Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

דוגמנות איתות החיסון עצבית של מיגרנה אפיזודי כרוני באמצעות הפצת דיכאון במבחנה Published: June 13, 2011 doi: 10.3791/2910
* These authors contributed equally

Summary

מיגרנה והפיכתו ל מיגרנה כרונית הם נטל עצום הבריאות זקוקה אפשרויות טיפול טובות. אנו מבקשים להגדיר כיצד איתות החיסונית העצבית מודולציה את הרגישות למיגרנה, על פי הדגם

Abstract

מיגרנה והפיכתו ל מיגרנה כרונית הם נטל הבריאות הצורך של אפשרויות טיפול טובות. אנו מבקשים להגדיר כיצד איתות החיסונית העצבית מודולציה את הרגישות למיגרנה, הדגם במבחנה באמצעות הפצת דיכאון (SD), כאמצעי לפתח מטרות טיפולית חדשנית מיגרנה אפיזודי כרוני. SD הוא הגורם סביר של הילה מיגרנה וכאבי מיגרנה. זהו הפסד התקפי של תפקוד עצבי מופעלות על ידי פעילות עצבית מוגברת בהתחלה, אשר לאט מתפשטת בתוך אזורים במוח רגישים. תפקוד המוח רגיל הוא רגיש להפליא, והוא מסתמך על, חופפות ברמה נמוכה איתות החיסונית. לפיכך, סביר איתות החיסונית העצבית משפיעה הפעילות החשמלית של SD, ולכן מיגרנה. תפיסת הכאב מחקרים SD בבעלי חיים שלמים כרוך בקשיים, אבל כל החיות מתאימים גם לבחון מערכות היבטים בביולוגיה של מיגרנה מאז SD מפעיל מסלולים nociceptive trigeminal. עם זאת, מחקרים בבעלי חיים שלם לבדו לא יכול לשמש כדי לפענח את המנגנונים מעגל הסלולר העצבית של SD. במקום זאת, בהכנות במבחנה שבה התנאים הסביבתיים ניתן לשלוט נחוצים. כאן, חשוב להכיר במגבלות של פרוסות חריפה יתרונות ברורים של תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס. פרוסות המוח חריפה לא יכול לגלות שינויים עדינים איתות החיסונית מאז הכנת פרוסות לבדו מעורר: הפרו דלקתי השינויים הימים האחרונים, התנהגות epileptiform בשל רמות גבוהות של מתח החמצן הדרוש כדי להחיות את פרוסות, ופגיעה בלתי הפיכה תא במרכזי פרוסה anoxic.

לעומת זאת, אנו בוחנים איתות החיסונית בוגרת תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס מאז תרבויות מקרוב מקבילים שלהם עמיתו vivo עם תפקוד trisynaptic בוגרת; להראות האסטרוציטים שקט, microglia, ורמות ציטוקינים, ו SD מושרה בקלות כהכנה unanesthetized. יתר על כן, פרוסות הם חיים ארוכים ו SD יכול להיגרם על ימים רצופים ללא פציעה, מה שהופך את ההכנה האמצעי היחיד עדכני המסוגל דוגמנות ההשלכות neuroimmune של כרוני SD, ו מיגרנה כרונית ובכך אולי. אנו משתמשים בטכניקות אלקטרו ולא פולשנית הדמיה כדי למדוד תא עצבי פונקציות במעגל ביחד עם SD. עצבית החיסונית ביטוי גנים משתנים נמדדים עם הקרנת qPCR, מערכי qPCR, וכן, חשוב מכך, השימוש preamplification cDNA לגילוי של Ultra-Low מטרות רמת כגון גמא אינטרפרון משופר באמצעות תא שלם, אזורית או ספציפי (באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה לייזר) דגימה. מפל איתות ציטוקין מוערכת נוספת עם מטרות phosphoprotein multiplexed קשור עם ביטוי גנים שינויים phosphoprotein אישר immunostaining דרך תא ספציפי. אסטרטגיות תרופתי ו siRNA משמשים לחקות לווסת את המערכת החיסונית מאותתים SD.

Protocol

קיימות מספר נקודות ראוי להדגיש ללימוד מוצלח של מערכת החיסון הקשורות איתות SD בתוך פרוסות המוח. ראשית, צריך ליזום גירויים סינכרוני depolarize נפח מספיק של החומר האפור במוח ליזום SD. משמעות הדבר היא תצורת ממשק (כלומר, חשיפה נוזל רק למטה חילוף הגזים מעל להכניס תרבות פרוסה) נדרשת. 1,2 שנית, פרוסות המוח חריפה לקיים SD אבל הטראומה של ההכנה שלהם, כמו גם את השימוש של 95% חמצן, סודה הפתרון של רינגר ליצור הפרו דלקתי שינויים בהתנהגות epileptiform בהתאמה, אשר יכול לשנות את תפקוד מעגלים עצביים הומאוסטזיס החיסונית. 3 שלישית, בעוד תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס להתגבר על המגבלות האלה פרוסה חריפה, חשוב לציין כי בתרבויות פרוסה יש לשמור לתקופות נאותה לפני השימוש (כלומר, יותר מ 10 ימים במבחנה), כך microglia ו האסטרוציטים להיות שקט. 3-5 לבסוף, SD צריך להיות מושרה באמצעות טכניקות סטרילית aseptic. טכניקות המפורטים להלן נועדו למלא את הצורך הזה.

