Summary
Um método para o desenvolvimento de substratos de cultura de células com a capacidade de alterar a topografia durante a cultura é descrito. O método faz uso de materiais inteligentes conhecidos como polímeros com memória de forma que têm a capacidade de memorizar uma forma permanente. Este conceito é adaptável a uma vasta gama de materiais e aplicações.
Abstract
Polímeros com memória de forma (SMPs) são uma classe de materiais "inteligentes" que têm a capacidade de mudar de uma forma, fixa temporária a uma forma pré-determinada permanente sobre a aplicação de um estímulo, como o calor 1-5. Em um ciclo típico de memória de forma, o SMP é o primeiro deformado a uma temperatura elevada que é superior à sua temperatura de transição, T trans [ou a temperatura de fusão (T m) ou a temperatura de transição vítrea (T g)]. A deformação é elástica na natureza e, principalmente, leva a uma redução da entropia conformacional das cadeias constituintes da rede (seguindo a teoria da elasticidade de borracha). A SMP deformado é então resfriado a uma temperatura abaixo de sua T trans, mantendo a tensão externa ou estresse constante. Durante o resfriamento, as transições de material para um estado mais rígida (semi-cristalino ou vítreo), que cineticamente armadilhas ou "congela" o material neste estado de baixa entropia levando a fixação forma macroscópica. Recuperação de forma contínua é provocada por aquecimento do material através da T trans sob um stress-free condição (sem restrições). Ao permitir que as cadeias de rede (com mobilidade recuperou) para relaxar a sua termodinamicamente favorecido, o estado máximo de entropia, o material muda de forma temporária à forma permanente.
Células são capazes de levantamento das propriedades mecânicas do seu ambiente circundante 6. Os mecanismos pelos quais as interações mecânicas entre as células e seus ambiente físico comportamento da célula de controle são áreas de pesquisa ativa. Substratos de topografia definida surgiram como ferramentas poderosas na investigação destes mecanismos. Mesoescala, microescala, e os padrões em nanoescala da topografia do substrato foram mostrados para dirigir o alinhamento celular, adesão celular, e as forças de tração de células 7-14. Esses achados têm ressaltou o potencial para a topografia do substrato para controlar e ensaio as interações mecânicas entre as células e seu meio ambiente físico durante a cultura de células, mas os substratos utilizados até à data têm sido geralmente passivo e não poderia ser programado para mudar significativamente durante a cultura. Esta estase física tem limitado o potencial de substratos topográfica para controlar células em cultura.
Aqui, ativos de cultura de células substratos (ACC) são introduzidos SMP que utilizam memória de superfície de forma programada para fornecer controle da topografia do substrato e deformação. Estes substratos demonstrar a capacidade de transição de uma topografia temporária ranhuras para um segundo, topografia quase plana memorizado. Esta mudança na topografia pode ser usado para controlar o comportamento de células sob condições de cultura de células padrão.
Protocol
1. Isotérmica de cura UV-NOA63
- A câmara de cura personalizado foi desenvolvido utilizando uma lâmina de vidro (75 mm x 25 mm x 1 mm), um espaçador de 1 milímetro de espessura Teflon, e uma placa de alumínio (75 mm x 25 mm x 3 mm), conforme mostrado na Figura 1. A câmara é realizada em conjunto com grampos da pasta pequena.
- Injetar o NOA63 na câmara através de um buraco no espaçador Teflon usando uma agulha de calibre 18. O NOA63 pode ser gentilmente aquecida para facilitar a injeção.
- Coloque a câmara sobre uma chapa quente fixado em 125 ° C e deixe aquecer a uma temperatura uniforme por 5 min.
- Pré-cura do NOA63 em uma câmara da lâmpada UV (λ max = 365 nm, ver tabela) por 20 minutos com a lâmpada de 6,5 cm da superfície do vidro.
- Remover o NOA63 da câmara a quente usando uma lâmina de barbear.
- Pós-cura a NOA63 sob a luz UV por 3 h 40 m na placa quente a 125 ° C.
- Armazenar os NOA63 desidratado a -20 ° C.
