. Dit zal een tijdelijke vorm van parallelle groeven. Hier, de Tiger had driehoekige toppen 35 tot 40 micrometer hoog en 60 micrometer breed, afstand 80 micrometer uit elkaar. De Brailleprinter kan worden gemaakt van andere materialen en met verschillende topografieën, maar moet stijver dan NOA63 zijn bij de embossing temperatuur. Plaats de SMP monsters gezicht naar beneden op de printer en plaats de monsters en Brailleprinter in de pers.
- Breng een ~ 100 kPa voorspanning om het contact tussen de verwarmings-platen en de monsters te maken en te houden voor ~ 5 minuten om de monsters op een uniforme temperatuur te bereiken.
- Van toepassing 1-6 MPa tot de monsters en houd gedurende 1 minuut. Een spanning van 4,7 MPa leidt tot onvolledige replicatie van de Brailleprinter topografie. Het geproduceerde tijdelijke topografie heeft afgeronde toppen 25 tot 35 micrometer hoog en 150 micrometer breed. De SMP zal breken als er een grotere druk wordt uitgeoefend. Van toepassing zijn kleinere belastingen topografieën voeren met kleinere amplitudes.
- Verlaag de temperatuur onder de T g. Hier gebruiken we de waterkoeling vermogen van de pers platen.
- Als de temperatuur lager is dan de T g, verwijder de toegepaste kracht.
- De monsters kunnen worden opgeslagen uitgedroogd bij -20 ° C. Wanneer opgeslagen onder deze omstandigheden, hebben we geconstateerd minder dan een 1 micrometer afname van de amplitude herstel na twee maanden voor de monsters in reliëf de vinyl Brailleprinter.
4. Actieve cel Cultuur Experiment
- De UV-licht van een biologisch veiligheidskabinet (BSC) wordt gebruikt om de monsters te steriliseren. Schik de monsters zijde naar beneden in steriele gerechten zonder deksels en zet de BSC UV-licht gedurende 6 uur
- Flip monsters naar nieuwe steriele gerechten naar boven. Zet de BSC UV-licht gedurende 6 uur
- De monsters moeten nu worden evenwicht een relatief stabiele toestand voordat plating met cellen. Plaats de monsters in een 96 wells plaat en voeg 150 ul van complete groeimedium.
- Zet de plaat in een 30 ° C incubator met 5% CO 2 tot het bereiken van de gewenste gedeeltelijk herstel. Hier gebruiken we 30 uur om monsters te produceren met groot genoeg amplitude aan cellen af te stemmen.
- De monsters kunnen nu worden bedekt met cellen. Plaats de monsters in een nieuwe 96 wells plaat.
- Voeg 150 ul van de cel oplossing voor de monsters. Hier gebruiken we C3H/10T1/2 muis embryonale fibroblasten op 20.000 cellen / ml naar geïsoleerde cellen (over het algemeen niet in contact met andere cellen) te bereiken.
- Om de cellen te bevestigen en over de tijdelijke topografie verspreiden, plaats in een 30 ° C incubator voor 9,5 uur
- Om assay cel morfologiegie vóór de overgang, verwijder monsters en het uitvoeren van vlekken en fluorescentie beeldvorming van de monsters. Dit materiaal vertoont autofluorescentie door het grootste deel van het UV en zichtbare bereik. Fluoroforen in het verre rode kant van het spectrum, zoals Alexa Fluor 647 wordt aanbevolen om achtergrond te verminderen.
- Op gang te brengen monsters om te herstellen, verplaatst u de plaat tot een 37 ° C incubator en blijven cultuur voor 19 uur om het materiaal te herstellen en laat de cellen om hun morfologie aanpassen aan de nieuwe topografie mogelijk te maken.
- Verwijder de monsters en passende vlek (phalloidin voor filamenteuze actine imaging) en beeldvorming procedures.
5. Representatieve resultaten:
Uitgehard NOA63 is een transparante, glazige vaste stof die uitstekend vormgeheugen eigenschappen zoals weergegeven in figuur 3 heeft. In dit geval werd het materiaal uitgehard als in Protocol nr. 1 boven en toont een uniforme T g van 51,1 ° C (bepaald vanaf het begin van de daling van E '). Het is waargenomen vanuit de manier waarop een vormgeheugen cycli (verwarming, vervormen, koeling, herstellende, figuur 3) dat een groot percentage van de stam werd vastgesteld na het lossen op 20 ° C, wat overeenkomt met een bevestiging verhouding 15 (R f), van 89,3 % (gemiddeld over drie cycli, dezelfde hieronder voor R r). De vaste stam hersteld op een herstel van ratio (R r) van 84,4% in een relatief kleine temperatuurbereik tijdens verwarmen. Bovendien is de vormgeheugen prestaties vertoonden geen verslechtering tot drie cycli, in dat alle bochten volgen vrijwel exact met elkaar.
