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Bioengineering

सक्रिय सेल संस्कृति आकार मेमोरी पॉलिमर

doi: 10.3791/2903 Published: July 4, 2011

Summary

संस्कृति दौरान स्थलाकृति बदलने की क्षमता के साथ सेल संस्कृति substrates के विकास के लिए एक विधि का वर्णन है. विधि स्मार्ट आकार स्मृति पॉलिमर है कि एक स्थायी आकार को याद करने की क्षमता है के रूप में जाना जाता है सामग्री का उपयोग करता है. इस अवधारणा को सामग्री और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलनीय है.

Protocol

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1. इज़ोटेर्माल NOA63 की पराबैंगनी - इलाज

  1. एक कस्टम इलाज चैम्बर (75 मिमी x 25 मिमी x 1 मिमी) एक गिलास स्लाइड, एक 1 मिमी मोटी Teflon स्पेसर, और एक एल्यूमिनियम प्लेट (75 मिमी x 25 मिमी x 3 मिमी) के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है का उपयोग कर विकसित किया गया था चैम्बर. एक साथ आयोजित छोटे बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग कर.
  2. चेंबर में Teflon स्पेसर में एक छेद के माध्यम से एक 18 गेज सुई का उपयोग NOA63 इंजेक्षन. NOA63 धीरे हो इंजेक्शन आसानी गर्म कर सकते हैं.
  3. एक गर्म 125 पर सेट डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए एक समान तापमान गर्मी की अनुमति प्लेट पर चैम्बर प्लेस.
  4. दीपक कांच की सतह से 6.5 सेमी के साथ 20 मिनट के लिए, एक यूवी दीपक कक्ष (तालिका देखें λ अधिकतम = 365 एनएम) में NOA63 पूर्व इलाज.
  5. जबकि गर्म एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर कक्ष से NOA63 निकालें.
  6. पराबैंगनी प्रकाश के तहत 125 पर 3 घंटे गर्म थाली पर 40 मीटर डिग्री सेल्सियस के लिए NOA63 पोस्ट - इलाज
  7. -20 डिग्री सेल्सियस पर desiccated NOA63 स्टोर

2. आकृति NOA63 मेमोरी विशेषता

  1. के द्वारा एक dumbbell नमूना तैयार गर्म एक स्वनिर्धारित (टेबल देखें) पंच, जिसका आयाम हैं चित्रा 2 में दिखाया के साथ एक ठीक NOA63 फिल्म दबाने.
  2. तन्यता स्थिरता के साथ, एक गतिशील यांत्रिक विश्लेषक (तालिका देखें डीएमए) में नमूना लोड. साधन सेट मोड "नियंत्रित बल", तो कार्यक्रम निम्नानुसार परीक्षण प्रक्रिया:
    1. 95.00 पर संतुलित डिग्री सेल्सियस
    2. 10.00 मिनट के लिए इज़ोटेर्माल
    3. रैंप .300 एन / मिनट 2.500 एन बल
    4. 5.00 मिनट के लिए इज़ोटेर्माल
    5. रेम्प की 2.00 डिग्री सेल्सियस / 20.00 न्यूनतम डिग्री सेल्सियस
    6. 10.00 मिनट के लिए इज़ोटेर्माल
    7. रैंप .300 एन / मिनट 0.015 करने के लिए एन बल
    8. 5.00 मिनट के लिए इज़ोटेर्माल
    9. रेम्प की 2.00 डिग्री सेल्सियस / 95.00 न्यूनतम डिग्री सेल्सियस
    10. दोहराएँ 2-9 दो से अधिक बार कदम