2. Caracterização memória de forma NOA63
- Prepare um espécime dumbbell por prensagem a quente uma curado NOA63 filme com um soco personalizado (ver tabela), cujas dimensões são mostrados na Figura 2.
- Carregar a amostra em um analisador dinâmico mecânica (DMA; ver tabela) com fixação de tração. Definir o instrumento para "força controlada" modo, então o programa o procedimento de teste da seguinte forma:
- Equilibrar a 95,00 ° C
- Isotérmicos para 10,00 min
- Rampa de força de 0,300 N / min a 2,500 N
- Isotérmicos para 5,00 min
- Rampa de 2,00 ° C / min para 20,00 ° C
- Isotérmicos para 10,00 min
- Rampa de força de 0,300 N / min a 0,015 N
- Isotérmicos para 5,00 min
- Rampa de 2,00 ° C / min para 95,00 ° C
- Repita os passos 2-9 mais duas vezes
3. Preparação de Substratos Cultura atividade celular
- Amostras individuais podem ser preparados a partir do filme SMP isotermicamente curado. Cortar o filme SMP com uma navalha ao tamanho da amostra desejado. Coloque o SMP em uma chapa quente set a uma temperatura maior que a T g para reduzir o módulo e facilidade de corte.
- A forma temporária pode ser fixado em um número de maneiras diferentes. Aqui usamos um banco de imprensa top hidráulico com quente / frio platens para emboss uma topografia temporária. Regule a temperatura do platens a uma temperatura acima da T g.
- Uma impressora foi feita por cura epóxi em um disco de vinil. Isto irá produzir uma forma temporária de sulcos paralelos. Aqui, a impressora teve picos triangulares 35-40 mM de altura e 60 m de largura, espaçadas 80 mM distante. A impressora pode ser feita de outros materiais e com diferentes topografias, mas deve ser mais duro do que NOA63 na temperatura relevos. Coloque o SMP amostras de bruços sobre a impressora e colocar as amostras e impressora na imprensa.
- Aplicar um pré-carga ~ 100 kPa para fazer o contato entre os pratos de aquecimento e as amostras e segure por aproximadamente 5 minutos para permitir que as amostras para chegar a uma temperatura uniforme.
- Aplicar 1-6 MPa para as amostras e segure por um minuto. A tensão de 4,7 MPa leva a replicação incompleta da topografia impressora. A topografia temporária produzido tem picos arredondados 25-35 mM de altura e 150 m de largura. O SMP será fratura se um maior estresse é aplicado. Aplique tensões menores para introduzir topografias com amplitudes menores.
- Reduzir a temperatura abaixo da T g. Aqui usamos a capacidade de refrigeração de água da platens imprensa.
- Quando a temperatura está abaixo da T g, retire a força aplicada.
- As amostras podem ser armazenadas desidratado a -20 ° C. Quando armazenado sob estas condições, temos observado uma diminuição menos de 1 mícron em recuperação amplitude após dois meses de amostras em relevo com a impressora disco de vinil.
4. Experimento de Cultura ativos celular
- A luz UV de um gabinete de segurança biológica (CSB) é usado para esterilizar as amostras. Providenciar as amostras de bruços em pratos estéril, sem tampas e ligar a luz UV BSC por 6 h.
- Amostras virar para novos pratos estéril face para cima. Acender a luz UV BSC por 6 h.
- As amostras agora precisam ser equilibrados para um estado relativamente estável antes do plaqueamento com células. Colocar as amostras em uma placa de 96 poços e adicionar 150 mL de meio de crescimento completo.
- Coloque a placa em um 30 ° C incubadora com 5% de CO 2 até alcançar a desejada recuperação parcial. Aqui usamos 30 h para produzir amostras com amplitude grande o suficiente para alinhar as células.
- As amostras podem agora ser revestida com as células. Colocar as amostras em uma placa de 96 novos também.
- Adicionar 150 ml de solução de células às amostras. Aqui usamos C3H/10T1/2 fibroblastos embrionárias de camundongos em 20.000 células / ml para atingir células isoladas (em geral não estão em contacto com outras células).
- Para permitir que as células a unir e espalhar sobre a topografia temporária, coloque em uma incubadora de 30 ° C por 9,5 h.