NOA63 werd gebruikt in dit protocol, omdat het gemakkelijk verkrijgbaar bij de fabrikant en geleverd in een gemakkelijk te genezen oplosmiddelvrije prepolymeer met foto-initiator. Echter, is de samenstelling niet bekend gemaakt door de leverancier. Het bleek te hoog celhechting en levensvatbaarheid mogelijk te maken. Ten slotte zou de overgang temperatuur worden afgestemd op een zinvolle grootte van herstel tussen twee mobiele compatibel temperaturen mogelijk te maken. Een aantal andere polymeersystemen kan ook gebruikt worden met dit protocol indien de overgang temperatuur is compatibel met de celcultuur en als ze te bevorderen celadhesie en levensvatbaarheid.
De amplitude van de tijdelijke topografie (groeven) neemt na verloop van tijd bij 30 ° C. Uiterlijk op 30 h bij 30 ° C, is de amplitude verlaagd met ~ 50% (figuur 4, de tijd 0) 16. Het vermindert nog eens 10% in de komende 9,5 h. Wanneer het herstel wordt geactiveerd door het verhogen van de temperatuur tot 37 ° C, de amplitude vermindert tot 0,5% van de initiële amplitude binnen 9,5 uur Voor de gebruikte printer en een embossing spanning van 4,9 MPa, komt dit overeen met een functionele verandering van 13 micrometer groeven op een bijna vlakke ondergrond.
Een voorbeeld van een cel gedrag gecontroleerd door het gebruik van de actieve cel cultuur substraten is een verandering in de cytoskelet organisatie. Op tijdelijke gegroefde ondergronden voor het herstel wordt geactiveerd, het actine microfilamenten lijn in de richting van de groeven (figuur 5a) 16. Na herstel door de temperatuur te verhogen, hebben de microfilamenten gereorganiseerd en worden willekeurig georiënteerd. Controlemonsters dat statische groeven of een statische plat oppervlak hebben niet reorganiseren na de stijging van de temperatuur (figuur 5b, c).
Figuur 1: Schematisch overzicht voor NOA63 genezen kamer. Dwarsdoorsnede (links) en top-down te bekijken zonder glazen afdekplaat (rechts).
Figuur 2: De dumbbell geometrie gebruikt voor bulk-vorm geheugen karakterisering W:. Breedte van de smalle gedeelte, L: lengte van het smalle gedeelte, G: gage lengte, WO: breedte geheel, LO: lengte over alles van, D: afstand tussen de handgrepen, R: radius van de haas, en RO: buitenstraal.
Figuur 3: De bulk one-way vormgeheugen van een enkele NOA63 genezen, 3 keer herhaald (de asterisk geeft aan experimentele onset). Op het punt aangeduid met een sterretje, is het polymeer is verwarmd en wordt dan vervormd door het aanbrengen van een spanning op de tijdelijke vorm te geven. Deze soort is constant gehouden, en de temperatuur is gedaald tot het tijdelijke vorm onder de T g van het polymeer op te lossen. De temperatuur wordt vervolgens verhoogd, en het materiaal herstelt zich de permanente vorm als de tijdelijke belasting wordt verminderd.
Figuur 4: SMP herstel kan worden geactiveerd in cell-cultuur-compatibele temperaturen. De amplitude van 25,6 ± 0,8 micrometer aanwezig zijn volgende embossing recovered tot 12,6 ± 1,5 micrometer na 30 uur equilibratie bij 30 ° C (tijd 0, zwarte cirkels). Nadat de monsters werden verplaatst naar een 37 ° C incubator (9,5 h), de amplitude hersteld tot 1,1 ± 0,2 micrometer binnen 3,5 uur De amplitude herstelde ~ 0,3 ± 0,1 micrometer binnen 9,5 uur en geen waarneembare daling over de laatste 9,5 uur werd waargenomen (rode driehoekjes). Foutbalken vertegenwoordigen een standaarddeviatie (n = 4-6). Sporen zijn contact profilometrie scans van representatieve monsters.
Figuur 5: Cell actine cytoskelet herschikt na topografische overgang een, confocale beelden van cellen gekleurd met phalloidin op reliëf ondergronden zien microfilamenten in lijn met groef richting (witte pijl) vóór de overgang en de temperatuur te verhogen.. Na de overgang, microfilamenten hebben herschikt worden willekeurig georiënteerd zijn. B, cellen op vlakke ondergronden controle willekeurig georiënteerd microfilamenten tonen voor en na de temperatuur te verhogen. C, Cellen op gegroefde controle substraten tonen microfilamenten lijn met de groef richting voor en na de temperatuur te verhogen. Schaal bar is 100 micrometer. Sporen zijn zoals in figuur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De T g van NOA63 kan eenvoudig worden gecontroleerd via de uithardingstemperatuur. We gebruikten dit om SMP substraten die kunnen worden geactiveerd in een cel compatibele reeks te genereren. NOA63 is geplastificeerd door water, dat de droge T g verlaagt, zodat we meer de droge T g door uitharding bij 125 ° C om de natte Tg range bewegen tussen 30 en 37 ° C.