3. सक्रिय सेल संस्कृति Substrates की तैयारी

  1. व्यक्तिगत नमूने isothermally ठीक एसएमपी फिल्म से तैयार किया जा सकता है है. वांछित नमूना आकार के लिए एक रेजर के साथ एसएमपी फिल्म कट. एसएमपी एक गर्म टी जी की तुलना में अधिक तापमान पर सेट मापांक को कम करने और आसानी काटने थाली पर रखें.
  2. अस्थायी आकार अलग तरीके की एक संख्या में तय किया जा सकता है. यहाँ हम गरम / ठंडा platens के साथ एक बेंच शीर्ष हाइड्रॉलिक प्रेस का उपयोग करने के लिए एक अस्थायी स्थलाकृति एम्बॉसफ़िल्टर. टी जी के ऊपर एक तापमान पर platens के तापमान को निर्धारित करें .
  3. एक embosser एक vinyl रिकॉर्ड पर इलाज epoxy के द्वारा बनाया गया था. यह समानांतर grooves के एक अस्थायी आकार का उत्पादन होगा. यहाँ, embosser त्रिकोणीय 35 से 40 सुक्ष्ममापी उच्च चोटियों था और 60 सुक्ष्ममापी विस्तृत, स्थान अलावा 80 सुक्ष्ममापी. embosser अन्य सामग्री से अलग topographies के साथ बनाया जा सकता है, लेकिन embossing के तापमान पर NOA63 की तुलना में stiffer होना चाहिए. प्लेस एसएमपी नमूने embosser पर नीचे चेहरा और नमूने और प्रेस में embosser जगह.
  4. एक ~ 100 kPa हीटिंग platens और नमूने के बीच संपर्क बनाने और ~ 5 मिनट के लिए पकड़ करने के लिए नमूनों को एक समान तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति प्रीलोड लागू करें.
  5. नमूने के 1-6 MPa लागू करें और 1 मिनट के लिए पकड़. 4.7 MPa की एक तनाव embosser स्थलाकृति की अधूरी प्रतिकृति की ओर जाता है है. अस्थायी उत्पादन स्थलाकृति 25 से 35 सुक्ष्ममापी उच्च और 150 सुक्ष्ममापी विस्तृत चोटियों गोल है. एसएमपी अस्थिभंग होगा अगर एक बड़ा तनाव लागू किया जाता है. छोटे छोटे आयाम के साथ topographies परिचय तनाव लागू करें.
  6. टी नीचे तापमान कम करें . यहाँ हम प्रेस platens ठंडा पानी क्षमता का उपयोग करें.
  7. जब तापमान टी जी से नीचे है, लागू बल को हटा दें.
  8. नमूने संग्रहीत -20 ° सी. पर desiccated कर सकते हैं जब इन शर्तों के तहत संग्रहीत, हम vinyl रिकॉर्ड embosser के साथ उभरा होता नमूने के लिए दो महीने के बाद आयाम वसूली में 1 सुक्ष्ममापी कमी से भी कम है मनाया.