1. הפצת דיכאון תרבויות Slice

  1. תרבות הכנה ותחזוקה.
    1. תרבויות Slice מוכנים ומתוחזק במדיום סוסים סרום המבוסס או בינוני בסרום חינם (SFM) 6,7 כפי שתואר לעיל 8 עם שינויים קלים עד בינוניים. פרמטרים דגירה הן 36 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 95% לחות איזון האוויר.
      1. אנו מוצאים כי תרבויות ניתן להעביר אל SFM לאחר 18 ימים במבחנה ומתוחזק לפחות 35 ימים במבחנה על ידי שימוש SFM שהוגדרו בעבר שלנו הכולל סידן, מגנזיום נוספת.
      2. בנוסף, אנטיביוטיקה antifungicide מתווספים על מנת למנוע זיהום זיהומיות הקשורות פרקים הקלטה מרובות.
      3. זה לטווח ארוך (או הקלטה) בינוני מכיל נוסחה (100 מ"ל): בינוני Neurobosal, 97 מ"ל; Gem-21, 2.0 מ"ל; Glutamax (200 מ"מ), 0.5 מ"ל; Gentamycin (10 מ"ג / מ"ל), 10 μL; D-גלוקוז (45%), 680 μL, חומצה אסקורבית (0.5 מ '), 100 μL; Fungizone, (250 מ"ג / מ"ל), 400 μL; NaCl (5.0 מ'), 820 μL, Mg 2 Cl 2 (1.0 מ ') , 80 μL; CaCl 2 (1.0 מ '), 160-240 μL.
      4. תרבויות משמשים SD 21-35 ימים במבחנה.
    2. אימות Vitality. 3,6,7
      1. תרבויות מוקרנים ראיות המוות נוירון פירמידלי לפני השימוש.
        1. בגיל 18 ימים במבחנה, מוסיף מודגרת במשך 20 דקות בינוני (בתנאים נורמליים הדגירה) המכיל 5 מיקרומטר Sytox גרין, סמן אשר הופך ניאון כאשר הוא נקשר ל-DNA (כלומר, על ידי חדירה לתוך תאים מתים).
        2. הוספת מועברים לאחר מכן חזרה בינוני הקודם שלהם ובדק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (504 ו - 523 עירור פליטה) ראיות לפגיעה CA3 או CA1 נוירון פירמידלי השכבה.
          1. פרוסות עם יותר מ 20 תאים או יותר ברמה סטנדרטית של הקרינה מ 250 IU הוצאו משימוש נוסף.
  2. חומרי ייצור.
    1. אלקטרודות קרקע נעשים עם צינורות זכוכית (2.0 מ"מ OD / 1.16 מזהה מ"מ) לחתוך 4.5 מ"מ אורך ו בקצרה אש מלוטש בשני קצותיו.
      1. אנחנו עושים על 20 אלקטרודות בכל פעם, אשר יכולה להימשך יותר משנה.
      2. מביאים 100 מ"ל KCl 1M לרתיחה ומוסיפים, תוך ערבוב עם אגר, 3.5 גרם ו 0.5 גרם EDTA (ethylenediaminetetraacetic חומצה dihydrate disodium מלח) כדי לייצר פתרון צהוב בהיר.
      3. השתמש אורך קצר של צינורות גמישים מצויד מעל הצינור לכל כוס לצייר פתרון חם KCl / אגר לתוך צינורות זכוכית, כמו גם מרחק קצר לתוך צינורות גמישים.
        1. שאיבה שחרור ולאפשר אגר KCl / לטפטף באיטיות מן הקצה הפתוח של שפופרת זכוכית, ולאחר מכן להחזיק את שפופרת זכוכית פתוח טיפ נגד פיסת קרח.
        2. התמרון האחרון תנחה את אגר כדי ג'ל בקצה האלקטרודה ולא ג'ל לאחר נסוג חזרה לתוך צינור הזכוכית.
      4. לאחר אגר יש בג'ל במים קרים, צינור גמיש ניתן להסירו מבלי לשנות את מיקומו של אגר צינורות זכוכית.
      5. המקום של 0.5 מ"ל 1 M KCl לתוך הבאר כל מתלה 1.5 צנטריפוגות מ"ל צינור. אז במקום אחד קצה הצינור KCl / אגר כל כוס מלא בבארות בודדים.
      6. בשלב הבא, לקיים אורך 80 ס"מ של חוט כסף 15 עם מד hemostat ונקי כל אחד מארבעת הצדדים על ידי גירוד את החוט דרך לוח אמרי שנערך לראש הדלפק.
      7. חותכים את החוט לתוך 4 ס"מ אורך ולמקם אותם לתוך בקבוקון scintillation מלא אקונומיקה במשך 20-30 דקות למקום מעיל Ag-AgCl הפירמה על פני כסף לנקות.
      8. בנד כל חוט במחצית ולהכניס את הקצוות חופשי לתוך קצה אחד של צינור זכוכית מלא wiה KCl / אגר, והשאיר על 4-6 מ"מ חשוף.
      9. לבסוף, המעיל שפופרת זכוכית שוק המכיל את חוט כסף במידה קטנה של חוט כשהחלק, דבק עמיד במים וגמישה, כדי למנוע את KCl / אגר מהתייבשות. חזור על הפעולה עבור כל אלקטרודות. בואו דבק היבש בין לילה.
      10. אחסן את האלקטרודות על 4 מעלות צלזיוס scintillation בקבוקונים (5-6 אלקטרודות / בקבוקון) המכיל 5 מ"ל 1 ~ M KCl ו 25 מ"ג EDTA, אשר מפגרים באופן משמעותי התפתחות חיידקים.
    2. הקלטה אלקטרודות עשויות בקוטר 1.5 מ"מ (0.86 מזהה מ"מ; אורך 10 ס"מ) צינורות זכוכית בורוסיליקט עם חוטים (איור וידאו 1).
      1. משוך microelectrodes עד קצה קנס עם צינורות זכוכית קצר משך לנקודה חדה.
        1. אנחנו בדרך כלל למשוך אלקטרודות ~ 7.5 ס"מ אורך עם להתחדד 1 ס"מ. זה מאפשר מיצוב הולם קצה להדמיה אלקטרודה.
        2. אלקטרודות נמשכים עם חולץ PE-2 Narishige.
        3. טיפים microelectrode שבורים בחזרה 2-4 מיקרומטר תחת להדמיה באמצעות מיקרוסקופ המתחם מצויד מיקרומטר אופטי מכויל. אנו משתמשים קצה שקופיות זכוכית רגילה היסטולוגיה (25 x 75 x 1 מ"מ) המחובר micromanipulator חד ממדית הידראולי המוחזקות על ידי מניפולטור 3 מימדי אחר בעדינות לשבור את עצות microelectrode.
          1. ראשית, האלקטרודה הוא רכוב המצורפת המיקרוסקופ שקופית באמצעות חימר.
          2. ואז להחליק את מושם על בעל מיקרוסקופ שקופיות אשר משמש כדי להזיז את קצה microelectrode ליד הקצה של הכוס החליקה המצורפת המניפולטור הידראולי.
          3. לבסוף, בקצה microelectrode הוא נשבר בעדינות על ידי לחיצה על אותו נגד קצה מונע הידראולית שקופיות מיקרוסקופ.
    3. אלקטרודות גירוי שזורות חוטי אלקטרודות דו קוטבית כי:
      1. הם מאפשרים הקלטה של ​​הפוטנציאל בתחום עורר, אשר אחרת יהיה מוסתר על ידי חפץ הגירוי מן גירוי monopolar.
      2. אלקטרודה מגרה דו קוטבית ניתן ליישם בעדינות אל פני השטח gyrus משוננת בלי פציעה, בניגוד מחודדים אלקטרודות דו קוטבית.
      3. לבסוף, להחיל הנוכחי הוא מקומי של (חשוף) משטחים רוחבי עגול של חוטי טפלון מבודדים המשמשים האלקטרודה.
        1. ייצור אלקטרודה מגרה מתחיל עם גזירה ~ 20 ס"מ אורך של אירידיום, פלטינה (125 מיקרומטר קוטר חשוף; בקוטר 200 מיקרומטר מצופה) ואת חוט מצופה טפלון. ואז, לכופף את אורך לשניים לקשור את הקצוות לפקעת מרובע רופף, עוזב ~ 2 ס"מ הקשר עד קצה של חוט.
        2. Secure את הקשר צ'אק של המקדחה החשמלית יד מונחת על השולחן.
        3. בעוד מחזיק את הקצה השני של החוט עם hemostat, בקיצור להפוך את התרגיל לסירוגין עד החוט הוא שזור היטב (כלומר, פני השטח של כל חתך יהיה במרחק שווה זה מזה כאשר נחתך חוט בכיוון רוחבי ללא נפרמים ).
        4. בשלב הבא, את הקצוות החשופים של פלטינה אירידיום חוטים מעוות צריך להיות מחובר להוביל חוטים המשמש לחיבור האלקטרודה מגרה המבודד גירוי.
          1. הדבר נעשה על ידי הלחמה מסתיים ללא חוט פלטינה אירידיום ל ~ 50 ס"מ 30 חוטי מד.
          2. ראשית, הקלטת חוט פלטינה אירידיום מעוות למעלה ספסל ושחרר שלולית של HCl מרוכזת על קצה אחד חופשי של חוט שזור.
            1. בשלב הבא, לפשוט על 1 ס"מ של בידוד מחוט אחד באמצעות מספרי תיל.
            2. מניחים את הסיר על קצה חוט להוביל סמוך לסוף חוט שזור וליישם חום ברזל דק שקצהו הלחמה, הלחמה אז עד שני החוטים מחוברים היטב.
          3. פליטת אורך קטן של צינורות חום לכווץ בחיבור חוט חשוף להתכווץ זה מתאים עם החום.
          4. חזור על חוט השני.
          5. אש ללטש קצה של 15 ס"מ פיפטה פסטר ולכוון את חוט שזור פלטינה אירידיום מטה פיפטה עד כ -6 ס"מ של בולט מעוות החוצה.
          6. השתמש אפוקסי דוחה מים (למשל, JB ולד) כדי לאטום את שני הקצוות של האלקטרודה.
          7. לבסוף, לצרף תקעים בננה עד קצה חוט להוביל לחיבור המבודד את הגירוי.
          8. תחת תצפית סטריאוסקופית, המקום קצה האלקטרודה ב PBS ולחפש בועות המיוצר אלקטרוליטים מגיע בסופו של דבר רק חתך של טיפים אלקטרודה. אם כל הבועות מגיעים הצדדים של חוטים מעוות, לחתוך את אלקטרודה עם חתך רוחבי באמצעות סכין גילוח טרי יחיד להב קצה בידוד להקים מחדש שלם של צירים חוט ארוך.
          9. כאשר פתרון בעיות כדי לפתור תופעות גירוי סוטה, נסה לעשות טיפ טרי אלקטרודה לחתוך.
    4. מנות הקלטה מורכבים כמותרבות כינים להוסיף מנה 35 מ"מ תרבות שיושב על שני 1.0 x 12 מ"מ מוטות זכוכית במרווחים על 1.0 ס"מ זה מזה. צרף מוטות זכוכית לבסס את המנה על ידי חימום צינורות זכוכית ולאחר מכן הקשה על בסיס אותם עם מלקחיים.
      1. התנאים לקבלת הקלטת סטטי, להוסיף 1.5 מ"ל של בינוני עד המנה.
      2. בשלב הבא, להשרות חתיכת ס"מ ~ 10 מ"מ רוחב ו 3-4 ארוכה של כותנה סטרילי בתוך 1.0 מ"ל של מדיום. מקפלים את הכותנה במחצית לאורך ציר זמן ומקום בו לאורך היטב הפנימית על להכניס את עם מלקחיים סטרילית. צמר גפן רטוב מסייע לשמור על לחות צלחת.
      3. שלוש 4 דחיס מ"מ באורכים של צינורות מחולקת באופן שווה סביב להכניס את.
      4. מכסים את צלחת הדוק עם הסרט פוליוויניל כלוריד, אשר מאפשר חילופי גזים.
      5. חותכים סביב הקיר שלה באמצע אנכי עם סכין גילוח חד בקצה כדי להסיר את הסרט עודף פוליוויניל כלוריד.
  3. אלקטרו ההתקנה
    1. תרבות פרוסת הרכבה להכניס מושם לתוך תא ההקלטה PDMI עבור הקלטות אלקטרו.
      1. הרכבה הוספה / תרבות צלחת של תא PDMI מכוסים על ידי דיסק 2 מ"מ פלסטיק עבה מסופק עם הקאמרית PDMI, עם חורים קטנים שונים מיקומו לפי הצורך עבור אלקטרודות הקלטות בינוני יבוא / יצוא צינורות וכו '
      2. אנו מעת לעת לפקח pH בינוני עם אלקטרודה זעירה pH וטמפרטורה בשילוב עם סוג מיניאטורי T תרמי בדיקה רכוב לתוך microelectrode למחצה אטום כדי להבטיח pH 7.3 ו 36.0 ° C התנאים.
      3. החדר הכנס / היא סודה עם אוויר 5% פחמן דו חמצני, מאזן בינוני מוחזק או סטטי או בזרימה (1.2 מ"ל / דקה) עם תצורה במרכז הכנס שהתקיים 35-36 ° C.
      4. התנאים לקבלת זרימה, בינוני הוא התחמם עם דוד מוטבעת, שוב כדי לשמור על מרכז החדר הקלטה ב 36 ° C.
        1. מערכת המשאבה peristaltic בהקלה על לחץ מביא בינוני לתוך לתרבויות פרוסה ללא פעימות מהמשאבה. Aspirator מסופק עם תא PDMI משמש כדי להסיר בינוני מ להכניס את דרך יניקה עדינה.
      5. לגבי יציבות, החדר הוא רכוב על הבמה Burleigh-גיברלטר במיוחד מיקרוסקופ הפוך שמחזיק מיקרוסקופ הפוך ויושב על השולחן רטט חופשי.
      6. חורים קטנים נפתחים דרך להכניס פוליוויניל כלוריד לעטוף עם כלי קטן המופעל באמצעות סוללה נטענת, כויה.
      7. בשלב הבא, אם תצורת הזרימה היא לשמש, כניסת וזרימה לשקע הוא התחיל, ואחריו מיקום האלקטרודה לקרקע. אחרת, פשוט לשים את האלקטרודה הקרקע במקום.
      8. אלקטרודות, שנערך במקום עם micromanipulators, ממוקמות בדיוק מעל פרוסת דמיינו עם מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 5x (איור 1).
        1. בגין עם אלקטרודה ההקלטה ואחריה האלקטרודה מגרה.
        2. אנו משתמשים צג השמע לציין microelectrode כאשר באה במגע עם הפרוסה. טיפ ממוקמת נקודת האמצע לאורך CA3 שכבת תאים פירמידליים הגוף.
        3. הקלטות הן נכתבו, ואז אלקטרודה מגרה הוא נגע בעדינות אל פני השטח את נקודת האמצע של gyrus משוננת.
        4. בשני המקרים, תנועות אלקטרודה הראשונית הם השיגו עם פקדי גס, והמיקום הסופי רק עם, שולט בסדר הידראולי באמצעות הניגוד תאורה שלב, כך שהגוף שכבות התא ניתן להבחין בקלות.
        5. Advance אלקטרודות ~ 25 מיקרומטר במרווחים תחת להדמיה מיקרוסקופית ישירה.
        6. לאחר אלקטרודות לגעת רקמות, לקדם את האלקטרודות עוד 20-30 מיקרומטר.
        7. הקלטות הן החלו לפני אלקטרודה מגרה הוא לשים במקום כדי להיות בטוח זה לא ההדק SD (כלומר, באמצעות גירוי מכני).
        8. ~ 10 דקות מותר לחלוף לפני הניסויים מופעלים.
  4. המושרה Transynaptically SD.
    1. מטב עורר CA3 פוטנציאלים בתחום כדלקמן (איור 2).
      1. CA3 פוטנציאל השדה עורר עם 100 פעימות μs (0.2 הרץ) החל הנוכחי כי הוא מספיק כדי לעורר תגובה (למשל, ~ μA 1-5).
      2. הזז את האלקטרודה הקלטה במרווחים לאורך ציר נוירון פירמידלי ארוך עד פוטנציאל השדה מקסימלי.
      3. ואז, להגביר את זרם עם אלקטרודה ההקלטה בעמדה זו וציין את התגובה הנוכחית מקסימלית (למשל, ~ μA 10-20).
      4. לבסוף, השתמש בחצי מקסימלי עוצמת הגירוי לניסויים (לדוגמא, זיוף לשלוט גירוי תקופתיות).
    2. קביעת סף SD עורר synaptically (איור 2).
      1. עם אלקטרודות מוגדר כפי שתואר לעיל עבור פוטנציאלים בתחום עורר, לעבור את הפרדיגמה גירוי, עורר פרצי יחיד ידנישל 10 פעימות (10 הרץ @ 100 μs / דופק), פרדיגמה להחיל בעבר במחקרים בבעלי חיים שלמים.
      2. בהדרגה להגדיל את עוצמת זרם לכל גירוי פרץ עד SD מופעל. חכו לפחות 60-120 שניות בין גירויים.
      3. דווח על סף coulombs SD (כלומר, זמן x הנוכחי).
    3. בניסויים אחרים הדורשים מדידת התגובות אינדוקציה של SDS מרובות, להשתמש בכוח סביר כדי לעורר גירוי SD (למשל, 100-500 ~ NC).
      1. טריגר SD כל 9 דקות לשעה.
      2. הקפד להשתמש בטכניקות aseptic בכל הניסויים.
      3. לאחר SD האחרון, להחזיר את הכנס תרבות לתנאי הדגירה נורמלי.
        1. סמן את המנה תרבות לציין את תרבות מנוסה SD.
        2. הרגל שלנו היא המקום סימן אחד שמאלה, שני סימני מימין להכניס את תרבות פרוסה, וציין כל אחת משלוש התרבויות כפי # 1, # 2 ו # 3 משמאל לימין.
        3. שנה בינונית כל 3-4 ימים עד הקציר תרבות.
    4. עבור SD חוזרים, בצע את ההליכים המתוארים לעיל.
    5. אנחנו בדרך כלל מבחן לשינוי SD סף 1, 3, 7, ו - 14 ימים לאחר שעה הראשונית של SDS מרובים.
    6. CA3 מהיר באזור שינויים פוטנציאל פוטנציאל להאט נרשמים דרך להפריד מערכות עיבוד אות דיגיטלי.