- A morfologia das células ensaiogia antes da transição, retire amostras e realizar coloração e imagens de fluorescência das amostras. Este material apresenta autofluorescência durante a maior parte da faixa de UV e visível. Fluoróforos no extremo vermelho do espectro, tais como Alexa Fluor 647 são recomendados para reduzir fundo.
- Para disparar amostras para se recuperar, mover o prato para a 37 ° C incubadora e continuar a cultura por 19 h para permitir que o material para a recuperação e permitir que as células de adaptar a sua morfologia para a nova topografia.
- Retirar amostras e aplicar mancha apropriado (phalloidin de actina filamentosa de imagem) e de imagens dos procedimentos.
5. Resultados representativos:
Curada NOA63 é um sólido, transparente vítreo que tem propriedades excelente forma de memória conforme mostrado na Figura 3. Neste caso, o material foi curado como no Protocolo 1 acima e mostra um uniforme T g de 51,1 ° C (determinado a partir do início da queda E '). Observa-se da um jeito ciclos de memória de forma (aquecimento, deformação, refrigeração, recuperando-se, a Figura 3) que, uma grande porcentagem de tensão foi fixado após a descarga a 20 ° C, correspondendo a um rácio de fixação 15 (R f) de 89,3 % (em média mais de três ciclos; o mesmo abaixo de R r). A cepa fixa recuperado em uma proporção de recuperação (R r) de 84,4% em uma faixa de temperatura relativamente pequenas durante o aquecimento. Além disso, o desempenho de memória de forma não apresentaram deterioração até três ciclos, em que todas as curvas seguem quase exactamente com o outro.
NOA63 foi usado neste protocolo porque está prontamente disponível a partir do fabricante e fornecido como um pré-polímero facilmente curadas sem solvente com fotoiniciador. No entanto, sua composição não é divulgada pelo fornecedor. Verificou-se a permitir a ligação das células de alta e viabilidade. Finalmente, a temperatura de transição podem ser ajustadas para permitir uma magnitude significativa de recuperação entre as duas temperaturas celular compatível. Uma série de outros sistemas de polímero também pode ser usado com este protocolo, se a temperatura de transição é compatível com a cultura de células e se promover a adesão e viabilidade celular.
A amplitude da topografia temporária (grooves) diminui ao longo do tempo a 30 ° C. Por 30 h, a 30 ° C, a amplitude foi reduzida em ~ 50% (Figura 4, o tempo 0) 16. Reduz mais 10% nos próximos 9,5 h. Quando a recuperação é desencadeada pelo aumento da temperatura para 37 ° C, a amplitude se reduz a 0,5% da amplitude inicial dentro de 9,5 h. Para a impressora usada e uma tensão de 4,9 MPa relevo, isto corresponde a uma mudança funcional de 13 mM sulcos em uma superfície quase plana.
Um exemplo de um comportamento de células controlado através do uso de substratos de cultura de células ativas é uma mudança na organização do citoesqueleto. Em temporária substratos ranhuras antes da recuperação é disparado, o microfilamentos de actina alinhar ao longo da direção dos sulcos (Figura 5a) 16. Após a recuperação por aumento da temperatura, os microfilamentos têm reorganizado e são orientados aleatoriamente. Amostras de controle que têm sulcos estática ou uma superfície plana estática não reorganizar após o aumento da temperatura (Figura 5b, c).
Figura 1: Esquema de NOA63 câmara de cura. Cross-section view (esquerda) e top-down vista sem tampa de vidro (direita).
Figura 2: A geometria dumbbell utilizados para a caracterização granel memória de forma W:. Largura de seção estreita, L: comprimento da parte estreita, G: comprimento gage, WO: largura total, LO: comprimento total, D: distância entre apertos, R: raio de filé, e RO: raio externo.
Figura 3: A maior parte de memória de forma unilateral de uma cura NOA63 única, repetida três vezes (o asterisco indica o início experimental). No ponto indicado com um asterisco, o polímero foi aquecida e é então deformado pela aplicação de um esforço para definir sua forma temporária. Esta tensão é mantida constante, ea temperatura é diminuída para corrigir a forma temporária abaixo da T g do polímero. A temperatura é então aumentada, eo material recupera a sua forma permanente, a tensão temporária é reduzida.