4. सक्रिय सेल संस्कृति प्रयोग

  1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के यूवी प्रकाश के नमूने बाँझ के लिए प्रयोग किया जाता है. व्यवस्थित नमूने बाँझ बर्तन में नीचे lids के बिना और चेहरे 6 एच. के लिए BSC यूवी प्रकाश पर बारी
  2. नए बाँझ व्यंजन के लिए फ्लिप नमूने का सामना करना पड़ता है. 6 एच. के लिए BSC यूवी प्रकाश चालू करें
  3. अब नमूने के कोशिकाओं के साथ चढ़ाना पहले एक अपेक्षाकृत स्थिर राज्य के लिए equilibrated हो की जरूरत है. एक 96 अच्छी तरह से थाली में नमूने प्लेस और पूरा मध्यम विकास के 150 μl जोड़ें.
  4. एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ थाली जब तक वांछित आंशिक वसूली तक पहुँचने रखो. यहाँ हम 30 घंटे के उपयोग के लिए बड़े कोशिकाओं संरेखित करने के लिए पर्याप्त आयाम के साथ नमूने का उत्पादन.
  5. नमूने अब कोशिकाओं के साथ चढ़ाया जा सकता है. नमूने को एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में रखें.
  6. सेल के नमूनों के लिए समाधान की 150 μl जोड़ें. यहाँ हम 20,000 कोशिकाओं / एमएल C3H/10T1/2 माउस fibroblasts भ्रूण का उपयोग करने के लिए पृथक कोशिकाओं (आम तौर पर अन्य कक्षों के साथ संपर्क में नहीं) को प्राप्त करने.
  7. कोशिकाओं को देते हैं और अस्थायी स्थलाकृति पर फैल करने के लिए, एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 9.5 एच. के लिए जगह की अनुमति
  8. परख सेल morphol के लिएसंक्रमण से पहले ogy, नमूने निकालने और धुंधला हो जाना और नमूने के प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन. इस सामग्री यूवी और दिखाई रेंज के अधिकांश के माध्यम से autofluorescence दर्शाती है. दूर Alexa Fluor 647 जैसे स्पेक्ट्रम के लाल अंत में fluorophores पृष्ठभूमि को कम करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
  9. ठीक करने के लिए नमूनों को ट्रिगर करने के लिए, एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर की थाली ले जाने और 19 घंटे के लिए संस्कृति को जारी रखने के लिए ठीक करने के लिए और कोशिकाओं को अनुमति देने के लिए नए स्थलाकृति उनकी आकारिकी अनुकूल सामग्री की अनुमति.
  10. नमूने निकालें और उचित (filamentous actin इमेजिंग के लिए phalloidin) दाग और इमेजिंग प्रक्रियाओं लागू.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

NOA63 ठीक एक पारदर्शी, बेजान ठोस है कि उत्कृष्ट आकार स्मृति के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है गुण है. इस मामले में सामग्री के ऊपर एक प्रोटोकॉल के रूप में ठीक किया गया था और 51.1 के एक समान टी जी से पता चलता है डिग्री सेल्सियस ('ई ड्रॉप की शुरुआत से निर्धारित). यह एक तरह आकार स्मृति (हीटिंग, deforming, ठंडा, ठीक, चित्रा 3) चक्र कि तनाव का एक बड़ा प्रतिशत 20 पर उतारने के बाद तय किया गया था ° सी, 15 89.3 फिक्सिंग के अनुपात (च आर) के लिए संगत से मनाया जाता है % (तीन चक्र पर औसतन, अनुसंधान और अनुसंधान के लिए एक ही नीचे). तय तनाव 84.4% की वसूली (आर आर) एक अपेक्षाकृत छोटे हीटिंग के दौरान तापमान रेंज में अनुपात में बरामद किए . इसके अलावा, आकार स्मृति प्रदर्शन कोई गिरावट नहीं दिखाया तीन चक्रों के लिए, में है कि सभी घटता लगभग ठीक एक दूसरे के साथ पालन करें.

NOA63 इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था क्योंकि यह निर्माता से आसानी से उपलब्ध है और एक आसानी से ठीक हो photoinitiator साथ विलायक मुक्त prepolymer के रूप में की आपूर्ति. हालांकि, इसकी रचना आपूर्तिकर्ता द्वारा खुलासा नहीं किया है. यह उच्च सेल लगाव और व्यवहार्यता की अनुमति पाया गया था. अंत में, संक्रमण के तापमान के लिए दो सेल संगत तापमान के बीच वसूली के एक सार्थक परिमाण की अनुमति देने के लिए tuned किया जा सकता है. अन्य बहुलक प्रणालियों के एक नंबर भी इस प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जा सकता है अगर संक्रमण तापमान सेल संस्कृति के साथ संगत है और अगर वे कोशिका आसंजन और व्यवहार्यता को बढ़ावा देने.