2. הדמיה ויטל למופת בתרבויות Slice בהיפוקמפוס

  1. התנהגות תפקודית דינאמית של תאים חיסוניים תושב (כלומר, microglia) יכול באותה מידה להיות פיקוח בתרבויות פרוסה ללא פגיעה בתא או הפעלת המערכת החיסונית (איור 3). 9
    1. לדוגמה, כדי תווית microglia להעריך את תנועתם קשורים לשינויים הפעילות הסינפטית של SD, השתמשנו fluorophore-tagged isolectin IB-4.
    2. "PBS לקטינים" הוא PBS עם קטיונים נוספים (0.1 מ"מ כל CaCl 2, MgCl 2, MnCl 2) מאז קטיונים divalent (0.1-1.0 mM) נדרשים כדי לקשור לקטינים α-D-galactosyl moieties על קרום התא microglial.
    3. בצע פתרון של "PBS לקטינים":
      1. עבור 1 ליטר PBS, באמצעות טכניקה aseptic סינון סטרילי, להוסיף:
      2. 100 μL של 1M MgCl 2
      3. 100 μL של 1M MnCl 2
      4. 100 μL של 1M CaCl 2
    4. מערבבים היטב לשלב ולשמור בקירור ב 4 ° C.
      1. רק 500 μL של "PBS לקטינים" נדרשת לכל בקבוקון של isolectin, אבל מאז זה יכול להיות בקירור ושמר במשך חודשים בכל פעם, זה עשוי להיות שימושי כדי לפצות כרכים גדולים.
    5. מחדש AlexaFluor 594-tagged isolectin-IB4 (isolectin) lyophilized אבקת to1 מ"ג / מ"ל ​​"PBS לקטינים".
      1. כדי למזער photobleaching, לבצע שלב זה מהר ככל האפשר, מזעור חשיפה לאור.
      2. Isolectin ניתן aliquoted כדי μL 20 פעם מחדש על 1mg/ml והמשיך ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה.
      3. מדולל isolectin עד 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​במדיום הגידול ותרבויות פרוסה דגירה בתנאים נורמליים הדגירה 40-10 שעות לפני הדמיה.
    6. הדמיה הגדרת.
      1. הגדרת הדמיה כוללת: מצלמה, מיקרוסקופ, תריס, אור, 2.0 צפיפות לסנן נייטרלי, 36 ° C, גז: 5% CO2, אוויר (או 20% חמצן, חנקן מאזן).
      2. הפעל מיקרוסקופ, מצלמה, אור UV, בקרת טמפרטורה, גזים לפחות שעה אחת לפני הדמיה.
    7. הגדרת MetaMorph הדמיה פרוטוקול.
      1. מתוך "כתב העת" התפריט הנפתח, בחר "Run ג'ורנל ...".
      2. זה אמור להנחות את פתיחת תיקייה כתבי העת, שממנו אתה צריך לבחור "Motion w-var afs (כתב העת הוקם בעבר כי בעקבות הצעדים הבאים)", לחץ על "פתח".
      3. "מיקוד אוטומטי תדר" חלון יצוץ הבא, לשמור על מספר 1, על "אישור".
      4. בשלב הבא, הגדרת "קובץ Na רצופות ..." החלון יופיע, לשמור הכל כפי שהוא:
        1. שם הבסיס: תמונה;
        2. מספר תמונה: 1;
        3. רוחב מספר: 3;
        4. Save As Type: MetaMorph TIFF;
        5. אם התמונה כבר קיים -> החלף באופן אוטומטי;
        6. לחץ על "Directory בחר ...", זה יגרום" עיון עבור תיקייה "חלון לצוץ. הנה, בחר את התיקייה (או ליצור תיקיה חדשה) שבו מסגרות הסרט צריך להישמר.
        7. לאחר מכן, כאשר התיקייה הנכונה (למשל C: \ Data \ תיקיה חדשה) מוצג בתחתית "סדרתית קובץ ההתקנה Na ..." חלון, לחץ על "אישור".
        8. בחלון רוכשת:
          1. בחר את ההגדרה בפינה השמאלית התחתונה להיות DiIMGBIN2;
          2. "זמן חשיפה": 20ms: "binning": 1.
        9. לאחר מכן, בכרטיסיה מיוחדים:
          1. "חיישן מצב": FT;
          2. "Digitiזר ": 10MHz (רווח EM);
          3. "רווח": Gain3 (3x);
          4. בחר "א.מ. רווח: 45"; תריס מצלמה: פתוח חשוף; מצב נקה: EXP PRE ברור: ספירת נקה: 2, מצב טריגר & מצב טריגר Live: רגיל (מתוזמן).
        10. "מסגרות ממוצע": 3.
        11. לחץ על "סגור".
    8. לאחר הגדרת הדמיה MetaMorph, במקום להכניס בצלחת תרבות 35mm עם שני מוטות זכוכית 1 מ"מ בתחתית.
      1. מקום שלוש עם 2 חתיכות מ"מ צינור גומי מצויד בין קירות להכניס את התרבות ואת צלחת נוספת לייצב את הכנס.
      2. מניחים פיסת רחב ~ 10 מ"מ של גפן טבול בינוני 1 מ"ל נוספים בתוך הכנס את לשמור על סביבת humidified. ודא כי הוא מיושר עם הקירות הרחק פרוסות בהיפוקמפוס.
      3. מכסים את החלק העליון של התבשיל תרבות הדוק עם הסרט פוליוויניל כלוריד כדי למנוע איבוד נוזלים.
    9. ודא כי מוקד הדמיה היא שכבה CA3 תא פירמידה. הערה האוריינטציה של פרוסה על ידי לצלם שלב ב 5x, 10x ו 20x.
    10. בחלון "מצא פוקוס" שמופיע על המסך, טווח מוגדר, הנוכחי + / - כדי להיות "8", ו - דיוק, ב מיקרון (ים), כדי להיות "1" (בשתי תיבות בתחתית יש לבדוק) .
    11. לחץ על "מצא פוקוס" על מנת להבטיח תמונה פוקוס.
    12. בחלון "השג Timelapse", בחר מרווח זמן כדי להיות "1 דקות", ואת משך זמן להיות "6 שעות" (אלה הם פרמטרים המועדפת שלנו הרכישה).
      1. כדי ללכוד במדויק תנועות microglial, הדמיה אמורה להיות תכופים פחות מדקה בכל פעם.
    13. בשנת אחסון תמונה, בחר סטאק.
    14. תמונה עדכן תיבת חלון צריך להיבדק, אבל לא את שני תיבות מתחתיו.
    15. בחר "Illum" להיות "למבדה".
    16. לחץ על "אישור".
    17. הסרט יהיה עכשיו להתחיל לרוץ. זאת אומרת ששום דבר אחר יכול להתבצע במסגרת תוכנית MetaMorph עד מסיים את הסרט או עד שתפסיק את הסרט מוקדם על ידי לחיצה על Esc, ולאחר מכן הסרט אז יהיה להפסיק בכל שלב הרכישה הבאה מתוזמן.
    18. בסוף הסרט, לבדוק פציעה התא על ידי הקרנת Sytox כאמור לעיל (א ').