De actieve cel aangetoond cultuur substraten in staat zijn om cel gedrag te controleren. De resultaten van microfilament reorganisatie wijzen op de mogelijkheden voor zowel de controle en het testen cel gedrag op dynamische substraten. De voorbereiding van de ACC substraat topografieën is eenvoudig en uitbreidbaar gebaseerd op de uitharding mal en Brailleprinter vorm. Topografieën op nanoschaal, microschaal, en mesoschaal kunnen worden genezen als de vaste vorm of reliëf voor de tijdelijke vorm. Daarnaast cellen hoog te houden levensvatbaarheid en hechten en verspreid over NOA63 16.
Het gebruik van NOA63 als de SMP doet vermoeden een aantal gebieden voor verbetering. Autofluorescentie door een groot bereik van het zichtbare spectrum beperkt het aantal probes die gebruikt kunnen worden met een hoog contrast. Bovendien is het materiaal blijkt gedeeltelijk herstel bij 30 ° C, zodat het reliëf topografie zal zijn veranderd voordat cellen worden uitgeplaat. Dit is een functie van het materiaal T g, dynamiek van water opname, en vaste stress. Als zodanig wordt het bedrag van functioneel herstel variëren op basis van de vaste topografie. Echter, voor een bepaalde topografie, zal variëren van de hoeveelheid bulk stam maken voor de controle van de snelheid van de topografische herstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Kelly A. Burke bedanken voor technische bijstand met ACC voorbereiding van de ondergrond. Op basis van het artikel gepubliceerd in biomaterialen, Davis KA, et al., Dynamic cel gedrag op vormgeheugen polymeersubstraten, Biomaterialen, doi:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Dit materiaal is gebaseerd op werk ondersteund door NSF onder Grant No DMR-0907578.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
- Liu, C., Qin, H., Mather, P. T. Review of progress in shape-memory polymers. J. Mater. Chem. 17, 1543-1543 (2007).
- Mather, P. T., Luo, X. F., Rousseau, I. A. Shape Memory Polymer Research. Annu. Rev. Mater. Res. 39, 445-445 (2009).
- Lendlein, A., Kelch, S. Shape Memory Polymers. Angew. Chem. Int. Edit. 41, 2034-2034 (2002).
- Ratna, D., Karger-Kocsis, J. Recent advances in shape memory polymers and composites: a review. J. Mater. Sci. 43, 254-254 (2008).
- Rousseau, I. A. Challenges of shape memory polymers: A review of the progress toward overcoming SMP's limitations. Polym. Eng. Sci. 48, 2075-2075 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13661-13661 (1997).
- Addae-Mensah, K. A., Kassebaum, N. J., Bowers, M. J., Reiserer, R. S., Rosenthal, S. J., Moore, P. E., Wikswo, J. P. A flexible, quantum dot-labeled cantilever post array for studying cellular microforces. Sensor Actuat. a-Phys. 136, 385-385 (2007).
- du Roure, O., Saez, A., Buguin, A., Austin, R. H., Chavrier, P., Siberzan, P., Ladoux, B. Force mapping in epithelial cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2390-2390 (2005).
- Lam, T., Clem, W. C., Takayama, S. Reversible on-demand cell alignment using reconfigurable microtopography. Biomaterials. 29, 1705-1705 (2008).
- Stevens, M. M., George, J. H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science. 310, 1135-1135 (2005).
- Tan, L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical. 100, 1484-1484 (2003).
- Teixeira, A. I., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Responses of human keratocytes to micro- and nanostructured substrates. J. Biomed. Mater. Res. A. 71A, 369-369 (2004).
- Yang, M., Sniadecki, N., Chen, C. Geometric Considerations of Micro- to Nanoscale Elastomeric Post Arrays to Study Cellular Traction Forces. Adv. Mater. 19, 3119-3119 (2007).
- Zhao, Y., Zhang, X. Cellular Mechanics Study in Cardiac Myocytes Using PDMS Pillars Array. Sensor Actuat. a-Phys. 125, 398-398 (2006).
- DiOrio, A. M., Luo, X., Lee, K. M., Mather, P. T. A Functionally Graded Shape Memory Polymer. Soft Matter. 7, 68-68 (2011).
- Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates. Biomaterials. 32, 2285-2285 (2011).
