Summary
培養中に地形を変更する機能を細胞培養基板を開発するための方法が説明されています。このメソッドは永続的な形状を記憶する能力を持つ形状記憶ポリマーとして知られているスマート材料を利用しています。この概念は、材料と幅広い用途に適応可能です。
Abstract
形状記憶ポリマーは、（SMPS）の固定、一時的な形状からそのような熱〜5程度の刺激の印加時にあらかじめ決められた永久的な形状に変更する能力を持っている"スマート"の材料のクラスです。典型的な形状記憶サイクルでは、SMPは、まず、その転移温度、T トランス [いずれかの融解温度（T m）またはガラス転移温度（T g）]よりも高い高温で変形される。変形は本質的に弾性であり、主に構成するネットワークのチェーン（ゴム弾性の理論に続く）のコンフォメーションエントロピーの減少につながります。外部の歪みや応力を一定に保ちながら変形SMPは、そのT トランス以下の温度に冷却される。冷却時、より硬質状態（半結晶性またはガラス）、速度論的にトラップまたは"フリーズ"巨視的な形状の固定につながるこの低エントロピー状態の物質の材料に移行。形状回復は継続的にストレスのない（制約されていない）状態でT トランスを介して材料を加熱することによってトリガされます。一時的な形状から永久的な形状への重大な変更、それらの熱力学的に有利、最大エントロピー状態にリラックスしてネットワークのチェーンを（取り戻した移動度を持つ）ことを可能にしています。
細胞は、その周囲の環境6の機械的性質を調査することが可能です。メカニズムは、経由する細胞とそれらの物理的な環境制御セルの動作との間の力学的相互作用が活発な研究の領域です。定義されている地形の基質は、これらのメカニズムの研究における強力なツールとして浮上している。メソスケール、マイクロスケール、および基板の地形のナノスケールのパターンは、セルの配置、細胞接着、および細胞の牽引力7-14を導くことが示されている。これらの知見は、細胞培養中に細胞とその物理的環境との間の力学的相互作用を制御し、分析するために基板の地形の可能性を強調しているが、これまでに用いられる基板は、一般的に消極的だったと文化の間に大幅に変更するようにプログラムすることができませんでした。この物理的な停滞は、培養中の細胞を制御するための地形基板の可能性を制限している。
ここでは、アクティブな細胞培養（ACC）SMPの基板は、基板の地形や変形のプログラム制御を提供するために、表面の形状記憶を採用することを紹介しています。これらの基板は、一時的な溝地形から二番目、ほぼ平坦な記憶地形に移行する能力を実証。地形の変化は、標準細胞培養条件下での細胞挙動を制御するために使用することができます。
Protocol
1。 NOA63の等温UV硬化
- カスタム硬化チャンバーは、 図1に示すようにガラスのスライド（75ミリメートル× 25ミリメートル× 1mm）を、厚さ1mmのテフロンスペーサー、及びアルミ板を（75ミリメートル× 25ミリメートル× 3mm）を使用して開発されました。チャンバーは、小さなバインダークリップを用いて一緒に開催されます。
- 18ゲージの針を使用してテフロンのスペーサーの穴を通ってチャンバ内にNOA63を注入する。 NOA63を穏やかに注入を容易にするために加熱することができます。
- ° C、5分間均一な温度に加熱することができるように125に設定したホットプレート上でチャンバーを配置。
- ガラスの表面からランプ6.5センチメートルて20分間、（表を参照してはλmax = 365nm）をUVランプ室内のNOA63を事前に治す。
- 暖かいカミソリの刃を使用しながらチャンバーからNOA63を削除します。
- 125℃のホットプレート上で3時間40メートル℃でUV光下でNOA63をポストキュア
- -20℃で乾燥NOA63を保存する
2。 NOA63の形状記憶特性
- その寸法を図2に示されているカスタマイズされたパンチと硬化NOA63フィルム（表を参照）、ホットキーを押すことでダンベル状試験片を準備します。
- 引張治具と、動的機械分析装置（表を参照してDMA）に検体をロードします。次のようにプログラムして、テスト手順をモード"の制御を強制的に"するために楽器を設定します。
- 95.00で平衡化° C
- 10.00分間等温
- ランプ力0.300 N / minまで2.500 N
- 5.00分間等温
- ランプ2.00 20.00 ° C /分° C
- 10.00分間等温
- ランプ力0.300 N /分0.015〜N
- 5.00分間等温
- ランプ2.00 95.00℃/分° C
- 手順の2から9までをさらに2回繰り返す
3。アクティブな細胞培養基板の作製
- 個々のサンプルは等温硬化SMPフィルムから調製することができる。必要なサンプルサイズにかみそりでSMPのフィルムを切り取ります。率を低下し、カットを容易にするためのT gより高い温度に設定したホットプレート上でSMPを置きます。
- 一時的な形状は、さまざまな方法で修正することができます。ここでは、一時的な地形をエンボスする冷却/加熱プラテンとベンチトップ油圧プレスを使用してください。 Tgが上記の温度でプラテンの温度を設定します。