3. הפקת רנ"א עבור ברמה נמוכה ציטוקין איתות 11-15

  1. אנחנו קודם לכן הציג הנחיות מפורטות לאיתור ברמה נמוכה ציטוקינים איתות בתרבויות פרוסה qPCR באמצעות טכניקות PCR במערך. 6,7
  2. שיפרנו באופן משמעותי את הרגישות של גישות שלנו לגילוי ציטוקינים mRNA בתרבויות פרוסה ולהציג שיפורים אלו כאן.
  3. השיפורים כוללים את הגישה שלנו הקציר רקמות בידוד RNA, prescreening של דגימות הגידול גורם נמק אלפא (TNF-α) שינוי, preamplfication cDNA, אשר ~ 6 פעמים רגיש יותר טכניקות הקודם, למשל, לאפשר זיהוי של הפעם הראשונה של התרבות פרוסה interferon-gamma (IFN-λ) זיהוי. 15
  4. PCR הכנה.
    1. תרבות Slice הקציר.
      1. בעקבות הניסויים, תרבות מוסיף פרוסת שקועות 2-3 מ"ל RNA כעבור המאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 3 ימים עד לעיבוד נוסף.
      2. כדי הקציר, להסיר זרים (כלומר, כל הרקמות הסמוכות בהיפוקמפוס תקין) רקמות באמצעות סכין יהלום להרים את פרוסות לתוך הפרט RNase / DNase חופשית 1.5 צנטריפוגות מבחנות המכילות 0.5 מ"ל פוספט מ"ל סטרילי בופר סליין (PBS) באמצעות צבע היטה קנס מברשת.
      3. דגימות ספין (10,000 סל"ד x 1 דקות) בצורה סטריאוטיפית פרוסות כל כך לדבוק באותו צד של צינורות שלהם.
      4. הסר PBS supernatant מדגם resuspend ב TRIzol 500 μL.
      5. דגימות חנות ב -80 ° C, או לשמור על הקרח עד מיצוי RNA.
    2. RNA מיצוי usingTRIzol עם תוצאות RNeasy ערכת מיקרו RNA בתשואה גבוהה יותר (איור 4) מאשר השימוש בערכה לבד.
      1. הפשירי TRIzol-דגימות דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      2. לנתק את הרקמה על ידי ציור דגימות למעלה ולמטה עם 1 מ"ל היטה pippetor ו / או vortexing עד רקמה מוצק אינו גלוי.
      3. הוספת 100 μL RNase חינם (RF) כלורופורם להפוך צינור 2-3 פעמים כדי לערבב.
      4. דגירה 3 דקות על טמפ החדר, כל vortexing דקות.
      5. צנטריפוגה 13,000 סל"ד במשך 15 דקות ב 4 ° C.
      6. העברת supernatant אל צינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל. היזהר לא להפריע ממשק.
      7. הוסף נפח שווה לטמפרטורת החדר RF 70% הביולוגיה המולקולרית כיתה אתנול (~ 300 μL).
      8. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים.
      9. המשך עם השלבים הבאים לכל הכיוונים RNeasy מיקרו בערכה:
        1. החל מדגם לעמודה מיקרו RNeasy להציב collectio 2mln צינור.
        2. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 במשך 15 שניות, להשליך זרימה דרך.
        3. לשטוף טור RNeasy עם RW1 350 חיץ μL.
        4. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 במשך 15 שניות, להשליך זרימה דרך.
        5. הוסף 10 UL DNase 1 פתרון המניות RDD 70 חיץ μL, מערבבים בעדינות.
        6. החל 80 μL של פתרון DNase ישירות על גבי הממברנה דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
        7. לשטוף טור RNeasy עם RW1 350 חיץ μL.
        8. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 במשך 15 שניות, להשליך זרימה דרך צינור.
        9. הוספת 500 הרשתית חיץ μL לעמודה RNeasy.
        10. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 במשך 15 שניות, להשליך זרימה דרך.
        11. הוספת 500 μL RF 80% אתנול ביולוגיה מולקולרית כיתה לעמודה RNeasy.
        12. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 עבור 2 דקות, לבטל את הזרימה דרך הצינור.
        13. מקום בעמודה RNeasy צינורות חדשה עם כמוסות פתוח.
        14. צנטריפוגה במלוא המהירות (כלומר, 14,000 סל"ד) במשך 5 דקות.
        15. העברת עמודה RNeasy לצינור microcentrifuge RF.
        16. החל מים 14 RF μL ישירות הממברנה.
          1. צנטריפוגה בסל"ד 10,000 דקות 1 עד elute.
          2. דגימות חנות ב -80 ° C או להמשיך לשלבים הבאים.
    3. RNA כימות.
      1. מדולל RiboGreen 1:200 ב-RF 1x טריס-EDTA (TE) חיץ.
      2. הכן tRNA שמרים לשמש תקן RNA.
        1. מלאי עבודה מאוחסן -20 ° C ב 100 מיקרוגרם / מ"ל
        2. מדולל ל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​(10 μL ב TE 990 μL).
        3. יצירת סטנדרטים כדלקמן: עבור 100 ng / μL, להוסיף 100 μL, עבור 80 ng / μL, להוסיף 80 tRNA μL 20 ו TE μL, עבור 60 ng / μL, להוסיף 60 tRNA μL 40 ו TE μL, עבור 40 ng / μL להוסיף 40 tRNA μL 60 ו TE μL, עבור 20 ng / μL להוסיף 20 ו 80 tRNA μL TE μL, ובמשך 0 ng / μL להוסיף 100 TE μL.
      3. הכן דוגמאות:
        1. שלב 99 μL TE + 1 מדגם μL.
        2. הפעל כל מדגם כפולים.
      4. שימוש pipettor מרובת ערוצים, להוסיף 100 μL של RiboGreen המדולל היטב.
      5. פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב.
      6. מדידת הקרינה על הקורא צלחת.
        1. והעמסת (485 ננומטר nm/535, 0.1 שניות) בתוכנית.
        2. ייצוא התוצאות לתוך גיליון אלקטרוני של Excel.
    4. קביעת ריכוז RNA.
      1. גרף לספיגה לעומת ריכוז רנ"א ליצור קו מיטבית רגרסיה ליניארית ב-Excel.
      2. קביעת ריכוזי מדגם RNA מן המשוואה רגרסיה הקשורים קו מיטבית.
    5. קביעת איכות RNA.
      1. RNA ריבוזומלי שלמות הלהקה נמדדת באמצעות agarose ג'ל (איור 4).
        1. למרות שזה אינו מעשי לרוץ שבריר של כל דגימה RNA שהושג (מאז = 1 מיקרוגרם של רנ"א נדרש התשואות שלנו הם קטנים), הוא רעיון טוב מדי פעם להפעיל ג'ל denaturing agarose על מדגם למופת כהוכחה לכך השיטה כאשר נעשה כראוי, תשואות גבוהות איכות RNA (כלומר, ללא השפלה).
        2. הכן 1% agarose ג'ל (עבור נפח של 100 מ"ל).
          1. נקו את מיכל אלקטרופורזה, הליהוק מגש ג'ל מסרקים ביסודיות עם RNase מפה.
          2. לשקול את 1 גרם של ultrapure agarose לתוך בקבוק.
          3. הוסף 83 מ"ל מים RNase חופשי 10 מ"ל של מגבים 10x [3 - (N-Morpholino) propanesulfonic חומצה] חיץ ומיקרוגל עד agarose מתמוסס פתרון ברור (~ 3 דקות).
            1. כדי להפוך 10x חיץ מגבים
              1. מערבבים 83.7 מגבים גרם, 13.6 גרם נתרן אצטט, ו - 3.7 גרם EDTA.
              2. מוסיפים 800 מ"ל מים RNase בחינם, לערבב לפזר.
              3. התאם ל-pH 7.0 ולמלא עד 1 ל
              4. סנן לעקר או החיטוי.
              5. אחסן בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
          4. אפשר ג'ל להתקרר 55 מעלות צלזיוס ומוסיפים 7 פורמלדהיד מ"ל 37% (שלב זה יש לעשות במנדף כימי קטר).
          5. יוצקים לתוך הג'ל הליהוק מגש לאפשר ג'ל לחזק בשכונה.
        3. הכן את דגימות רנ"א.
          1. RNA חיץ המדגם (500 μL, להפוך את טרי).
            1. שלב 50 מגבים 10x μL, 250 לפוראמיד μL, 90 פורמלדהיד 37% μL, 108 μL RF H ​​2 O ו - 2 μL ברומיד ethidium (פתרון המניה 10 מ"ג / מ"ל).
          2. כדי 10-10 מיקרוגרם של רנ"א, להוסיף כפול נפחו באמצעות חיץ המדגם, על דילול פי שלושה.
          3. לפגל על ​​95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן על קרח למשך 5 דקות.
          4. ספין briefly עומס המדגם מלא לתוך בארות לצד סולם RNA (להוסיף צבע טעינת אם רוצים).
        4. Electrophorese
          1. מלאו קאמרית עם חיץ מגבים 1x.
          2. Electrophorese ב 50-75 וולט עד סמנים היגרו על אורך 2/3rd של הג'ל.
        5. דמיינו את הג'ל על transilluminator UV.
          1. ודא כי יש 18S חדה -28 RNA ריבוזומלי (rRNA) להקות, וכי הלהקה -28 כפול חזק כמו הלהקה 18S (איור 4).
          2. RNA מושפל יהיה מראה מרוח, להקות מטושטשת, או לא יציגו יחס 02:01.
    6. בדרך כלל אנו משתמשים כדי להעריך את צפיפות אופטית מסך באיכות RNA.
      1. אמנם לא רגיש, לספקטרופוטומטריה UV באמצעות Nanodrop היא אמצעי יעיל ומהיר העלות של בדיקת איכות RNA.
      2. חפש צפיפות אופטית (OD) 260/280 יחס של 1.5-2.0.
      3. זכור כי הפתרון שבו RNA הוא resuspended (TE חוצץ נגד מים) ישפיע על היחס OD.
  5. PCR פעילויות.
    1. Pre-PCR ההתקנה
      1. עיצוב פריימרים ספציפיים
        1. שימוש Primerblast של צמח השדה http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ :
          1. הזן Refseq את הגן של היעד מספר להצטרפות.
          2. ציין גודל PCR מוצר של 70-200 נ"ב.
          3. ציין אני של ° 55-72, עם הבדל פחות מ 5 ° בין primers קדימה לאחור.
          4. בחר "פריימר יש תוחלת צומת אקסון אקסון," כדי להפחית רקע גנטי.
          5. אפשר לבדוק הספציפיות עבור מסד הנתונים עכברוש RNA Refseq על מנת להבטיח כי primers אינם מכירים מטרות נוספות.
          6. בחר זוג פריימר מתוצאות שמתאים הקריטריונים הבאים:
            1. 18-30 בסיסים ארוכה.
            2. פחות מ 2,000 בסיסים בנפרד על התבנית שלך.
            3. 40-60% גואנין, ציטוזין תוכן כדי להבטיח מחייב יציבה של פריימר על התבנית.
      2. בחירת גן התייחסות.
        1. לא כל גן התייחסות יהיה מתאים הניסוי שלך להגדיר. בכל פעם פרדיגמה חדשה משמש, היציבות של הפניה שלך צריך להיות מאומת. עבור עקביות, בחרנו להשתמש באחד הגנים הייחוס של ארבע מסופק על מערך 2 RT-PCR Profiler.
        2. גן התייחסות טובה צריכה לענות על הקריטריונים הבאים:
          1. רמת הביטוי שלו לא משתנה על ידי פרדיגמה ניסויית.
          2. זה בא לידי ביטוי ברמות דומה לזה של הגן היעד.
        3. כדי לבחור התייחסות מתאימה:
          1. סקירת הספרות כדי לזהות המועמדים האפשריים עבור גן התייחסות יציב במערכת שלך. לדוגמה, בדקנו Rpl13a משום שהיא הוצגה להיות יציב במחקרים של איסכמיה. 11,12
          2. Primers עיצוב כפי שפורט לעיל (או למצוא primers שכבר תוקף עבור גנים התייחסות משותף באתר כמו RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ).
          3. לצד מטב primers primers גן היעד (ראה להלן).
          4. קבע איזה התייחסות מועמד הוא היציב ביותר באמצעות תוכנה כמו Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) המחשבת ערך יציבות עבור כל גן על בסיס השונות intragroup ובוחר את הגן (ים) עם הביטוי לפחות וריאציה על הדגימות. לדוגמה, Rpl13a הוא הגן התייחסות אופטימלית SD (איור 4).
      3. מטב primers.
        1. כדי להשיג תוצאות עקביות ואמינות מבית qPCR, primers צריך לעמוד בקריטריונים מסוימים, שחזור סגוליות רגישות,.
          1. מומלץ לבדוק את הפרמטרים הללו עבור כל זוג פריימר חדש.