अस्थायी स्थलाकृति (grooves) के आयाम 30 में समय के साथ घट जाती है डिग्री सेल्सियस 30 ° C पर 30 घंटे तक आयाम ~ 50% (चित्रा 4, 0 समय) 16 के द्वारा कम हो गया है . यह अगले एच. 9.5 से अधिक एक 10% कम कर देता है जब वसूली 37 तक तापमान में वृद्धि से शुरू हो रहा है डिग्री सेल्सियस, आयाम 9.5 एच. के भीतर प्रारंभिक आयाम के 0.5% तक कम कर देता है इस्तेमाल embosser और 4.9 MPa की एक embossing तनाव के लिए, यह लगभग एक फ्लैट सतह के 13 सुक्ष्ममापी grooves के एक कार्यात्मक परिवर्तन से मेल खाती है है.

एक सेल सक्रिय सेल संस्कृति substrates के उपयोग के माध्यम से नियंत्रित व्यवहार का एक उदाहरण cytoskeleton संगठन में एक परिवर्तन है. अस्थायी grooved substrates पर वसूली शुरू हो रहा है से पहले, actin microfilaments grooves के (चित्रा 5a) 16 की दिशा के साथ संरेखित करें. तापमान में वृद्धि से वसूली के बाद, microfilaments पुनर्गठित और अनियमित उन्मुख होते हैं. नियंत्रण के नमूने है कि स्थिर grooves या एक स्थिर सपाट सतह तापमान में वृद्धि (चित्रा 5 ब, ग) के बाद पुनर्निर्माण नहीं करते .

चित्रा 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध NOA63 इलाज चैम्बर के लिए. क्रॉस अनुभाग दृश्य (बाएं) और गिलास को कवर (दाएं) के बिना ऊपर से नीचे देखने.

चित्रा 2
चित्रा 2: dumbbell थोक आकार स्मृति लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया ज्यामिति डब्ल्यू: संकीर्ण अनुभाग की लंबाई, जी: पण लंबाई, WO: चौड़ाई कुल मिलाकर, LO: कुल लंबाई, डी: पकड़ती है, अनुसंधान के बीच दूरी संकीर्ण अनुभाग में, एल की चौड़ाई: पट्टिका की त्रिज्या, और आरओ: बाहरी त्रिज्या.

चित्रा 3
चित्रा 3: एक तरह से थोक एक एकल NOA63 इलाज के आकार स्मृति, 3 बार (तारांकन इंगित करता है प्रयोगात्मक शुरुआत है) दोहराया . एक asterisk के साथ चिह्नित बिंदु पर, बहुलक गर्म किया गया है और एक तनाव को लागू करने के लिए अपने अस्थायी आकार को परिभाषित द्वारा है तो विकृत. यह तनाव लगातार आयोजित की जाती है, और तापमान के लिए टी जी बहुलक के नीचे अस्थायी आकार तय कमी आई है. तापमान तो बढ़ जाती है और उसके स्थायी आकार करने के लिए सामग्री ठीक है के रूप में अस्थायी तनाव कम है.

चित्रा 4
चित्रा 4: एसएमपी वसूली सेल संस्कृति - संगत तापमान के तहत शुरू किया जा सकता है है. 25.6 के आयाम ± 0.8 सुक्ष्ममापी निम्नलिखित embossing आरईसी मौजूद30 30 घंटे संतुलन के बाद ± 1.5 सुक्ष्ममापी 12.6 overed डिग्री सेल्सियस (0 समय, काले हलकों). के बाद एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (9.5 घंटे) करने के लिए नमूने ले जाया गया, आयाम 3.5 एच. के भीतर 1.1 ± 0.2 सुक्ष्ममापी बरामद आयाम ~ ± 9.5 घंटे के भीतर 0.1 सुक्ष्ममापी और अंतिम 9.5 घंटे से अधिक detectable कोई कमी मनाया गया 0.3 (लाल त्रिकोण) बरामद किए. त्रुटि सलाखों के एक मानक विचलन (एन = 4-6) का प्रतिनिधित्व करते हैं. निशान प्रतिनिधि नमूने के profilometry स्कैन संपर्क कर रहे हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5: सेल actin cytoskeleton स्थलाकृतिक संक्रमण के बाद rearranges उभरा substrates पर phalloidin साथ दाग कोशिकाओं के एक, Confocal छवियों नाली दिशा (सफेद तीर) संक्रमण और तापमान में वृद्धि से पहले के साथ गठबंधन microfilaments दिखाते हैं .. संक्रमण के बाद, microfilaments पुनर्व्यवस्थित अनियमित उन्मुख हैं ख, फ्लैट नियंत्रण substrates पर कक्ष तापमान में वृद्धि से पहले और बाद में अनियमित उन्मुख microfilaments दिखाने ग. Grooved नियंत्रण substrates पर कक्ष दिखाने के लिए microfilaments तापमान में वृद्धि से पहले और बाद में नाली दिशा के साथ गठबंधन. स्केल बार 100 सुक्ष्ममापी है. निशान के रूप में चित्रा 4 में हैं.