- 点字は、ビニールレコードでエポキシを硬化させることにより行われた。これは、平行な溝の一時的な形状を生成します。ここで、点字が35〜40μmの高い三角形のピークがあったとは別に60μm幅、間隔80μmである。点字は、他の材料から、さまざまな地形で行うことができますが、エンボス加工温度でNOA63より硬めにする必要があります。 SMPのサンプルが点字に下向きに配置し、プレスでサンプルと点字を配置。
- 加熱プラテンとサンプル間の接触を行い、試料が均一な温度に達するように〜5分間保持するために〜100 kPaのプリロードを適用します。
- サンプルに1から6メガパスカルを適用し、1分間保持する。 4.7メガパスカルの応力は、点字の地形の不完全な複製につながります。生成された一時的な地形は、25〜35μmの高さ150μmの広いピークを四捨五入しています。大きなストレスが印加されている場合、SMPが破損することになります。小さい振幅で地形を紹介する小さなストレスを適用します。
- T g未満の温度を減少させる。ここでは、プレスプラテンの水の冷却機能を使用してください。
- 温度がT g未満の場合は、加えられる力を取り外します。
- サンプルは-20℃で乾燥保存することができます。これらの条件下で保存した場合、我々はビニールレコードの点字をエンボス加工サンプルの2ヶ月後に振幅の回復には1μmの減少よりも小さいを観察している。
4。アクティブな細胞培養実験
- 生物学的安全キャビネット（BSC）の紫外光は、試料を滅菌するために使用されます。サンプルはふたなしで滅菌皿に裏向きに配置し、6時間BSCのUVライトをオンにする
- 表向き新しい滅菌シャーレに試料を反転させる。 6時間BSCのUVランプをオンにする
- サンプルは、細胞とメッキの前に比較的安定した状態に平衡化する必要があります。 96ウェルプレートに試料を置き、完全増殖培地150μlを加える。
- 目的の部分的な回復に達するまで、5％CO 2で30℃インキュベーターでプレートを置く。ここでは、セルを整列するために十分な大きさの振幅で試料を作製するために30時間を使用してください。
- サンプルは、現在のセルでめっきすることができる。新しい96ウェルプレートにサンプルを置きます。
- サンプルに細胞溶液150μlを加え。ここでは、分離した細胞を（一般に他の細胞と接触して）達成するために20,000細胞/ mlでC3H/10T1/2マウス胚線維芽細胞を使用してください。
- 細胞は9.5時間にわたって30℃インキュベーターで、場所を添付し、一時的な地形に広がるできるようにするには
- アッセイ細胞morpholへ遷移前ogy、サンプルを削除し、染色し、試料の蛍光イメージングを行う。この材料は、紫外線と可視域の大部分を自己蛍光示す。などのAlexa Fluor 647のようなスペクトルの遠赤端に蛍光色素は、バックグラウンドを減らすことをお勧めします。
- 回復するためにサンプルをトリガーするために、37℃のインキュベーターにプレートを移動させ、新たな地形にその形態を適応させるために細胞を回収し、許可するように材料を可能にするために19時間培養を続ける。
- サンプルを削除し、適切な染色（線維状アクチンイメージングファロイジン）と撮像法を適用する。
5。代表的な結果：
NOA63を硬化すると、 図3に示すように優れた形状記憶特性を持つ透明な、ガラス状の固体である。この場合、材料は上記のプロトコル1のように硬化および51.1の均一T gを示していた° C（E'ドロップダウンの開始から決定）。それは株の大部分が20℃アンロード後に固定された、という一方通行の形状記憶サイクル（加熱、回復、冷却、変形する、 図3）° C、89.3の固定比率15（R F）に相当するから観察され％（3サイクルにわたって平均を表し、R rの同じ下）。固定株は、加熱時の比較的小さな温度範囲で84.4パーセントの回収率（R R）で回収。全ての曲線が互いにほぼ正確に従うという点でさらに、形状記憶性能は、3つのサイクルにも劣化を示さなかった。
NOA63は、それが製造業者から容易に利用できるため、このプロトコルで使用され、光開始剤と容易に硬化無溶剤型プレポリマーとして供給されました。しかし、その組成は供給者によって開示されていない。それは、高い細胞接着と生存率を可能にすることがわかった。最後に、転移温度は、2つのセルの互換性のある温度の間に回復の意味の大きさを許可するように調整することができます。転移温度は、細胞培養と互換性があるかどうか、彼らは細胞接着と生存率を促進する場合、他のポリマー系の数も、このプロトコルで使用することができる。
一時的な地形の振幅（溝）が30で、時間の経過に従って短く℃の30 ° Cで30 hによって、振幅が約50％（ 図4、時間0）16分短縮されました。それは次の9.5時間かけて別の10％を削減回復は、温度を37増加させることによりトリガーされると° C、振幅は9.5時間以内に初期振幅の0.5％に削減使用される点字および4.9 MPaのエンボス加工ストレスの場合、これはほぼ平坦な表面から13μmの溝の機能的変化に対応しています。