          2. Reproducibility נבדק על ידי הפעלת טכני משכפל.
          3. רגישות ניתן להעריך על ידי ביצועים עם עקומת סטנדרט של 4 פי דילולים רצופים.
          4. הספציפיות נקבעת על ידי אישור מוצר אחד על ידי ניתוח עקומת להמיס ג'ל אלקטרופורזה (איור 5).
        2. הפעל צלחת qPCR כדי לבדוק את איכות primers שלך, את הריכוז של primers לשמש.
          1. שימוש cDNA מסונתז מן המוח כולו RNA, ליצור עקומת סטנדרט (סדרה של 4 פי דילולים ברציפות) כדלקמן: 1, 1:04, 1:16, 1:64, 1:256, ולא לשלוט התבנית (NTC) .
          2. במשך כל דילול, לרוץ 1 μL cDNA ב duplicate ריכוז כל primers, (כלומר, 100 ננומטר, 200 ננומטר, 300 ננומטר).
        3. ודא טכני משכפל לתת עקבי ערכי CT.
        4. בדוק ערכים עבור Ct עקומת דילול.
          1. מגרש הערכים Ct כנגד ריכוז עבור כל אחד דילולים. הגרף שנוצר צריך להיות ליניארי עם מקדם קורלציה טובה (כלומר,> 0.95).
        5. בדוק להמיס עקומה כדי לאשר את קיומו של מוצר הגברה בודד (כלומר, שיא יחיד).
          1. אם יש מספר רב של פסגות, פסגות או אינם דומים, זה עשוי להציע זיהום, mispriming פריימר-dimer חפץ, וכו '(איור 5).
          2. שיא NTC צפוי מתאימות הדימרים פריימר המהווים יותר בקלות בהעדר תבנית cDNA, ולא צריך להיות חשש.
        6. אשר להמיס עקומת נתונים לפתרון מוצרים מוגבר על ג'ל agarose 1%.
          1. הכן 1% agarose ג'ל (עבור נפח של 100 מ"ל)
            1. לשקול את 1 גרם של agarose לתוך בקבוק.
            2. מוסיפים 100 מ"ל של חיץ 1x טריס-Acetate (טה) EDTA ומיקרוגל עד agarose מתמוסס פתרון ברור.
              1. 1 L 50x טה המאגר מורכב מ 2 טריס בסיס, 57 מ"ל חומצה אצטית קרחונית, ו 0.05 M EDTA (pH 8.0).
              2. מדולל חיץ טה כדי 1x עם מים מזוקקים (ריכוז סופי: 40 מ"מ טריס-אצטט ו 1.0 mM EDTA).
            3. אפשר ג'ל להתקרר 55 מעלות צלזיוס לפני הוספת ברומיד ethidium לריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל.
            4. יוצקים לתוך הג'ל הליהוק מגש ולאפשר לו לגבש בטמפרטורת החדר.
          2. כדי להפעיל, במקום ג'ל אלקטרופורזה בחדר מלא 1x טה, לשלב 10 μL המדגם מהצלחת qPCR עם μL 2 של צבע טעינת 6x, מערבבים היטב לטעון לתוך בארות לצד סולם משקל מולקולרי.
          3. Electrophorese ב 50-150 וולט עד סמנים היגרו מרחק מתאים, בהתאם לגודל הצפוי של המוצר cDNA שלך.
          4. דמיינו עם transilluminator UV.
          5. ודא מוצר מוגבר PCR הוא בגודל מתאים היעד שלך.
          6. הדימרים פריימר יהיה סביב 50 נ"ב.
    2. טרום המסך גדל TNF-α.
      1. מאז TNF-α יוזם תגובות דלקת בפריפריה, אנו חושדים זה נכון גם לגבי המוח ושימוש סינון ראשוני של mRNA TNF-α כסמן מעמד פרוסה תרבות החיסונית (כלומר, רגיל, דמה, וקבוצות הניסוי) לפני שתמשיך אל מלא מנתח PCR במערך.
      2. אם נורמלי דמה לשלוט TNF-α רמות ה-mRNA שאינם בטווח interassay נמצא בתוך המעבדה שלנו, ניסויים (כלומר, רגיל, דמה, וקבוצות ניסיוני) מבוטלים ואינם להמשיך מלא מנתח PCR במערך.
      3. iScript cDNA סינתזה.
        1. עבור כל דגימה RNA, לשלב הבא צינור PCR: 4 תגובה μL לערבב 5x, 1 transcriptase הפוכה μL, 25 ng-RNA, ו-RF H 2 O לנפח סופי של 20 μL.
        2. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ספין למטה בקצרה.
        3. דגירה: 25 ° C, 5 דקות, 42 ° C, 30 דקות, 85 ° C, 5 דקות.
        4. מדולל 01:04 (60 μL להוסיף מים RNase חינם).
        5. חנות ב -20 ° C, או לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש בתוך שעות ספורות.
      4. qPCR עבור TNF-α.
        1. הכינו תערובת אב כל זוג פריימר.
          1. מערבבים 12.5 μL IQ SYBR ירוק, לערבב 1 פריימר μL ו 10.5 מים μL לדגימה.
          2. עבור שני Rpl13a שלנו TNF-α primers, 200 ננומטר הוא הריכוז האופטימלי.
          3. התאם את כמות primers ונפח waster כנדרש על צינור 1.5 microcentrifuge RF מ"ל ולשמור על הקרח בעוד שהגדרת את הצלחת.
        2. הגדרת הצלחת qPCR עם פקדי / שמס / experimentals. השתמש 1 μL המדגם לכל cDNA בשני עותקים של כל גן.
        3. הוסף 24 μL תמהיל המאסטר שלכם היטב כל פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב.
        4. היזהר מאוד כדי למנוע בועות, כפי שהם יפריעו קריאות הקרינה.
        5. הפעלה 40 מחזורים של PCR הגברה:
          1. 95 ° C, 8.5min;
          2. 40 מחזורים: 95 ° C, 10 שניות; 60 ° C, 30 שניות; 72 ° C, 20 שניות / מחזור.
          3. ממיסים עקומה: 55 ° C, 1 דקות, 80 מחזורים של 0.5 במרווחים מעלות צלזיוס למשך 10 שניות כל אחד החל מ 55 ° C.
      5. ניתוח נתונים (שיטה ΔΔCt;. איור 4). 13
  6. סינתזה cDNA עבור מערכי ה-PCR.
    1. חישוב נפח (μL) של מדגם זה יש 250 ננוגרם של רנ"א.
      1. בחר סכום של RNA (100 ננוגרם ל 1 מיקרוגרם) שניתן באופן עקבי לחלץ דגימות שלך.
    2. RT 2 ערכת סטרנד ראשון - לפי הוראות היצרן. בקצרה:
      1. להפשיר את כל ספין ריאגנטים.
      2. עבור כל דגימה RNA, לשלב הבא צינור PCR:
        1. 250 ננוגרם של רנ"א, 2 μL של ה-DNA הגנומי 5x (gDNA) חיץ חיסול מים לנפח סופי של 10 μL.
      3. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ספין למטה בקצרה.
      4. לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      5. צ'יל על קרח דק 1.
      6. בינתיים, מכינים את שעתוק לאחור (RT) קוקטייל (מדגם לכל):
        1. שלב 4 μL של 5x RT חוצץ 3, 1 פריימר μL ומערבבים בקרה חיצונית, לערבב 1 μL האנזים RT 3, 3 μL של מים.
      7. הוסף 10 μL של קוקטייל RT לטעום כל ומערבבים בעדינות.
      8. לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      9. עצור תגובה על ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      10. הוסף 91 μL של RF H ​​2 O לתגובה זו סינתזה μL 20 cDNA (לדלל לנפח הסופי של μL 111).
      11. מערבבים היטב על ידי pipetting.
      12. חנות ב -20 ° C, או לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש בתוך שעות ספורות.
  7. RT 2 Profiler מערך ה-PCR.
    1. ההוראות הבאות לעקוב לאלה של היצרן והם חזרו כאן לנוחות.
    2. הכן ריאגנטים
      1. להפשיר את כל ספין ריאגנטים.
      2. הכינו קוקטייל ניסיוני:
        1. שלב 1350 μL של 2x SABiosciences RT 2 qPCR SYBR גרין מאסטר מיקס, 102 μL של cDNA בדילול מלא ו 1248 μL RF של H 2 O לנפח הסופי של μL 2700.
      3. מוציאים בזהירות מערך ה-PCR מן שקית אטומה.
      4. לוותר על הקוקטייל לתוך מאגר הטעינה.
      5. הוסף 25 μL היטב עם כל pipettor מרובת ערוצים.
      6. בזהירות חותם PCR הצלחת המערך.
      7. צנטריפוגה את הצלחת בסל"ד 10,000 1 דקות בטמפרטורת החדר.
      8. מניחים על הקרח עד PCR תוכנית מוכנה.
    3. הפעל את תוכנית רכיבה המתאימה למחשב שלך.
      1. iCycler:
        1. 95 ° C, 10 דקות
        2. 40 מחזורים: 95 ° C, 15 שניות; 60 ° C, 1 דקות.
        3. ממיסים עקומה: 55 ° C, 1 דקות, 80 מחזורים של 0.5 ° C במרווחים של 10 שניות כל אחד החל מ 55 ° C
    4. ניתוח נתונים.
      1. בחר "אוטומטי מחושב" על בסיס מחזורי.
      2. בחר "מוגדר משתמש" לתפקיד סף להגדיר באופן ידני את ערך הסף.
        1. ב "הצגת יומן", קבע סף התחתון שליש שלב ליניארי של העלילה הגברה.
        2. הקפד לשמור סף ערך זהה לרוחב פועל.
      3. ייצוא נתונים.
      4. קלט לקובץ Excel.
      5. טען ניתוח SABiosciences PCR מערך נתונים.
        1. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php
        2. בחר גנים הפניה - השתמשנו Rpl13a.
      6. התרגול שלנו הוא:
        1. לאשר את התוצאות עם לפחות מערך ה-PCR כפולים.
        2. 3 פי השינויים במערך לא צריך להיות מאושרת על ידי הבאים הגברה יעד ספציפי PCR. 6,7
        3. שינויים פחות מ -3 פי צריכה להיות מאושרת על ידי הבאים הגברה יעד ספציפי PCR או שימוש 2-3 מערכי ה-PCR (כדי לאשר את השינויים 2x.
    5. ה-DNA מראש הגברה משמש לנתח מטרות בהבעת Ultra-Low צפוי (איור 6).
      1. RT של SABiosciences 2 ננו סינתזה קדם מגבר ערכת cDNA ו מתערבב פריימר מיועדים מראש הגברה של רנ"א כדי לאפשר שימוש בכמויות קטנות (100-100 ng) של רנ"א מדגם להפעיל מערך מלא PCR.
      2. כל תערובת פריימר מאפשר הגברה של 89 גנים ספציפיים תבניות היעד cDNA עם הטיה מינימלית. השתמשנו במערכת זו כאמצעי להגברת אותות ברמה נמוכה כגון IFN-λ לרמה detectible.
      3. RT 2 ננו סינתזה קדם מגבר ערכת cDNA - לפי הוראות היצרן. בקצרה:
        1. להפשיר את כל ספין ריאגנטים.
        2. עבור כל דגימה RNA, לשלב הבא צינור PCR.
          1. 1-100ng של רנ"א, 2 μL של החיץ חיסול 5x gDNA מים לנפח סופי של 10 μL.
        3. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ספין למטה בקצרה.
        4. לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
        5. צ'יל על קרח דק 1. בינתיים, להכין את הקוקטייל RT (לפי המדגם).
          1. שלב 4 μL של 5x RT חוצץ 3, 1 פריימר μL ומערבבים בקרה חיצונית, 1 סינתזה μL cDNA לערבב האנזים 1 μL מעכב RNase, ו 3 μL של מים.
        6. הוסף 10 μL של קוקטייל RT לטעום כל ומערבבים בעדינות.
        7. לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
        8. עצור תגובה על ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
        9. חנות ב -20 ° C, או לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש.
      4. cDNA הגברה עם פריימרים ספציפיים.
        1. מערבבים את הבאים צינור PCR:
          1. 12.5 μL PCR לערבב שני, 7.5 פריימרים ספציפיים μL, ו 5 μL של cDNA חי.
        2. הפעלה 12 מחזורים של הגברה PCR.
          1. 95 ° C, 10 דקות.
          2. 12 מחזורים: 95 ° C, 15 שניות; 60 ° C, 2 דקות.
          3. תחזיק ב 4 ° C.
        3. הוסף תגובה 2 כמפחית μL צד מדגם זה.
        4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
        5. עצור תגובה על ידי דוגרים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
        6. הוסף 84 מים RF μL לתגובה כל הגברה μL 27 cDNA.
      5. חנות ב -20 ° C, או לשמור על הקרח עד מוכן לשימוש בתוך שעות ספורות.
      6. Amplify מטרות גנים בודדים באמצעות SAB primers ו SYBR ירוק לערבב מאסטר כפי שתואר לעיל.