Figura 4: Recuperação de SMP pode ser acionado em cultura de células compatíveis com as temperaturas. A amplitude de 25,6 ± 0,8 mM presente seguintes rec embossingovered para 12,6 ± 1,5 mM após 30 h de equilíbrio a 30 ° C (tempo 0, círculos pretos). Depois que as amostras foram transferidas para a 37 ° C incubadora (9,5 h), a amplitude recuperado para 1,1 ± 0,2 m dentro de 3,5 h. A amplitude recuperado para ~ 0,3 ± 0,1 mícron dentro de 9,5 h e não houve diminuição detectável ao longo dos últimos 9,5 h foi observada (triângulos vermelhos). Barras de erro representam um desvio padrão (n = 4-6). Traços são scans contato perfilometria de amostras representativas.
Figura 5: citoesqueleto de actina celular reorganiza seguintes transição topográfica uma imagens, Confocal de células marcadas com phalloidin em substratos em relevo mostram microfilamentos alinhado com sulco direção (seta branca) antes da transição e aumento da temperatura.. Depois da transição, microfilamentos têm reorganizados são orientados aleatoriamente. B, células em substratos de controle plana mostrar microfilamentos orientados aleatoriamente, antes e após o aumento da temperatura. C, células em substratos de controle mostram ranhuras microfilamentos alinhados com a direção sulco antes e depois do aumento da temperatura. Barra de escala é 100 mm. Traços são como na Figura 4.
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Discussion
A T g de NOA63 pode ser facilmente controlado através da temperatura de cura. Usamos isso para gerar SMP substratos que podem ser acionados em um intervalo de células compatíveis. NOA63 é plastificada pela água que reduz a seco T g, por isso aumentou a seco T g por cura a 125 ° C para mover a faixa úmida Tg entre 30 e 37 ° C.
Os substratos célula ativa cultura demonstrados são capazes de controlar o comportamento das células. Os resultados de reorganização microfilament destacar o potencial tanto para controle e dosagem de comportamentos de células em substratos dinâmico. A preparação do substrato topografias ACC é simples e expansível com base no molde de cura e de forma impressora. Topografias de mesoescala em nanoescala, em microescala, e pode ser curado como a forma permanente ou em relevo para a forma temporária. Além disso, as células manter alta viabilidade e aderir e espalhar sobre NOA63 16.
O uso de NOA63 como o SMP sugere diversas áreas de melhoria. Autofluorescência através de uma ampla gama do espectro visível limita o número de sondas que podem ser usados com alto contraste. Além disso, o material mostra recuperação parcial a 30 ° C, de modo a topografia em relevo terá mudado antes que as células são banhados. Esta é uma função de material de T g, dinâmica de absorção de água e estresse fixo. Como tal, a quantidade de recuperação funcional varia de acordo com a topografia fixo. No entanto, para uma dada topografia, variando a quantidade de tensão granel permitirá o controle da taxa de recuperação topográfica.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Kelly A. Burke de assistência técnica com a preparação do substrato ACC. Baseado no artigo publicado em Biomateriais, Davis KA, et al, o comportamento das células de memória dinâmica na forma de polímero substratos, Biomateriais, doi:. 10.1016/j.biomaterials.2010.12.006, Copyright Elsevier (2011). Este material é baseado num trabalho apoiado pela NSF Grant sob No. DMR-0907578.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOA63 | Norland Products, Inc. | NOA63 | Lot number 111 |
| Dogbone Punch | TestResource, Inc. Shakopee, MN | Scaled-down Type IV dogbone (ASTM D638-03) | |
| Benchtop Hydraulic Press | Carver | 3851 | |
| C3H10T1/2 Mouse Embryonic Fibroblasts | ATCC | CCL-226 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1357 | |
| UV Lamp | Spectroline | SB-100PC | |
| Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | Leica DMI 4000B | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | 20x/0.8 NA air or a 40x/1.30 NA oil objective |
References
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