アクティブな細胞培養基板を使用して制御セルの動作の例は、細胞骨格の組織の変化である。リカバリーが起動される前に一時的な溝基板上に、アクチンミクロフィラメントは、溝（ 図5a）16の方向に沿って整列します。温度上昇によって回復した後、マイクロフィラメントは、再編成し、ランダムに配向されている。静的溝または静的平らな面を持っているコントロールのサンプルは、温度の上昇（ 図5b、c）の後に再編成しないでください。
図1：NOA63硬化室の回路図。断面図（左）とガラスカバー（右）のないトップダウンビュー。
図2：バルク形状記憶の特性評価に使用するダンベル形状W：狭いセクションの幅、L：狭いセクションの長さ、G：ゲージ長、WO：幅全体の、LO：全長、D：グリップ、R間の距離：フィレットの半径、およびRO：外側の半径。
図3：シングルNOA63治療法のバルク一方向の形状記憶は、3回（アスタリスクは、実験的な発症を示す）を繰り返す。アスタリスク（*）で示される時点では、ポリマーが加熱され、その一時的な形状を定義するためにストレスを印加することによって変形される。このひずみは一定に保たれ、温度は、ポリマーの Tg以下の一時的な形状を修正するために減少しています。次いで温度を上昇し、一時的な歪みが低減されるような材料は、恒久的な形状に回復している。
図4：SMPの回復は、細胞培養と互換性のある温度の下で開始することができます。 25.6の振幅±0.8μmには、次のエンボスRECを提示± 1.5μmの30で30時間平衡化した後、12.6 overed ° C（時間0、黒丸）。サンプルは37℃インキュベーター（9.5時間）に移動した後に、振幅は3.5時間以内に1.1 ± 0.2ミクロンにまで回復振幅は（赤の三角形）が観察された〜0.3 ± 0.1 9.5時間以内程度と最後の9.5時間以上、検出可能な低下にまで回復。エラーバーは、一つの標準偏差（n = 4-6）を表す。トレースは、代表的なサンプルの接触形状測定のスキャンです。
図5：セルのアクチン細胞骨格は、地形の移行は、次の再配列、エンボス加工基板上ファロイジンで染色した細胞の共焦点画像は、転移と温度上昇の前に溝方向（白矢印）に合わせマイクロフィラメントを示す。移行後は、マイクロフィラメントが再配置されているランダムに配向している。bは、平坦な制御基板上に細胞が温度上昇する前と後にランダムに配向マイクロフィラメントを示す。C、溝制御基板上のセルには温度上昇の前と後の溝方向に沿ったマイクロフィラメントを示す。スケールバーは100μmである。トレースは、 図4のとおりです。
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Discussion
NOA63のT gは簡単に硬化温度で制御することができます。我々は細胞互換性のある範囲内で誘発されることSMP基板を生成するために、これを使用する。 NOA63が乾燥したT gを下げる水により可塑化されるので、° Cが30及び37℃の間にぬれたTgの範囲を移動する125℃硬化させることにより乾燥したT gを増加
実証アクティブな細胞培養の基質は、細胞挙動を制御することができます。マイクロフィラメントの再編成の結果は、動的な基板上の制御およびアッセイ細胞の振る舞いの両方の可能性を強調する。 ACC基板トポグラフィーの準備は、硬化型と点字の形状に基づいて、シンプルで拡張可能です。 、ナノスケール、マイクロ、およびメソスケールでの地形は、一時的な形状のための永久的な形状やエンボス加工のように硬化させることができます。さらに、細胞は高い生存性を維持し、付着してNOA63 16日に広がった。
SMPとしてNOA63の使用は、改善のためのいくつかの領域を示唆しているではありません。可視スペクトルの大規模な範囲を介して自家蛍光は、高コントラストで使用できるプローブの数を制限します。さらに、材料は30℃で部分的な回復を示す細胞が播種される前に、ので、エンボス加工の地形が変化してしまうでしょう。これは、材料のT g、水の吸収のダイナミクス、および固定ストレスの関数です。このように、機能回復量が固定された地形に応じて変化します。ただし、特定の地形のため、バルクひずみの量を変えると地形回収率の制御が可能になります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、ACC基板の準備と技術支援のためにケリーA.バークに感謝したいと思います。 。ら 、 バイオマテリアルに掲載された記事、デイビスKAに基づいて、動的な細胞の形状記憶ポリマー基板上への行動、 生体材料 、土井：10.1016/j.biomaterials.2010.12.006、著作権エルゼビア（2011）。この材料は、グラント番号DMR - 0907578の下NSFによってサポートされている作業に基づいています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
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