4. Phosphoprotein מבחני Multiplexed איתות של ציטוקין

  1. מבחני phosphoprotein Mutliplexed משמשים להגדיר ליגנד לקולטן ציטוקינים במורד איתות (איור 7).
  2. קביעת כמות החלבון הכולל בתרבויות פרוסה.
    1. פרוסה קציר תרבויות על ידי הרמת הפרוסות בעדינות מעל מוסיף ומניחים 1 מ"ל קר (4 ° C) PBS.
    2. צנטריפוגה צינורות למשך 30 שניות ולהסיר PBS. מניחים על קרח יבש עד גמר הקציר.
    3. חנות ב -80 ° C.
  3. Homogenize תרבויות פרוסה עבור assay החלבון הכולל.
    1. הכן תמוגה חוצץ התא בהתאם להוראות היצרן.
      1. הוסף מעכבי הפרוטאז כדי בהיקף כולל של חיץ צריך מקום לפחות 200 μL של חיץ תמוגה על תרבות כל פרוסה.
        1. לדוגמה: להוסיף 20 μL של 1 פקטור, 10 μL של פקטור 2, ו - 20 μL של 500 מ"מ PMSF ב DMSO על 4.95 חיץ תא מ"ל תמוגה.
    2. הפשירי תרבויות פרוסה במאגר 200 תמוגה μL על הקרח.
    3. Sonicate תרבויות פרוסה חמש פעמים 1 פולסים שניות ואת המקום מיד בחזרה על הקרח.
    4. וורטקס דגימות עבור 10 שניות.
    5. צנטריפוגה דגימות 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בסל"ד 13,000.
    6. העברת supernatant לצינור נקי ולשמור על הקרח.
  4. בצע assay החלבון הכולל.
    1. הכנת תקנים חלבון.
      1. המניות מחדש שור בסרום אלבומין (BSA) על פי הוראות היצרן.
      2. הכנת תקנים החל 0-1000 מיקרוגרם / מ"ל ​​מדולל במים הטוהר גבוהה עבור assay חלבון BCA.
    2. חישוב נפח של מגיב עובדים על בסיס צורך במספר דגימות משכפל.
      1. לדוגמה: (8 תקנים + 18 דגימות לא ידוע) x (2 משכפל לדגימה) x (0.2 מ"ל מגיב היטב לכל עובד צורך) = 10.4 נפח מ"ל הכולל את כל הדרוש דגימות הועמסו על microplate.
        1. סיבוב עד נפח הכל 12 מ"ל, כדי להבטיח מספיק נפח.
      2. כאשר מגיב ערבוב עם B מגיב על מגיב העבודה, עכירות מסוימים עשויים להתרחש, אבל צריך להיעלם בקרוב.
    3. טען 10 μL של דגימות תקני לכל טוב.
    4. טען 0.2 מ"ל של ריאגנט עובד לתוך בארות.
    5. מכסים בצלחת עם הקלטת איטום ללחוץ למשך 30 שניות כדי לערבב.
    6. דגירה צלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      1. צלחת מצננים לטמפרטורת החדר (כ 10 דקות) לפני קריאת על הקורא צלחת באורך גל 595 ננומטר.
    7. בניית עקומת סטנדרט באמצעות Microsoft Excel עם ספיגת נמדד ריכוז לעומת הצפוי.
      1. מקדם המתאם טוב שווה או גדול מ 0.98.
    8. חישוב ריכוז חלבון בדגימות באמצעות משוואה ליניארית נגזרת עקומת הסטנדרטי.
    9. מדולל דגימות למאגר תמוגה על כמויות שוות של חלבונים חנות ב -80 ° C עד מוכן להמשך עיבוד.
    10. ריכוז חלבון יש טווח 2-900 מיקרוגרם / מ"ל ​​בהתאם להוראות היצרן.
  5. בצע Assay Multiplex.
    1. הערה: מבחני phosphoprotein multiplexed לקחת 2 ימים סה"כ כדי להשלים, עם שעה 1 של הראשוני הגדרת וטעינה של צלחת ואחריו incu לילהצעד bation ו הדגירה לשטוף צעדים נוספים למחרת.
    2. מפת אילו בארות יכיל אשר lysate לפי גליון במדריך.
    3. הפשירי דגימות רקמה הומוגני ו lysates ערכת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למקם על הקרח. תביאו את כל buffers ו ריאגנטים המסופק בערכה לטמפרטורת החדר (למעט streptavidin וחרוזים).
    4. הכינו חרוזים עבור assay זמנית.
      1. כיסוי צינורות המכילה חרוזים, בשילוב עם רדיד אלומיניום על מנת להגן מפני אור. וורטקס צינורות במשך 5 שניות ולשמור על הקרח.
      2. מדולל בשילוב חרוזים 1:50 במאגר לשטוף.
        1. כל טוב אמור להכיל 1 μL של חרוזים בשילוב במאגר לשטוף μL 49 עבור בהיקף כולל של 50 μL לכל טוב.
    5. כייל את מנגנון ואקום.
      1. לשטוף את הצלחת עם חיץ 100 μL לשטוף היטב לכל.
      2. הפעל ואקום יניקה את כל עודף נוזלים בתוך 2-5 שניות.
        1. אם הסרה מלאה של המאגר לוקח זמן רב יותר או קצר יותר מאשר 2-5 שניות, להתאים את שסתום הלחץ בהתאם.
        2. יבש בתחתית הצלחת ביסודיות לפני הוספת דגימות.
    6. וורטקס החרוזים יחד מדולל למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μL לבארות המיועד.
      1. מיד ואקום מסנן ויבש התחתון של צלחת עם מגבת נייר.
    7. לשטוף את הצלחת פעמיים עם חיץ 100 μL לשטוף היטב לכל. יבש בתחתית הצלחת לאחר כל שטיפה.
    8. וורטקס מופשר דגימות במשך 3 שניות ומוסיפים 50 μL לבארות המיועד. המקום איטום סרט על צלחת דגירה של 15-18 שעות רועד בסל"ד 300 בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
    9. נוזל מסנן אבק עודף צלחת לשטוף שלוש פעמים עם חיץ 100 לשטוף μL. יבש בתחתית הצלחת לאחר כל שטיפה.
    10. מדולל נוגדן 01:25 גילוי מאגר לשטוף.
      1. גם כל דורש 1 נוגדן איתור μL בהיקף כולל של 25 חיץ לשטוף μL.
    11. מניחים על הצלחת הקלטת איטום ולהגן מפני האור עם רדיד אלומיניום. Shake למשך 30 שניות, מהירות בהדרגה עד 1100 סל"ד. המשך רועד בסל"ד 300 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    12. אבק לסנן את הצלחת לשטוף שלוש פעמים עם חיץ 100 לשטוף μL. יבש בתחתית הצלחת לאחר כל שטיפה.
    13. תוך הגנה על צלחת מן האור, להכין דילול של 1:100 streptavidin-PE עם נפח מספיק כדי להוסיף 50 μL לכל טוב. הגן על פתרון מן האור.
    14. וורטקס ביסודיות להוסיף 50 μL בדילול streptavidin-PE לכל טוב. דגירה עם רועד בסל"ד 1100 למשך 30 שניות ולאחריה 10 דקות ב 300 סל"ד.
      1. עודף מסנן אבק חיץ משם.
      2. לשטוף את צלחת שלוש פעמים עם חיץ 100 resuspension μL לכל טוב.
      3. יבש בתחתית הצלחת לשטוף ביסודיות לאחר כל אחד.
    15. הוספת 125 חיץ resuspension μL היטב כל ולנער במשך 30 שניות ב 1100 סל"ד.
    16. מיד לקרוא צלחת או לאחסן ב 4 ° C מן האור עד 24 שעות.

5. חיקוי ו אפנון של איתות ציטוקין

  1. חלבונים ציטוקינים רקומביננטי (עם הספק) משמשים לחקות שינויים של SD.
    1. חלבונים Lyophilized (למשל, TNF-α) מאוחסנות עד 1 שנה -20 ° C.
    2. לאחר דילול לפתרון מניות עם 0.1% שור בסרום, aliquots אלבומין מוכנים, המאוחסן ב -20 ° C, עד לשימוש תוך 3 חודשים.
    3. כל המניפולציות לתרבויות פרוסה עוברים רענון לפחות בכל יום שלישי.
  2. איתות ציטוקין מושתק על ידי:
    1. השימוש המסורתי ציטוקינים איתות סוכני מפל תרופתי;
    2. השימוש אנטגוניסט ליגנד מסיס [למשל, קולטן מסיס TNF 1 (כפי שתואר לעיל עבור ligands רקומביננטי)]; או
    3. Gene השתקה [כלומר, התערבות קטנה RNA (siRNA)].
  3. משלוח של siRNA תאים עצביים הוא לעתים קרובות בעייתי.
    1. Common השומנים מבוסס ריאגנטים בדרך כלל תוצאה של יעילות transfection נמוך ואובדן כדאיות התא.
    2. במקום זאת, אנו משתמשים Dharmacon של Thermo Scientific siRNAs Accell, המאפשרים מציאה יעילות גבוהה ללא השימוש מגיב transfection.
    3. כאן אנחנו מראים מציאה של cyclophilin B, חלבון שאינם חיוניים לידי ביטוי בכל סוגי התאים, כאישור של השימוש בשיטה זו בתרבויות פרוסה.
    4. פרוטוקול מסירה הותאם עבור תרבויות פרוסה מן ההוראות של היצרן לשימוש בתאי חסיד.
      1. מדולל חיץ siRNA 5x כדי 1x עם מים RNase חינם.
      2. הכן פתרון siRNA 100μM במאגר 1x
        1. SiRNA Cyclophilin B מסופק על nmol 5. Resuspend ב 50 μL של חיץ 1x עבור המניות 100 מיקרומטר.
      3. מערבבים עם siRNA Accell משלוח mediuמ הריכוז הסופי של siRNA 1μM.
        1. הוסף 11 μL של siRNA 100 מניות מיקרומטר עד 1100 μL בינוני מסירה Accell בצלחת 6 באר.
        2. מקום בחממה ולאפשר טמפרטורה לאזן לתנאי הדגירה נורמלי לפחות 20 דקות.
      4. שימוש ברדס BSL-2 ו טכניקה סטרילית, מוסיף העברת לתערובת המכילה את המסירה בארות.
        1. דגירה בתערובת מסירה עבור 96 שעות עבור מציאה חלבון.
          1. הערכת מציאה חלבון על ידי כתם המערבי או הגבירו immunostaining.
          2. כתמים המערבי, בעוד הבחירה הראשונה פוטנציאל יעילות מציאה, עשוי להיות רגיש מדי ברמה נמוכה איתות החיסונית קשורה לתופעה הלא מזיק של SD.
          3. לפיכך, אנו עוקבים שליליים מדידות כתם המערבי עם immunostaining כסף משופרת (DAB) diaminobenzidine והמחשב מבוסס מדידות צפיפות (ראה להלן).