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Discussion

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NOA63 के टी जी आसानी से इलाज के तापमान के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है . हम इस प्रयोग एसएमपी substrates कि एक सेल संगत रेंज में चालू किया जा सकता है उत्पन्न. NOA63 पानी जो सूखी टी जी को कम करती है द्वारा plasticized है, तो हम 125 पर इलाज डिग्री सेल्सियस गीला टीजी रेंज 30 और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच स्थानांतरित करने के लिए सूखी टी जी की वृद्धि हुई

सक्रिय सेल संस्कृति का प्रदर्शन substrates के सेल व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए कर रहे हैं. microfilament पुनर्गठन के परिणाम दोनों को नियंत्रित करने और गतिशील substrates पर सेल व्यवहार परख करने की क्रिया के लिए क्षमता पर प्रकाश डाला. एसीसी सब्सट्रेट topographies की तैयारी इलाज मोल्ड और embosser आकार के आधार पर सरल और विस्तार योग्य है. Nanoscale, microscale, और mesoscale पर topographies स्थायी या अस्थायी आकार के लिए आकार उभरा के रूप में ठीक किया जा सकता है है. इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने और पालन और 16 NOA63 पर फैल.

एसएमपी के रूप में NOA63 की प्रयोग है सुधार के लिए कई क्षेत्रों सुझाव है. दृश्य स्पेक्ट्रम की एक बड़ी रेंज के माध्यम से Autofluorescence जांच जो उच्च विपरीत के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है की संख्या की सीमा. इसके अलावा, सामग्री पर 30 आंशिक वसूली से पता चलता है ° सी, तो उभरा स्थलाकृति पहले कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है परिवर्तित होगा. यह सामग्री टी, पानी तेज की गतिशीलता, और निर्धारित तनाव के एक समारोह है. जैसे, कार्यात्मक वसूली की राशि तय की स्थलाकृति पर आधारित अलग अलग होंगे. हालांकि, एक दिया स्थलाकृति के लिए, थोक तनाव की राशि अलग स्थलाकृतिक वसूली की दर के नियंत्रण के लिए अनुमति देगा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए तकनीकी सहायता के लिए एसीसी सब्सट्रेट तैयारी के साथ केली ए बर्क धन्यवाद देना चाहूंगा. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, कॉपीराइट Elsevier (2011): बायोमैटिरियल्स में प्रकाशित लेख, डेविस के.ए., एट अल, आकार स्मृति बहुलक substrates, बायोमैटिरियल्स, doi पर गतिशील सेल व्यवहार के आधार पर. इस सामग्री को अनुदान DMR 0907578 - सं के तहत NSF द्वारा समर्थित काम पर आधारित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOA63 Norland Products, Inc. NOA63 Lot number 111
Dogbone Punch TestResource, Inc. Shakopee, MN Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03)
Benchtop Hydraulic Press Carver 3851
C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts ATCC CCL-226
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific, Inc. 1357
UV Lamp Spectroline SB-100PC
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) TA Instruments Q800
Inverted Fluorescence Microscope Leica Microsystems Leica DMI 4000B
Confocal Laser Scanning Microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective

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References

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