6. Proteomic אישורים

  1. סגוליות Cell שינויים phosphoprotein הוא הוקם באמצעות immunostaining. 6,7
    1. תקן תרבויות פרוסה למשך 24 שעות עם PLP מיצב המורכב:
      1. Paraformaldehyde 10 מ"ל 16%, 1.096 גרם ליזין, פוספט 0.42 גרם נתרן 0.17 גרם נתרן periodate, מלא עד נפח כולל של 80 מ"ל עם מים ultrapure (מקבע הוא 6.2 pH).
      2. לאחר 24 שעות, להסיר בעדינות תרבויות פרוסה מן מוסיף את במכחול דק להעביר אזיד הנתרן PBS המכיל (100 מ"ג / ליטר) עד מוכן סעיף.
      3. ואז, דגירה פרוסות לפחות 24 שעות ב-PBS סוכרוז 20%, לחתוך פרוסת תרבויות שלמות 20 סעיפים מיקרומטר, ו הר לשקופיות ג'ל מצופה.
      4. Immunostaining פלורסנט (למשל, עבור NFκB) מתבצע כדלקמן עם כל הצעדים מצמידים את רועדת ~ 50 סל"ד.
        1. לשטוף תרבויות פרוסה 3 מ"ל PBS שלוש פעמים 10 דקות.
          1. מגלשות המקום רכוב עם 20 מיקרומטר תרבויות פרוסה בצנצנות Coplin עם ~ 40 מ"ל PBS עבור כל הצעדים לשטוף.
        2. לשטוף תרבויות פרוסה PBS שלוש פעמים, 10 דקות לכל לשטוף.
        3. מניחים כמה טיפות של SFX אות משפר על תרבויות פרוסה דגירה בתא לח למשך 30 דקות.
        4. דגירה תרבויות פרוסה עבור 2 שעות ב 37 ° C עם נוגדן אנטי NFκβ ארנב בבית 1:100 בדילול מלא 0.75% Triton X-100 ב PBS.
          1. פיפטה פתרון הנוגדן ישירות על גבי פרוסות.
        5. הסר פרוסות מפתרון נוגדן לשטוף שלוש פעמים PBS עבור 10 דקות לכל לשטוף.
        6. דגירה פרוסות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת נגד ארנב נוגדן עז 594 AlexaFluor בשעה 1:50 ב 0.75% Triton X-100 ב PBS.
          1. צנטריפוגה AlexaFluor 594 הנוגדנים במשך 15 דקות בסל"ד 10,000 להסיר כל המשקע שאולי נוצר פתרון.
        7. לשטוף שלוש פעמים PBS, 10 דקות לכל לשטוף.
        8. טובלים שקופיות מים מזוקקים כדי לשטוף את כל המלחים מן PBS.
        9. Coverslip עם להאריך בינוני antifade ולתת להתייבש לפחות 2 שעות, מכוסה מן האור.
        10. דמיינו עם מיקרוסקופיה (איור 7) מסורתי או confocal פלואורסצנטי.
  2. ייצור חלבון השינויים מציאה siRNA ניתן להעריך על ידי שיפור ברגישות DAB המסורתית immunostaining 7 דרך התעצמות כסף 16 וכימות densitometric עוקבות (למשל, כפי שמוצג כאן cyclophilin ב) (וידאו איור 2).
    1. Immunostaining עבור cyclophilin B בעקבות הליכים תקן הדמיה בתחום בהיר אנו מפורט לאחרונה, 7 באמצעות:
      1. אנטי עכבר cyclophilin B (1:100) עבור 24 שעות 4 מעלות צלזיוס;
      2. ואחריו תיוג חזרת peroxidase משני נוגדנים (1:100);
      3. וגם DAB להדמיה.
    2. f התגובות DAB חלשים מכדי לאפשר quantification17 densitometric דיגיטלי, הם יכולים להיות התעצמה עם הליך כסף מובחן על פי קווין Graybiel 16.
      1. רעננותם שקופיות ולאחר מכן לשטוף ביסודיות x 3 למשך 10 דקות במים הטוהר גבוהה.
      2. המקום מגלשות מים טוהר גבוהה בצנצנת Coplin וחם כדי 56 ° C.
      3. הכן כסף חנקתי ammoniacal פתרון (0.5%):
        1. אמוניום כלוריד במלאי (25-30%) הוא טרי מדולל (1:1) עם מים טוהר גבוהה.
        2. הוסף אמוניום הידרוקסיד (~ 500-600 μL 100 מ"ל) טיפה אחר טיפה עם ערבוב של פתרון 0.5% כסף חנקתי אשר בקצרה להפוך מעוננים ברור אז.
        3. חם הפתרון 56 ° C.
        4. דגירה סעיפים 10-12 דקות.
      4. לשטוף שקופיות למשך 15 שניות במים הטוהר גבוהה (זה כל הצעדים הבאים מתבצעים בטמפרטורת החדר באמצעות צנצנות Coplin).
      5. טובלים שקופיות של 15 שניות ב thiosulfate נתרן 1% (pentahydrate).
      6. טובלים שקופיות למשך 15 שניות במים הטוהר גבוהה.
      7. טון השקופיות דקות 2 ב כלוריד זהב 0.2%.
      8. טובלים את השקופיות במים הטוהר גבוהה למשך 15 שניות.
      9. לחשוף את שקופיות חומצה אוקסלית 0.5% עבור 2 דקות.
      10. טובלים את השקופיות עבור 15 שניות במים הטוהר גבוהה.
      11. פנקו את השקופיות עבור 5 דקות בתוך thiosulfate נתרן 5%.
      12. שטפו ביסודיות מגלשות מים גבוה מייבשים, טוהר coverslip.
      13. שקופיות מוכנים כעת עבור כימות densitometric 17.
        1. כל הציוד, כולל בתחום התאורה בהירה, מופעלת דקות לפחות לפני 20 הדמיה.
        2. תרבות קטעים שלמים פרוסה הם צילמו בשעה 5-10x על מיקרוסקופ הפוכה.
        3. עוצמת האור מוגדר ברמה אחידה (למשל, ~ 2.6 V) ולא השתנה לאורך כל הרכישות התמונה.
          1. מסננים צפיפות ניטרלי משמשים לפי הצורך כדי להפחית את התמונה המלאה עוצמת האור מועבר אל ~ 1500 בהיקף 12 סיביות (0-4095), שם "0" הוא שחור לגמרי 4095 הוא לבן לגמרי.
        4. תמונות דיגיטליות הן רכשה אז מאוחסנים בצורה אלקטרונית לכל (כלומר, העמדת פנים מלאה דוגמאות ניסיוני), כולל תמונת רקע נגזר טופס שטח של שקופיות ללא סעיפים תרבות פרוסה.
        5. תמונת הרקע מופחת כל התמונות (זיוף, ניסיוני) ואת שטח של עניין (AOI) נמשך סביב תרבות כל פרוסה והעביר עוצמת האור רשום.
        6. עוצמת הטווח תמונה מוגדרת מגוון מתמיד כל הניסויים.
        7. לשם הבהירות, כפי שבאה לידי ביטוי כתוצאה צפיפות יחסית לעומת רמות השליטה (איור 8).

7. נציג תוצאות:

איור 1
באיור 1. תרבות Slice הקלטה אלקטרו פרדיגמה. Microelectrode הקלטה ממוקם ראשון שכבת CA3 נוירון פירמידלי ואז אלקטרודה מגרה דו קוטבית ממוקם gyrus משוננת (DG).

איור 2
איור 2. CA3 מעוררים פוטנציאלים השדה המושרה synaptically הפצת דיכאון. (א) ניסויים להתחיל עם הקביעה הנוכחית הדרוש על מנת למקסם את תקן CA3 שדה באזור התגובות פוטנציאל ואז חצי בעוצמה מקסימאלית משמש לעורר CA3 מעוררים פוטנציאלים באזור שדה. זה מתעד את הנורמליות של תגובות סינפטיים מעוררים בין ההכנות. אם הגירוי בשדה של פרוסת הודעה הפוטנציאל הסינפטי אינן לפחות 3 mV, פרוסות מבוטלים. (ב) על הסף הבא, עורר טרנס synaptically מפעילה דיכאון הפצת נקבע (מימין, תגובות לאט) תוך הפוטנציאלים בשדה באותו זמן (משמאל , תגובות מהר) משמשים מסמך ההכנות בריאים מספיק כדי לעקוב אחר גירויים 10 הרץ (למשל, אמפליטודות של סטיות אנכיות ברשומות פוטנציאל מהיר דומים).

איור 3
איור 3. תנועה Microglial הקשורים עדות הקטינה פעילות. הסינפטי מראה כי הענפים microglial להרחיב לחזור עם הפעילות הסינפטית גדלה, אך למרחקים ארוכים תנועה של תאים אלה בתגובה הפעילות הסינפטית לא תוארה במוח וללא כל פגע. התוצאות שלנו באמצעות ניאון תיוג B4 isolectin של microglia להראות כי חלק קטן של תאים אלה לעבור מרחקים ארוכים בתנאים רגילים. יתר על כן, במספר microglia אלה נסיעה הוא גדל באופן משמעותי כאשר הפעילות הסינפטית הוא בוטל על ידי חשיפה תרבות tetrodotoxin כפי שמוצג בתמונה המלווה. השבילים האדום קווי סימן נסע microglia על פני תקופה של 6 שעות עם חיצים כחולים לציון מקור microglia למופת ספורים. בר כיול, 50 מיקרומטר.

איור 4
איור 4. PCR פעילויות ההקרנה. (א) אנו משתמשים TRIzol יחד עם Qiagen ערכות עבור בידוד RNA מאז, בידיים שלנו, זה תוצאות גדול משמעותית (p <0.001, t-test). תשואה RNA מתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס מאשר השימוש ערכות Qiagen לבד (ב) בנוסף, אנו מאשרים כי מעת לעת נהלים RNA החילוץ שלנו לייצר RNA באיכות גבוהה ללא פגע, כפי שנקבע באמצעות ג'ל שמראה חד להקות RNA. (ג) אנו משתמשים בתוכנה NormFinder לבחור גן התייחסות עם ערך יציבות הטוב ביותר. לדוגמה, בתרבויות פרוסה חשוףכדי lipopolyssacharide (100 ng / mL עבור 2 שעות) נותחו עבור שלושה גנים הפניה (Rpl13a, β-אקטין, 18s). ערכים Ct משמשים כדי לחשב ערך יציבות. הנתונים שלנו כאן [וכי לניסויים אחרים באמצעות הפצת דיכאון (מידע לא מוצג)] עולה כי Rpl13a הוא הגן התייחסות אופטימלית. (ד) אנו משתמשים בשיטת "ΔΔCt" כאמצעי לשחזור רגיש כדי לזהות שינוי לקפל-RNA הבדלים בין קבוצות הניסוי בקרות דמה.

איור 5
איור 5. בדיקות PCR התגובה. (א) אנו מודדים את עקומת amplifications דילול עבור primers כאמצעי כדי לאמת את איכות התגובות PCR. לדוגמה, amplifications אופטימלי להראות גידול אחיד (1-5) על סף CT. (ב) לעומת זאת, amplifications אינם אחידים עם primers עניים (1-5). (ג) בנוסף, אנו מבצעים עקומה להמיס את המסקנה של מבחני PCR כדי לוודא amplicons הרצוי מזוהים (כלומר, עקומת שיא יחיד), אשר מצביע על היעדר כל גדילי הדנ"א הכפול כולל הדימרים פריימר, זיהום דנ"א המוצר misannealed PCR (אשר יופיע עקומות שיא מרובים).

איור 6
איור 6. ננו מראש הגברה מאפשר זיהוי של λ-IFN בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס. מאז רק ~ 50 מתאי T נמצאים בתרבות פרוסה (מתוך ~ 55,000-90,000 תאים סה"כ), השתמשנו 2 RT ננו סינתזה קדם מגבר קיט cDNA כמו אמצעי ביטוי לזהות פוטנציאל נמוך במיוחד ברמה של IFN-λ. המשמעות של preamplification cDNA בתנאי גידול של פי 12 רגישות RNA רמות. התוצאות הראו מעל להדגים את היכולת של preamplification להגדיל את רגישות הזיהוי. Ct סף לעיון גן Rpl13a היה 20.5 עם הגברה הראשוני וזה היה גדל ל 14.1 עם השימוש בערכה preamplification, עלייה של פי 12 המקביל ל 12 מחזורים של PCR הגברה של cDNA. במקביל, IFN-λ לא היה ניתן לגילוי (0.0), אך היה גם בתוך טווח גילוי (29.0) עם preamplification.

איור 7
איור 7. מולדת מסלול ציטוקינים phosphoprotein זירחון שינויים. (א) השפעה למופת של TNF-α המקדים (כלומר, neuroprotection) על מסלול מולדת זירחון phosphoprotein ציטוקינים 24 שעות לאחר פציעה excitotoxic בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס. תוצאות להראות שינויים באזור CA1 בין פרוסות pretreated במשך 3 ימים עם 100 ng / mL TNF-α לפני החשיפה N-methyl-D-aspartate (NMDA) בהשוואה לאלה שנחשפו NMDA לבד (כלומר, הניסוי לעומת דמה), כפי שבאה לידי ביטוי אחוז. שימו לב TNF-α גרם לעלייה זירחון מתמשכת JNK ו ATF-2, כמו גם עלייה זמנית של NFκB. (ב) הפריסה המרחבית של הפעלת NFκB (כלומר, נוכחות של NFκB phosphorylated בגרעין) מתגלה על ידי immunostaining ( אדום). YoYo גרעינים כתמים ירוקים בסעיף פרוסה תרבות [למשל, האסטרוציטים ב (ראש החץ)]. עצב פירמידליים, אשר אחרת היו מופיעים גם ירוק, הם במקום צהוב בגלל במקביל לסימון עם phosphorylated NFκB (אדום). בר כיול, 25 מיקרומטר.

איור 8
איור 8. . האישור proteomic של יעילות siRNA התעצמות כסף רמות של immunostaining peroxidase-diaminobenzidine מבוסס cyclophilin B מראה siRNA שניתן באופן משמעותי (p <0.001; ANOVA-הולם-Sidak שיטה) להפחית פרוסה העולמי בהיפוקמפוס cyclophilin ביטוי ב 3 ימים לאחר היישום של 200, 500 , או siRNA 1000 ננומטר.

Discussion

SD הוא ההפרעות התקפי של המוח שתכונותיהם הן שמור ביותר בכל אזורי המוח המינים שנבדקו עד כה. SD הוא למד בדרך כלל הניאוקורטקס. עם זאת, את המורכבות של מעגלים עצביים המבנה הזה (לעומת ההיפוקמפוס), כמו גם חוסר היכולת לשמור הניאוקורטקס בחיים במבחנה עם פונקציות החיסונית שקט לתקופות ממושכות, להפוך אותו לשימושי פחות כהכנה במבחנה להגדרת השלכות ארוכות טווח הרגישות של SD. לעומת זאת, ההיפוקמפוס אינו רק מבנה המוח, כי הוא רגיש ביותר SD, הוא גם מבנה archicortical עם מבנה פשוט יותר מעגל תפקוד עצבי, וזה גם מתאים להגדרת אמצעי neuroimmune שבאמצעותו ניתן לווסת את הפעילות העצבית הרגישות SD .

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NS-19108), המכון הלאומי לבריאות הילד מחלות (PO1-HD09402), המחקר מיגרנה קרן וקרן הלבן. גב 'פ' מרשה Kraig סייעו בהכנת ותחזוקה של מערכות תרבות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010
Earle's Balanced Salt Solution Sigma E2888
Horse Serum Invitrogen 26050-088
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
Fungizone Invitrogen 15295
D-glucose Sigma G8769

Table 1. Culture Preparation and Maintenance: Horse Serum Medium

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Invitrogen 21103
Gem-21 Neuroplex Gemini Bioproducts 400-160-010
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
D-glucose Sigma G8769
Ascorbic acid Sigma A4544
Fungizone Invitrogen 15295
Sodium chloride Sigma S6546
Magnesium chloride Sigma M1028
Calcium chloride Sigma 21115

Table 2. Culture Preparation and Maintenance: Serum-free Medium

Name Company Catalog Number Comments
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) Thermo Fisher PICM0-3050
6-well Falcon culture dishes Thermo Fisher 08-772-1B
Sytox Green Invitrogen S7020

Table 3. Materials fabrication: Ground Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary tubes A-M Systems, Inc. 2mm x 1.16mm, 4 inches
KCl Sigma P5405
Agar Fisher Scientific A360
EDTA Sigma 5134
Tubing Masterflex 95809-34
1.5 mL centrifuge tube rack Fisher Scientific
Silver wire Medwire AG15X
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
Emery board Walgreens
Scintillation vial Fisher Scientific
Flexible adhesive sealant Amazing Goop
Bleach Clorox

Table 4. Materials fabrication: Ground Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Borosilicate filament Sutter Instruments BF150-86-10 1.5 x 0.86 mm
Micr–lectrode puller Narashige PE-2
Eye piece optical micrometer Zeiss
Stage optical micrometer Zeiss
Compound Microscope Zeiss
Microscope slides Surgipath 00210
1-Dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MO-10
3-dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MM-3
Adhesive putty Scotch
100 mm Nalgene containers Fisher Scientific

Table 5. Materials fabrication: Recording Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Teflon-coated platinum iridium wire A-M Systems 7780 125 μm bare, 200 μm coated
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
30 gauge wire Tensolite
Soldering iron Cooper Tools UTC 100
Solder Bernzomatic Resin core, lead free, silver bearing
Concentrated HCl Fisher Scientific A144-212
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-30
Water-resistant epoxy JB Weld
Banana jacks Newark Electronics

Table 6. Materials fabrication: Stimulating Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 35 mm culture dish Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Cotton squares Walgreens
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Tubing Masterflex 95809-34
Poly vinyl chloride film Fisher Scientific 01810 18 inches x 1000 feet
#9 single edge razor blade Smith

Table 7. Materials fabrication: Recording Dishes

Name Company Catalog Number Comments
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
pH meter Beckman 250 Battery operated
Mini Type-T thermocouples Physiotemp IT series
DigiSense thermometer Cole-Palmer 8528-10
Inline heater Warner Instruments SH278
Gibraltor table Burleigh
Inverted microscope Leica DMIRE2
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541
Cautery tool Gemini Battery operated
Micr–lectrode micromanipulators Narashige WR60 Left and right
Stabilized power supply MGE UPS systems Ellipse 1200 +/- 5 volts (120 total)
Axoprobe amplifier system Axon instruments 1-A
Active filter Frequency Devices Model 900
Axoscope Digidata Axoscope 1322-A
Axoscope software Axoscope v. 9
Computer systems Dell Precision T5400
Origin8 OriginLab Corp v. 8.1
Stimulator isolation unit Bak Electronics, Inc. BSI-II
1/2 inch position magnets Dexter PMO90-3
3 inch position magnets Dexter PMC-800T
Multiple X-Blocks Narishige X-12 For positioning ball joints
Valves Hamilton HVD-3 For medium delivery
Syringe pump Razel A99
Digital oscilloscope Agilant technologies
Digital camera system Quant EM 512-SC
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Microscope objective focus with Pi foc Physik Instrumente E-662.LR
Smart shutter Lambda SC
Dual wavelength fluorescent microscopy Applied Scientific Instruments Polychrome II
Peristaltic pumps Masterflex 77120-62
Aspirator Harvard Apparatus PDMI component

Table 8. Electrophysiological Setup

Name Company Catalog Number Comments
1 M Magnesium Chloride Sigma 057K8620
1 M Manganese Chloride Sigma 018K6107
1 M Calcium Chloride Sigma GA10984
AlexaFluor594-tagged Isolectin-IB4 Invitrogen I21413
Neurobasal Invitrogen 21103
Polyvinyl chloride film Fisher Scientific 01810
MetaMorph Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DMIRE2
Camera QuantEM 512SC
UV light Kubler CODIX
Bipolar Temperature Controller Medical Systems Corp TC-202
Smart shutter Lambda SC
Sytox Green Invitrogen S7020
Falcon 35 mm culture dishes Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Tubing Masterflex 95809-34
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
Gibraltor table Burleigh
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541

Table 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures

Name Company Catalog Number Comments
RNAlater Ambion AM7021
RNase/DNase-free 1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Diamond knife Fine science tools 10100-00
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
TRIzol Invitrogen 15596-026
Centrifuge Eppendorf 5451C
Vortex-genie VWR G-560

Table 10. PCR Preparation: Slice Culture Harvest

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Sigma C-2432
Centrifuge Eppendorf 5451C in cold room
Ethanol, 200 proof for molecular biology Sigma E7023
RNeasy Micro kit Qiagen 74004

Table 11. PCR Preparation: RNA Extraction

Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 2000 Thermo Fisher ND-2000
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid Sigma M-1254
ssRNA ladder NEB N032S
Sodium acetate Sigma S-9513
EDTA Sigma E5134
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000

Table 12. PCR Preparation: RNA Quantification

Name Company Catalog Number Comments
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1
iCycler iQ PCR plates, 96 well Bio-Rad 2239441
Flat cap strips - optically clear. 8-cap strip Bio-Rad TCS0803
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8890
iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 170-8880
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
10x TAE buffer GibcoBRL 15558-026
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Name sequence
TNF-α F 5’ - ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3’
TNF-α R 5’ - CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3’
Rpl13a F 5’ - TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3’
Rpl13a R 5’ - CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3’

Table 13. PCR Activities: qPCR primer optimization and pre-screening

Name Company Catalog Number Comments
RT2 Profiler PCR array SABiosciences PARN-021
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis kit SABiosciences C-06
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis primer mix SABiosciences PBR-3021
RT2 SYBR Green/ fluorescein qPCR master mix SABiosciences PA-011
RT2 qPCR Primer Assay for Rat IFN-λ SABiosciences PPR45050C
Multichannel pipettor Corning
25 mL Bio-pure reservoir with divider Diversified biotech REBP-2000
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1

Table 14. qPCR array plates and low level signaling

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Fisher Scientific Micro 7
Cell lysis kit Bio-Rad 171-304011
BSA protein stock Bio-Rad 500-0007
BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225
Sealing tape Bio-Rad 2239444
96-well plate reader Perkin Elmer 1420-multilabel counter
Phospho 6-plex Assay Lysates Bio-Rad X7000000502
Phospho 6-plex coupled beads Bio-Rad X700000050

Table 15. Multiplex Phosphoprotein Assay

Name Company Catalog Number Comments
Accell 5x siRNA Buffer Thermo Scientific B-002000-UB-100
Accell siRNA Delivery Medium Thermo Scientific B-005000-100
Accell Cyclophilin Pool-Rat Thermo Scientific D-001920-30-05

Table 16. siRNA

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Lysine Sigma L-6001
Sodium phosphate Fisher Scientific S374-1
Sodium periodate Sigma S-1878
Sodium azide Sigma S-2002
Cryostat Leica CM3050 S
Tissue-Tek Ted Pella Inc. 27050
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
Tissue slides Surgipath 00210
Coplin jars Fisher 08-815
Hydrogen peroxide (30%) Sigma H1009
SFX signal enhancer Invitrogen A31631
Goat serum Colorado Serum Company CS 0920
Triton X-100 Sigma T-8787
Anti-NFκβ antibody Santa Cruz SC-109
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012
Yo-yo nuclear counterstain Invitrogen Y-3601
ProLong antifade Invitrogen P7481

Table 17. Proteomic Confirmation Via Immunohistochemistry

Name Company Catalog Number Comments
Anti-cyclophilin B R&D Systems MAB5410
3,3-diaminobenzidine Sigma D8001
Water bath Pharmacia Biotech 56-1165-33 Gebrüder HAAKE GmbH
Ammonium hydroxide J.T.Baker 9721-03
Silver nitrate Sigma S-0139
Sodium thiosulfate (pentahydrate) J.T.Baker 3949-01 &nsp;
0.2% gold chloride Sigma G-4022
Oxalic acid Sigma O-0376
CoolSnap fx CCD camera Photmetrics
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DM IRBE
Neutral density filters Chroma 0.5-3.0 optical density unit range

Table 18. Proteomic Confirmation Via Silver Enhanced Immunohistochemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18, (9), 3416-3425 (1998).
  2. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25, (15), 3952-3961 (2005).
  3. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha. J Neurosci. 28, (47), 12199-12211 (2008).
  4. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, (4), 319-331 (1996).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11. J Neurochem DOI. (2010).
  7. Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning. J Vis Exp. (43), (2010).
  8. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17, (1), 26-43 (1997).
  9. Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. Spreading depression sends microglia on Lévy flights. PLoS ONE. 6, (4), (2011).
  10. Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60, (1), 55-64 (1985).
  11. Gubern, C. Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia. BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).
  12. Tian, Y. F. The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR. Acta Anaesthesiol Scand. 51, (2), 158-164 (2007).
  13. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, (9), e45-e45 (2001).
  14. Bustin, S. A. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55, (4), 611-622 (2009).
  15. Pusic, A. D., Kraig, R. P. Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis. Soc Neurosci abst. (2010).
  16. Quinn, B., Graybiel, A. M. A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction. J Histochem Cytochem. 44, (1), 71-74 (1996).
  17. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369, (1), 93-108 (1996).
דוגמנות איתות החיסון עצבית של מיגרנה אפיזודי כרוני באמצעות הפצת דיכאון<em> במבחנה</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).More

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter