Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering Neurala Immun Signalering av episodiska och kronisk migrän Använda Spridning Depression In Vitro Published: June 13, 2011 doi: 10.3791/2910
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Neurology and Committee on Neurobiology, The University of Chicago Medical Center, 2Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Migrän och dess omvandling till kronisk migrän är enorma sjukvård bördor i behov av förbättrade behandlingsalternativ. Vi strävar efter att definiera hur neurala immun signalering modulerar känsligheten för migrän, modellerade

Abstract

Migrän och dess omvandling till kronisk migrän är sjukvård bördor i behov av förbättrade behandlingsalternativ. Vi strävar efter att definiera hur neurala immun signalering modulerar känsligheten för migrän, modelleras in vitro med hjälp av att sprida depression (SD), som ett sätt att utveckla nya terapeutiska mål för episodisk och kronisk migrän. SD är den troliga orsaken till migrän aura och migrän smärta. Det är en paroxysmal förlust av neuronal funktion utlöses av initialt en ökad nervaktivitet, som sakta sprider sig inom känsliga områden i hjärnan. Hjärnans normala funktion är extremt känsligt för, och förlitar sig på, sammanfallande låg nivå immun signalering. Således påverkar neurala immun signalering sannolikt elektriska aktiviteten hos SD och därför migrän. Smärtupplevelse studier av SD i hela djur är förenat med svårigheter, men hela djur är väl lämpade för att undersöka systembiologi aspekter av migrän sedan SD aktiverar trigeminala nociceptiv vägar. Däremot kan hela djurstudier ensamma inte användas för att dechiffrera den cellulära och neurala kretsar mekanismer för SD. Istället för in vitro-preparat för vilka miljöförhållanden kan kontrolleras är nödvändiga. Här är det viktigt att inse begränsningarna av akut skivor och distinkta fördelar hippocampus skiva kulturer. Akut hjärnan skivor kan inte avslöja subtila förändringar i immunsystemet signalering sedan förbereda skivor ensam utlösare: pro-inflammatoriska förändringar som sista dagarna, epileptiforma beteende på grund av höga halter av syre spänning som behövs för att vitalisera skivor, och irreversibel cellskada vid syrefria bit centra.

Däremot undersöker vi immuna signalering i mogna hippocampus slice kulturer eftersom de kulturer nära parallell sin in vivo motsvarighet med mogna trisynaptic funktion, visar vilande astrocyter, mikroglia och nivåer cytokin, och SD är lätt att induceras i en unanesthetized beredning. Dessutom skivor är långlivade och SD kan induceras på varandra följande dagar utan skador, vilket gör denna beredning det enda sättet to-date kan modellering neuroimmune konsekvenserna av kronisk SD, och därmed kanske kronisk migrän. Vi använder elektrofysiologiska tekniker och icke-invasiv imaging att mäta neuronala celler och funktioner kretsen sammanfaller med SD. Neural immun genexpression variabler mäts med qPCR screening, matriser realtids-PCR och, viktigare, användning av cDNA Förförstärkning för detektion av extremt låg nivå mål som interferon-gamma använda hela, regionala eller specifika celler förbättras (via laser dissektion mikroskopi) provtagning. Cytokin kaskad signalering utvärderas ytterligare med multiplex fosfoprotein relaterade mål med genuttryck och förändringar fosfoprotein bekräftas via cell-specifika immunfärgning. Farmakologiska och siRNA strategier används för att efterlikna och modulera SD immun signalering.

Protocol

Flera punkter är värda att betona för framgångsrika studier av immun-relaterade SD-signalering i hjärnan skivor. Först måste initiera stimuli depolarize synkront en tillräcklig volym av grå substans hjärnan att inleda SD. Detta innebär att ett gränssnitt konfiguration (dvs vätska exponering bara under och gasväxling ovan bit kultur sätter) krävs. 1,2 det andra, akut hjärnan skivor upprätthålla SD utan trauman från sina förberedelser, samt användning av 95% syre kolsyrat Ringers lösning genererar pro-inflammatoriska förändringar och epileptiform beteende respektive som kan förändra neural krets funktion och immun homeostas. 3 tredjedel, medan hippocampus slice kulturer övervinna dessa akuta skiva begränsningar är det viktigt att notera att skära kulturer bör bevaras för adekvat perioder före bruk (dvs. mer än 10 dagar in vitro) så att mikroglia och astrocyter bli vilande. 3-5 Slutligen bör SD induceras med hjälp av sterila och aseptiska tekniker. De tekniker som beskrivs nedan är utformade för att uppfylla detta behov.

1. Sprida Depression hos Slice kulturer

  1. Kultur förberedelser och underhåll.
    1. Skiva kulturer är förberedda och upprätthålls i häst-serum-baserat medium eller en serumfritt medium (SFM) 6,7 som tidigare beskrivits 8 med smärre ändringar av mediet. Inkubering parametrar är 36 ° C, 5% CO 2, 95% luftfuktighet balans luft.
      1. Vi finner att kulturer kan ställas om till ett hållbart skogsbruk efter 18 dagar in vitro och underhållas för att minst 35 dagar in vitro med hjälp av våra tidigare definierade SFM som innehåller extra kalcium och magnesium.
      2. Dessutom, antibiotika och en antifungicide läggs för att förebygga smittsamma föroreningar i samband med multipel inspelning episoder.
      3. Denna långsiktiga (eller inspelning) medium formulering innehåller (per 100 ml): Neurobosal medium, 97 ml, Gem-21, 2,0 ml; Glutamax (200 mm), 0,5 ml, Gentamycin (10 mg / ml), 10 mikroliter; D-glukos (45%), 680 mikroliter, askorbinsyra (0,5 M), 100 mikroliter, Fungizone, (250 mg / ml), 400 mikroliter, NaCl (5,0 M), 820 mikroliter, Mg 2 Cl 2 (1,0 M) , 80 mikroliter, CaCl 2 (1,0 M), 160-240 mikroliter.
      4. Kulturer används för SD 21 till 35 dagar in vitro.
    2. Vitalitet verifiering. 3,6,7
      1. Kulturer är kontrollerade för bevis på pyramidal neuron döden före användning.
        1. På 18 dagar in vitro, är insatser inkuberas i 20 min i medium (under normala inkubationstiden förhållanden) som innehåller 5 mikroM Sytox Green, en markör som blir självlysande när det binder till DNA (dvs genom att tränga in i döda celler).
        2. Infogar överförs sedan tillbaka till sin tidigare medium och granskas med fluorescensmikroskopi (504 excitation och 523 emission) för tecken på CA3 eller CA1 pyramidala neuron lager skada.
          1. Skivor med mer än 20 celler eller en harmoniserad fluorescens större än 250 IE uteslöts från vidare användning.
  2. Material tillverkning.
    1. Ground elektroder är gjorda med glasrör (2,0 mm YD / 1,16 mm innerdiameter) kapas till 4,5 mm längder och kort brand polerade i båda ändarna.
      1. Vi gör ungefär 20 elektroder på en gång, som kan pågå i mer än ett år.
      2. Ta 100 ml 1M KCl att koka och lägga till, under omrörning, 3,5 g agar och 0,5 g EDTA (Etylendiamintetraättiksyra dinatriumsalt dihydrat) för att producera en klar gul lösning.
      3. Använd en kort längd på flexibel slang monterad över varje glasrör att dra varma KCl / agar lösningen i glasrör samt en bit in i slangar.
        1. Släpp sug och låt KCl / agar rinna sakta ur den öppna spetsen av ett glasrör, håller sedan öppet spetsen glasröret mot en bit av is.
        2. Den senare manövern kommer att förmå agar att gelen vid elektroden spetsen och inte gelen efter vikande tillbaka upp i glasröret.
      4. När agar har geléartad i kallt rinnande vatten, kan det flexibla röret tas bort utan att ändra agar placerad i glasrör.
      5. Placera 0,5 ml 1 M KCl i varje brunn i en 1,5 ml centrifugrör rack. Placera sedan ett tips av varje fylld KCl / agar glasrör i enskilda brunnar.
      6. Nästa, håll en 80 cm längd 15 gauge silvertråd med en hemostat och ren var och en av fyra sidor genom att skrapa tråd genom en Emery Styrelsen hade till bänk.
      7. Klipp kabeln till 4 cm längder och placera dem i en scintillation flaska fylld med blekmedel i 20-30 minuter att sätta ett fast Ag-AgCl päls över den rengjorda silver yta.
      8. Böj varje tråd på mitten och sätter den fria ändarna i ena änden av glasrör fyllt with KCl / agar, vilket innebär att ungefär 4-6 exponerade mm.
      9. Slutligen belägga glasrör skaftet som innehåller silver tråd och en liten del av kabeln med Goop, en vattentålig och flexibelt lim, för att förhindra att KCl / agar från att torka. Upprepa för alla elektroder. Låt limmet torka över natten.
      10. Förvara elektroderna vid 4 ° C i skintillationsflaskor (5-6 elektroder / flaska) som innehåller ca 5 ml 1 M KCl och 25 mg EDTA, som påtagligt hämmar bakterietillväxt.
    2. Inspelning elektroderna är tillverkade av 1,5 mm diameter (0,86 mm innerdiameter, 10 cm lång) borsilikatglas rör med filament (Video Figur 1).
      1. Dra microelectrodes till en fin spets med kort glasrör dras till en vass spets.
        1. Vi brukar dra elektroder ~ 7,5 cm i längd med en 1 cm kona. Detta gör tillräckligt positionering och elektrodspets visualisering.
        2. Elektroder dras med en Narishige PE-2 avdragare.
        3. Mikroelektrod tips bryts tillbaka till 2-4 ìm i visualisering med hjälp av ett sammansatt mikroskop utrustat med en kalibrerad optisk mikrometer. Vi använder kanten av ett standard glas histologi bild (25 x 75 x 1 mm) som hör till en hydraulisk endimensionella mikromanipulator innehas av en annan 3-dimensionell manipulator för att försiktigt bryta mikroelektrod tips.
          1. För det första är elektroden monteras ansluten till ett objektsglas med lera.
          2. Då bilden läggs på objektglas hållare som används för att flytta mikroelektrod spetsen nära kanten av glaset gled bifogas hydraulisk manipulator.
          3. Slutligen är toppen av ett mikroelektrod lätt bryts genom att trycka upp mot hydrauliskt drivna objektglas kant.
    3. Stimulerande elektroder är vridna elektroder tråd bipolär eftersom:
      1. De tillåter inspelning av framkallade fält potentialer, som annars skulle skymmas av den stimulans artefakt från monopolär stimulering.
      2. En bipolär stimulerande elektrod kan lätt appliceras på dentate gyrus ytan utan att skada, till skillnad från vass spets bipolära elektroder.
      3. Slutligen tillämpas nuvarande är lokaliserad till den tvärgående (nakna) cirkulära ytor teflon isolerade ledningar som används för elektroden.
        1. Stimulerande elektrod tillverkning börjar med att skära ca 20 cm längd av platina-iridium (125 ìm nakna diameter, 200 ìm belagda diameter) och teflonbelagd wire. Sedan böjer längden på mitten och knyt de lösa ändarna i en lös fyrkant knut, lämnar ~ 2 cm från knut till ändarna av kabeln.
        2. Säkra knut i chucken av en elektrisk handborrmaskin placeras på ett bord.
        3. Håll den andra änden av kabeln med en hemostat, kort slår borren på och av tills kabeln är ordentligt vridna (dvs varje snittyta skulle vara lika avstånd från den andra när kabeln kapas i tvärriktningen utan att reda ut ).
        4. Nästa, den nakna ändarna av platina-iridium tvinnade trådar behöver fästas avledningstrådarna används för att ansluta stimulerande elektrod till en stimulans isolator.
          1. Detta görs genom lödning fria ändarna av platina-iridium ledare till ~ 50 cm 30 gauge ledningar.
          2. Först tejpa platina-iridium tvinnad tråd till en bänk och släppa en pöl av koncentrerad HCl under en fria änden av tvinnad tråd.
            1. Nästa band ut ca 1 cm av isoleringen från varje tråd med en avbitartång.
            2. Placera avskalade änden på en ledaren i anslutning till den tvinnade tråden änden och hetta från en spetsig lödkolv, så löd tills de två kablarna är ordentligt fastsatt.
          3. Sätt en liten längd av krympslang över utsatta trådsanslutning och krympa det passar med värme.
          4. Upprepa för den andra tråden.
          5. Brand polera toppen av en 15 cm pasteurpipett och vägleda vridna platina-iridium tråd ner pipetten tills ca 6 cm i den tvinnade sticker ut.
          6. Använd en vattenavstötande epoxi (t.ex. JB Weld) försegla båda ändarna av elektroden.
          7. Slutligen, fäst banankontakter till ledaren ändar för anslutning till den stimulans isolator.
          8. Enligt stereoskopiska observationer, placera elektroden spetsen i PBS och leta efter elektrolytiskt producerade bubblor kommer endast från den avskurna ändan av elektroden tips. Om eventuella luftbubblor kommer från sidorna i den tvinnade trådar, klippa elektrod med ett tvärgående snitt med en fräsch enda blad kant rakkniv återupprätta intakt isolering till tråd långa axlar.
          9. Vid felsökning för att lösa avvikande stimulanser, försöka göra en nyklippt elektrod spets.
    4. Inspelning rätter består av somlöss kulturen in i ett 35 mm kultur maträtt som sitter på två 1,0 x 12 stavar mm glas placerade ca 1,0 cm mellanrum. Fäst glasstavar till skålen basen genom att värma upp glasrör och sedan trycka in dem i basen med pincett.
      1. För statiska inspelningsförhållandena, tillsätt 1,5 ml medium till skålen.
      2. Nästa, blöt en ~ 10 mm bred och 3-4 cm lång bit av sterilt bomull i 1,0 ml medium. Vik bomull i halv längs den långa axeln och placera den längs inre väl på skäret med steril pincett. Den våta bomullen bidrar till att upprätthålla rätt fuktighet.
      3. Tre komprimerbar 4 mm slanglängder är jämnt fördelade runt insatsen.
      4. Täck skålen hårt med polyvinylkloridfilm, vilket möjliggör gasutbyte.
      5. Skär runt sin mid-vertikal vägg med en enda kant rakblad för att avlägsna överflödig film polyvinylklorid.
  3. Elektrofysiologiska installation
    1. En bit kultur sätter monteringen placeras i PDMI inspelningen kammare för elektrofysiologiska inspelningar.
      1. Insatsen / kultur maträtt montering i PDMI kammaren är täckt av en 2 mm tjock plast skiva medföljer PDMI kammare, med olika små hål placerade som behövs för inspelningar elektroder, medelstora inflöde / utflöde rör, etc.
      2. Vi följer regelbundet mediet pH med en miniatyr kombination pH-elektrod och temperatur med en miniatyr av typ T termoelement sond monterad i en sluten semi-mikroelektrod att garantera 7,3 pH och 36,0 ° C förhållanden.
      3. Insatsen / Kammaren luftas med 5% koldioxid-balansen luft och medium är antingen hålls statiskt eller i ett flöde (1,2 ml / minut) konfiguration med in mitt rum på 35-36 ° C.
      4. För flödesförhållanden, är medelhög värms med en inline-värmare, återigen för att hålla mitt i inspelningen kammare vid 36 ° C.
        1. Ett Slangpumpar system med en tryckavlastningsanordning ger medelhög till att segmentet kulturer utan pulsationer från pumpen. En aspirator medföljer PDMI kammare används för att avlägsna mediet från insatsen via skonsam sugkraft.
      5. För stabilitet, är kammaren monterad på en speciellt utformad Burleigh-Gibraltar inverterat mikroskop skede som innehar ett inverterat mikroskop och sitter på en vibrationsfri bord.
      6. Små hål öppnas genom polyvinylklorid in wrap med en liten, batteridriven kauterisation verktyg.
      7. Nästa, om ett flöde konfiguration ska användas, är in-och utlopp flöde börjat, följt av placering av en jordelektrod. Annars, enkelt uttryckt marken elektroden på plats.
      8. Elektroder, hålls på plats med micromanipulators, är placerade precis ovanför en bit visualiseras med ett inverterat mikroskop vid 5x förstoring (Fig. 1).
        1. Börja med inspelningen elektroden följt av stimulerande elektroden.
        2. Vi använder en audio monitor att notera när mikroelektrod kommer i kontakt med slice. Spetsen är placerad vid mittpunkten längs CA3 pyramidal cellkroppen lager.
        3. Inspelningarna är igång, och sedan stimulerande elektroden försiktigt rörd till mittpunkten yta dentate gyrus.
        4. I båda fallen är de första elektrod rörelser åstadkoms med grov kontroller, och slutlig placering endast med hydraulisk, fina kontroller med hjälp av belysning faskontrast så att cellkroppen lager kan lätt skiljas.
        5. Advance elektroder i ~ 25 ìm steg under direkt mikroskopiska visualisering.
        6. När elektroderna vidröra vävnaden, avancera elektroderna annan 20-30 ìm.
        7. Inspelningarna börjat före stimulerande elektrod sätts på plats för att vara säker på detta inte utlöser SD (dvs via en mekanisk stimulus).
        8. ~ 10 minuter tillåtas förflyta innan experiment startas.
  4. Transynaptically inducerad SD.
    1. Optimera evoked CA3 fältet potentialer på följande sätt (Figur 2).
      1. CA3 fältet potential framkallat med 100 ìs pulser (0,2 Hz) börjar med en ström som är tillräcklig för att utlösa en respons (t.ex. ~ 1-5 μA).
      2. Flytta in elektroden i steg längs den pyramidala neuron långa axeln tills fältet potentialen är maximal.
      3. Sedan öka de nuvarande med inspelningen elektroden i denna position och notera den maximala nuvarande svaret (t ex ~ 10-20 μA).
      4. Slutligen använder halv-maximal stimulusintensitet för experiment (t.ex. bluff kontroll regelbunden stimulering).
    2. Bestäm tröskeln för synaptically framkallat SD (Fig. 2).
      1. Med konfigurerade elektroderna som beskrivs ovan för framkallade fält potentialer, växla stimulans paradigm till enstaka, manuellt framkallat sprickerav 10 pulser (10 Hz @ 100 uS / puls), ett paradigm som tidigare använts i hela djurstudier.
      2. Gradvis öka strömstyrkan per stimulans brast tills SD utlöses. Vänta minst 60-120 sek mellan stimuli.
      3. Rapport SD tröskel i Coulomb (dvs nuvarande x tid).
    3. I andra experiment som kräver mätning svar på induktion av flera SDS, använd en stimulans styrka sannolikt att framkalla SD (t.ex. ~ 100-500 NC).
      1. Trigger SD var 9 min för en timme.
      2. Se till att använda aseptisk teknik under experiment.
      3. Efter sista SD, tillbaka kulturen in till normala inkubationstiden förhållanden.
        1. Markera kultur maträtt att notera den kultur som upplevs SD.
        2. Vår vana är att placera en enda märket på vänster och två märken till höger för den del kulturen infoga, notera de tre kulturer som # 1, # 2 och # 3 från vänster till höger.
        3. Ändra medelstora var 3-4 dagar tills kulturen skörden.
    4. För återkommande SD, följa procedurerna som beskrivs ovan.
    5. Vi testar typiskt för en förändring i SD tröskel 1, 3, 7, och 14 dagar efter en första timme av flera SDS.
    6. CA3 området snabbt potential och långsamma eventuella förändringar bokförs via separata digitala system signalbehandling.

2. Exemplariskt Vital Imaging i hippocampus Slice kulturer

  1. Dynamisk funktionella beteende bosatt immunceller (dvs mikroglia) kan på liknande sätt övervakas slice kulturer utan cellen skada eller immun aktivering (Fig. 3). 9
    1. Till exempel att märka mikroglia att bedöma deras förflyttning i samband med synaptisk aktivitet förändringar av SD använde vi fluoroforen-märkta isolectin-IB 4.
    2. "Lektin PBS" är PBS med ytterligare katjoner (0,1 mm vardera CaCl 2, 2 MgCl, MnCl 2) sedan divalenta katjoner (0,1-1,0 mm) som krävs för att binda lektin till α-D-galactosyl beståndsdelarna på microglial cellmembran.
    3. Gör en lösning av "lektin PBS":
      1. För 1 L PBS, med aseptisk teknik och steril filtrering, lägg till:
      2. 100 mikroliter av 1M MgCl 2
      3. 100 mikroliter av 1M MnCl 2
      4. 100 mikroliter 1 M CaCl 2
    4. Blanda väl att kombinera och hålla i kylskåp vid 4 ° C.
      1. Endast 500 mikroliter av "lektin PBS" behövs per flaska isolectin, men eftersom den kan förvaras i kylskåp och förvaras i månader i taget, kan det vara bra att göra upp större volymer.
    5. Lös AlexaFluor 594-märkta isolectin-IB4 (isolectin) frystorkat pulver till1 mg / ml i "lektin PBS".
      1. För att minimera fotoblekning, utför detta steg så snabbt som möjligt, vilket minimerar ljusexponering.
      2. Isolectin kan alikvoteras till 20 mikroliter gång rekonstitueras 1mg/ml och förvaras vid -20 ° C i upp till ett år.
      3. Späd isolectin till 20 mikrogram / ml i odlingsmedium och inkubera kulturer skiva vid normala inkubationsförhållanden 4-10 timmar innan avbildning.
    6. Imaging set-up.
      1. Imaging set-up består av: mikroskop, slutare, kamera, ljus, 2,0 filter med neutral densitet, 36 ° C, gas: 5% CO2, luft (eller 20% syre, balans kväve).
      2. Slå på mikroskop, kamera, UV-ljus, temperatur och gaser i minst en timme före avbildning.
    7. Sätt upp metamorfa Imaging protokollet.
      1. Från "Journal" drop-down menyn, välj "Kör tidning ...".
      2. Detta borde föranleda öppnandet av TIDSKRIFTER mapp från vilken du bör välja "Motion w-var AFS (tidskriften tidigare fastställts som följer stegen nedan)", klicka "Öppna".
      3. Den "Autofokus Frequency"-fönstret kommer att dyka upp härnäst, hålla Antal vid 1, klicka på "OK".
      4. Därefter Setup "sekventiell fil Na ..." fönster visas, hålla allt som det är:
        1. Base Namn: Bild;
        2. Bildnummer: 1;
        3. Antal Bredd: 3;
        4. Filformat: metamorfa TIFF;
        5. Om bilden redan finns -> Skriv över automatiskt;
        6. Klicka på "Välj katalog ...", detta kommer att orsaka" Bläddra efter mapp "fönster att dyka upp. Här väljer du den mapp (eller skapa en ny mapp) där filmen ramarna ska sparas.
        7. När sedan rätt mapp (t.ex. C: \ Data \ Ny mapp) visas i botten av "Setup sekventiell fil Na ..." fönstret, klicka på "OK".
        8. I Acquire fönstret:
          1. Välj den inställning i det nedre vänstra hörnet för att vara DiIMGBIN2;
          2. "Exposure Time": 20ms, "Binning": 1.
        9. Då, i den särskilda fliken:
          1. "Sensor Mode": FT;
          2. "DigitaliseringZer ": 10MHz (EM Gain);
          3. "Gain": Gain3 (3x);
          4. Välj "EM Gain: 45"; kamerans slutare: Öppet för Exponera, Clear Mode: tydliga och på förhand EXP, Rensa Antal: 2, Trigger Mode & Live Trigger Mode: Normal (TID).
        10. "Frames till AVG": 3.
        11. Klicka på "Stäng".
    8. När du har installerat metamorfa bildbehandling, placera in i en 35mm kultur skålen med två 1 stavar mm glas i botten.
      1. Placera tre 2 mm bitar av gummislang monteras mellan väggarna i insatsen och den kultur skålen för att ytterligare stabilisera insatsen.
      2. Placera en ~ 10 mm bred bit bomull indränkt i ytterligare 1 ml mediet inuti insatsen för att bibehålla en fuktig miljö. Se till att den är jäms med väggarna och bort från hippocampus skivor.
      3. Täck toppen av kulturen skålen hårt med polyvinylkloridfilm för att förhindra vätskeförlust.
    9. Se till att fokus för bildbehandling är CA3 pyramidformade cellager. Notera skiva orientering genom att ta fas bilder på 5x, 10x och 20x.
    10. I "Hitta Focus" fönstret som visas på skärmen, som intervall, Aktuell + / - för att vara "8", och noggrannhet i mikron (s), att vara "1" (båda rutorna längst ner bör kontrolleras) .
    11. Klicka på "hitta fokus" för att säkerställa ett i-fokus bild.
    12. I "Hämta Timelapse" fönstret väljer du tidsintervall för att vara "1 minut" och varaktighet att vara "6 timmar" (dessa är våra bästa förvärvet parametrar).
      1. Att exakt fånga microglial rörelser bör avbildning inte vara mindre frekvent än en gång per minut.
    13. I bildlagring, välj Stack.
    14. Uppdatera Bild Fönsterenhet bör kontrolleras, men inte de andra två lådorna under.
    15. Välj "Illum" att vara "Lambda".
    16. Klicka på "OK".
    17. Filmen kommer nu att börja löpa. Detta innebär att inget annat kan utföras inom den metamorfa programmet tills filmen är slut eller tills du stoppar filmen tidigt genom att klicka på Esc, varefter filmen kommer sedan att stanna vid tidsinställda nästa förvärv steg.
    18. I slutet av filmen, kontrollera om cellen skada genom Sytox screening som ovan (A).

3. RNA-extraktion för lågaktivt Cytokine Signaling 11-15

  1. Vi presenterade tidigare detaljerade instruktioner för detektion av lågaktivt cytokin signalering i slice kulturerna med qPCR och PCR-tekniker array. 6,7
  2. Vi har markant förbättrade känslighet för våra metoder för cytokin mRNA detektion i slice kulturer och presentera dessa förbättringar här.
  3. Förbättringarna inkluderar vår inställning till vävnad skörd och RNA isolering, prescreening prover för tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) ändra och cDNA preamplfication, som är ~ 6 gånger känsligare än tidigare tekniker och, till exempel möjliggöra detektion för första gången slice kultur interferon-gamma (IFN-λ) upptäckt. 15
  4. PCR-förberedelser.
    1. Skiva kultur skörd.
      1. Efter experiment, skiva kultur skären är nedsänkt i 2-3 ml RNA senare och lagras vid 4 ° C i upp till 3 dagar tills vidare bearbetning.
      2. Att skörda, ta bort främmande (dvs vävnader i anslutning till hippocampus korrekt) vävnad med hjälp av en diamant kniv och lyft skivor i individuella RNas / DNas fria 1,5 rör mL centrifugrör innehållande 0,5 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med en fin spets färg borste.
      3. Spin prover (10.000 rpm x 1 min) i ett stereotypa sätt så alla skivor följer samma sida av sina rör.
      4. Ta bort PBS supernatanten och återsuspendera provet i 500 mikroliter TRIzol.
      5. Förvara proverna vid -80 ° C eller hålla på is tills RNA-extraktion.
    2. RNA-extraktion usingTRIzol med RNeasy Micro satsen resulterar i större RNA avkastning (bild 4) än användning av satsen ensam.
      1. Tina TRIzol-prover och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
      2. Dissociera vävnad genom att prov upp och ned med 1 ml tippade pippetor och / eller vortexa tills fast vävnad är inte längre syns.
      3. Tillsätt 100 mikroliter RNas (RF) kloroform och vänd röret 2-3 gånger för att blanda.
      4. Inkubera 3 min vid rumstemp, vortexa varje minut.
      5. Centrifugera vid 13.000 rpm i 15 minuter vid 4 ° C.
      6. Överför supernatanten till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör. Var noga med att inte störa gränssnitt.
      7. Tillsätt en motsvarande volym av rumstemperatur RF 70% molekylärbiologi kvalitet etanol (~ 300 mikroliter).
      8. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned några gånger.
      9. Fortsätt med följande steg per RNeasy Micro kit riktningar:
        1. Applicera prov till en RNeasy mikro kolumn placeras i en 2ml collection rör.
        2. Centrifugera vid 10000 rpm i 15 sek, kasta genomströmning.
        3. Tvätta RNeasy kolonnen med 350 mikroliter buffert RW1.
        4. Centrifugera vid 10000 rpm i 15 sek, kasta genomströmning.
        5. Tillsätt 10 uL DNas 1 stamlösning till 70 mikroliter buffert FUD, blanda försiktigt.
        6. Applicera 80 mikroliter av DNas lösning direkt på membranet och inkubera vid rumstemperatur i 20 min.
        7. Tvätta RNeasy kolonnen med 350 mikroliter buffert RW1.
        8. Centrifugera vid 10000 rpm i 15 sek, kasta genomströmning och rör.
        9. Tillsätt 500 mikroliter buffert RPE till RNeasy kolumn.
        10. Centrifugera vid 10000 rpm i 15 sek, kasta genomströmning.
        11. Tillsätt 500 mikroliter RF 80% molekylär etanol biologi klass till RNeasy kolumn.
        12. Centrifugera vid 10000 rpm i 2 min, kasta genomströmning och rör.
        13. Placera RNeasy kolumn i nya rör med locken öppna.
        14. Centrifugera vid full hastighet (dvs 14.000 rpm) i 5 minuter.
        15. Överföring RNeasy kolumn till en RF-mikrocentrifugrör.
        16. Applicera 14 mikroliter RF vatten direkt på membranet.
          1. Centrifugera vid 10000 rpm i 1 minut till eluera.
          2. Förvara proverna vid -80 ° C eller fortsätta till nästa steg.
    3. RNA kvantifiering.
      1. Späd RiboGreen 1:200 i RF 1x Tris-EDTA (TE) buffert.
      2. Förbered jäst tRNA som ska användas som RNA-standard.
        1. Arbeta lager lagras i -20 ° C vid 100 mikrogram / ml
        2. Späd till 1 mikrogram / ml (10 mikroliter i 990 mikroliter TE).
        3. Skapa standarden som följer: För 100 ng / mikroliter, tillsätt 100 mikroliter, till 80 ng / mikroliter, lägga 80 mikroliter tRNA och 20 mikroliter TE, till 60 ng / mikroliter, tillsätt 60 mikroliter tRNA och 40 mikroliter TE, för 40 ng / mikroliter Tillsätt 40 mikroliter tRNA och 60 mikroliter TE, till 20 ng / mikroliter lägga 20 mikroliter tRNA och 80 mikroliter TE, och 0 ng / mikroliter lägga 100 mikroliter TE.
      3. Förbered prover:
        1. Kombinera 99 mikroliter TE + 1 mikroliter prov.
        2. Kör varje prov i två exemplar.
      4. Med hjälp av en flerkanals pipett, tillsätt 100 mikroliter av utspädd RiboGreen per brunn.
      5. Pipettera upp och ner för att blanda.
      6. Mät fluorescensen på en tallrik läsare.
        1. Fluorescein (485 nm/535 nm, 0,1 sek) program.
        2. Exportera resultat till ett Excel-ark.
    4. Bestäm RNA-koncentrationen.
      1. Diagram uppsugningsförmåga jämfört med RNA-koncentrationen och skapa en som passar bäst linjär regression linje i Excel.
      2. Bestäm urval RNA koncentrationer från regressionsekvationen i samband med bäst passar linje.
    5. Bestäm RNA kvalitet.
      1. Ribosomalt RNA bandet integritet mäts via agarosgel (bild 4).
        1. Även om det är opraktiskt att köra en bråkdel av varje RNA prov som tagits (sedan = 1 mikrogram av RNA krävs och våra skördar är små), är det en god idé att regelbundet köra en denaturering agarosgel på ett föredömligt exempel som bevis på att metoden När den görs rätt, ger hög kvalitet RNA (dvs utan försämring).
        2. Bered en 1% agarosgel (för en 100 ml volym).
          1. Rengör elektrofores tanken, gjutning brickan och gel kammar noggrant med RNas BORTA.
          2. Väg upp 1 g av ultrarent agaros i en kolv.
          3. Tillsätt 83 ml RNas fritt vatten och 10 ml 10x MOPS [3 - (N-Morpholino) propanesulfonic syra] buffert och mikrovågsugn tills agaros upplöses och lösningen är klar (~ 3 min).
            1. För att göra 10x MOPS buffert
              1. Kombinera 83,7 g MOPS, 13,6 g natriumacetat, och 3,7 g EDTA.
              2. Tillsätt 800 ml RNas fritt vatten, blanda för att lösa upp.
              3. Justera pH till 7,0 och fyll till 1 l.
              4. Filtrera sterilisera eller autoklav.
              5. Förvaras vid rumstemperatur, skyddat för ljus.
          4. Låt gelen svalna till 55 ° C och tillsätt 7 ml 37% formaldehyd (detta steg bör ske i en kemisk dragskåp).
          5. Häll gelen i gjutning brickan och låt gelen stelna i huven.
        3. Förbered RNA prover.
          1. RNA-prov buffert (500 mikroliter, göra nya).
            1. Kombinera 50 mikroliter 10x MOPS, 250 mikroliter formamid, 90 mikroliter 37% formaldehyd, 108 mikroliter RF H ​​2 O och 2 mikroliter etidiumbromid (stamlösning 10 mg / ml).
          2. Till 1-10 mikrogram av RNA, lägga fördubbla sin volym med hjälp av prov buffert, för en tre-faldig utspädning.
          3. Denaturera vid 95 ° C i 5 min och sedan kyla på is i 5 min.
          4. Spin briefly och ladda hela provet i brunnar vid sidan av en RNA-stege (lägg laddningsfärg om så önskas).
        4. Elektrofores
          1. Fyll kammare med 1x MOPS buffert.
          2. Elektrofores på 50-75 volt tills värdena har migrerat om 2/3rd längden på gelen.
        5. Visualisera gelen på en UV-transilluminator.
          1. Kontrollera att det finns vassa 18S och 28S ribosomalt RNA (rRNA) band, och att 28S bandet är dubbelt så intensiv som den 18S bandet (bild 4).
          2. Försämrad RNA kommer att ha en utsmetad utseende, suddig band, eller inte kommer att ställa ut förhållandet 2:1.
    6. Vanligtvis använder vi optisk densitet för att bedöma total RNA kvalitet.
      1. Fast inte lika känslig, UV-spektrofotometri via en Nanodrop är en snabb och kostnadseffektiv sätt att kontrollera RNA kvalitet.
      2. Leta efter optiska densitet (OD) 260/280 förhållandet 1,5-2,0.
      3. Tänk på att den lösning som RNA är återsuspenderad (TE buffert kontra vatten) kommer att påverka OD förhållandet.
  5. PCR-aktiviteter.
    1. Pre-PCR-installation
      1. Design specifika primers
        1. Använda NCBI är Primerblast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ :
          1. Skriv in målgenen är Refseq anslutning nummer.
          2. Ange PCR-produkt storlek 70 till 200 bp.
          3. Ange en Tm av 55-72 °, med mindre än 5 ° skillnad mellan fram och back grundfärger.
          4. Välj "Primer får span en exon-exon korsningen" för att minska genomiska bakgrunden.
          5. Aktivera specificitet kontrollera Rat Refseq RNA databas för att säkerställa att primers inte känner igen ytterligare mål.
          6. Välj en grundfärg par från resultat som passar följande kriterier:
            1. 18-30 baser lång.
            2. Mindre än 2000 baser isär på din mall.
            3. 40-60% guanin-cytosin innehåll för att säkerställa stabila bindning av primer till mall.
      2. Välja en referens gen.
        1. Inte varje referens gen kommer att vara lämpliga för din experimentell inrättas. Varje gång ett nytt paradigm används bör stabiliteten i din referens verifieras. För konsekvensens valde vi att använda en av de fyra referens gener som finns på RT 2 Profiler PCR-array.
        2. En bra referens gen bör uppfylla följande kriterier:
          1. Dess uttryck nivå ändras inte av den experimentella paradigm.
          2. Den uttrycks på nivåer som liknar målgenen.
        3. För att välja en lämplig referens:
          1. Granska litteratur för att identifiera sannolika kandidater till en stabil referens gen i ditt system. Till exempel, testade vi Rpl13a eftersom det visade sig vara stabilt i studier av ischemi. 11,12
          2. Design grundfärger som diskuteras ovan (eller hitta redan validerats primrar för gemensam referens gener i en databas som RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ).
          3. Optimera primers längs primers målgenen (se nedan).
          4. Bestäm vilken kandidat hänvisning mest stabila med hjälp av programvara såsom Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) som beräknar en stabilitet värde för varje gen baseras på koncerninterna varians och väljer genen (s) med minsta uttryck variation över proverna. Till exempel är Rpl13a en optimal referens genen för SD (bild 4).
      3. Optimera grundfärger.
        1. För att få konsekventa och tillförlitliga resultat från realtids-PCR primers måste uppfylla vissa kriterier för reproducerbarhet, känslighet och specificitet.
          1. Det är bäst att testa dessa parametrar för varje ny primer par.
          2. Reproducerbarhet testas för genom att köra tekniska replikat.
          3. Känsligheten kan bedömas genom prestanda med en standardkurva på varandra 4-faldig spädningar.
          4. Specificitet bestäms genom att bekräfta en enda produkt genom att smälta kurva analys och gelelektrofores (bild 5).
        2. Kör en qPCR tallrik för att testa kvaliteten på din grundfärg, och koncentrationen av primer som ska användas.
          1. Använda cDNA syntetiseras från hela hjärnan RNA, skapa en standard kurva (serie konsekutiva 4-faldig utspädning) enligt följande: 1, 1:4, 1:16, 1:64, 1:256, och ingen mall kontroll (NTC) .
          2. För varje spädning, kör 1 mikroliter cDNA i duplicaTe för varje koncentration av grundfärger, (dvs 100 nm, 200 nm, 300 nm).
        3. Kontrollera att tekniska replikerar ger konsekvent Ct-värden.
        4. Undersök Ct-värdena för spädning kurvan.
          1. Plotta Ct-värdena mot koncentrationen för varje utspädning. Den resulterande grafen skall vara linjär med en bra korrelationskoefficient (dvs> 0,95).
        5. Undersök smälta kurva för att bekräfta närvaron av en enda förstärkning produkt (dvs. enkel topp).
          1. Om det finns flera toppar eller toppar inte liknar varandra, kan detta tyda på förorening, mispriming, primer-dimer artefakt, mm (bild 5).
          2. En topp i NTC kommer sannolikt att motsvara primer dimerer som bildar lättare i avsaknad av mall cDNA, och bör inte vara ett bekymmer.
        6. Bekräfta smälta-kurvan uppgifter genom att lösa förstärks produkter på en 1% agarosgel.
          1. Bered en 1% agarosgel (för en 100 ml volym)
            1. Väg upp 1 g av agaros i en kolv.
            2. Tillsätt 100 ml 1X tris-acetat EDTA (TAE)-buffert och mikrovågsugn tills agaros upplöses och lösningen är klar.
              1. 1 L 50x TAE buffert består av 2 M Tris bas, 57 ml isättika och 0,05 M EDTA (pH 8,0).
              2. Späd TAE buffert till 1x med destillerat vatten (slutkoncentrationer: 40 mM Tris-acetat och 1,0 mM EDTA).
            3. Låt gelen svalna till 55 ° C innan du lägger etidiumbromid till en koncentration av 0,5 mikrogram / ml.
            4. Häll gelen i gjutning facket och låt den stelna i rumstemperatur.
          2. För att köra, placera gel elektrofores kammare fylld med 1x TAE, kombinera 10 mikroliter av provet från qPCR plattan med 2 mikroliter av 6x laddningsfärg, blanda väl och lägg i brunnar tillsammans med en molekylvikt stege.
          3. Elektrofores på 50-150 volt tills värdena har migrerat ett lämpligt avstånd, beroende på den förväntade storleken på din cDNA produkt.
          4. Visualisera med en UV-transilluminator.
          5. Kontrollera att det förstärkta PCR-produkten är av lämplig storlek för ditt mål.
          6. Primer dimerer kommer att vara runt 50 bp.
    2. Pre-skärm för ökad TNF-α.
      1. Eftersom TNF-α initierar inflammation reaktioner i periferin, misstänker vi att detta gäller också för hjärnan och använda inledande screening för TNF-α mRNA som en markör för den del kulturen immunstatus (dvs, normal, bluff, och experimentella grupper) innan du fortsätter till full PCR rad analyser.
      2. Om normala och falsk kontroll TNF-α nivåer mRNA inte ligger inom ett interassay utbud som finns inom vårt laboratorium, experiment (dvs, normal, bluff, och experimentella grupper) tas bort och inte gå vidare till hela PCR rad analyser.
      3. iScript cDNA syntes.
        1. För varje RNA prov, kombinera följande i en PCR-rör: 4 mikroliter 5x reaktionsblandningen, 1 mikroliter omvänt transkriptas, 25 ng RNA, och RF H ​​2 O till en slutlig volym av 20 mikroliter.
        2. Blanda försiktigt genom att pipettera och spinn ner en kort stund.
        3. Inkubera: 25 ° C, 5 min, 42 ° C, 30 min, 85 ° C, 5 min.
        4. Späd 1:04 (lägg till 60 mikroliter RNas fritt vatten).
        5. Förvara vid -20 ° C eller hålla på is tills det ska användas inom några timmar.
      4. qPCR att TNF-α.
        1. Förbered en master mix för varje primer par.
          1. Kombinera 12,5 mikroliter iQ SYBR grön, 1 mikroliter primermix och 10,5 mikroliter vatten per prov.
          2. För både vår Rpl13a och TNF-α primer är 200 Nm den optimala koncentrationen.
          3. Justera mängden av primers och volym odåga som nödvändigt i ett 1,5 ml RF mikrocentrifugrör och hålla på is medan du ställer in plattan.
        2. Inrätta ett qPCR tallrik med kontroller / Shams / experimentals. Använd 1 ìl av cDNA per prov i duplikat för varje gen.
        3. Tillsätt 24 mikroliter av din Master Mix till varje brunn och pipettera upp och ner för att blanda.
        4. Var mycket noga med att undvika bubblor, eftersom de stör fluorescens avläsningar.
        5. Kör 40 cykler av PCR-amplifiering:
          1. 95 ° C, 8.5min;
          2. 40 cykler: 95 ° C, 10 sek, 60 ° C, 30 sek, 72 ° C, 20 sek / cykel.
          3. Smält kurva: 55 ° C, 1 min, 80 cykler av 0,5 ° C steg i 10 sekunder vardera med början vid 55 ° C.
      5. Analysera data (ΔΔCt metod;. Figur 4). 13
  6. cDNA syntes för PCR arrayer.
    1. Beräkna volymen (mikroliter) av varje prov som har 250 ng av RNA.
      1. Välj en mängd RNA (100 ng till 1 mikrogram) som du kan konsekvent utdrag ur dina prover.
    2. RT 2 First Strand Kit - enligt tillverkarens anvisningar. Kortfattat:
      1. Tina och spinn ner alla reagenser.
      2. För varje RNA prov, kombinera följande i en PCR-rör:
        1. 250 ng av RNA, 2 mikroliter av 5x arvsmassans DNA (gDNA) eliminering buffert och vatten till en slutlig volym av 10 mikroliter.
      3. Blanda försiktigt genom att pipettera och spinn ner en kort stund.
      4. Inkubera vid 42 ° C i 5 min.
      5. Chill på is i 1 min.
      6. Under tiden, förbereda omvänd transkription (RT) cocktail (per prov):
        1. Kombinera 4 mikroliter av 5x RT buffert 3, 1 mikroliter primer och extern kontroll mix, 1 mikroliter RT enzym mix 3, och 3 mikroliter vatten.
      7. Tillsätt 10 mikroliter av RT cocktail varje prov och blanda försiktigt.
      8. Inkubera vid 42 ° C i 15 min.
      9. Stoppa reaktionen genom att inkubera vid 95 ° C i 5 min.
      10. Tillsätt 91 mikroliter av RF H ​​2 O till var 20 mikroliter cDNA syntes reaktion (späd till en slutlig volym på 111 mikroliter).
      11. Blanda väl genom att pipettera.
      12. Förvara vid -20 ° C eller hålla på is tills det ska användas inom några timmar.
  7. RT 2 Profiler PCR-array.
    1. Följande instruktioner följer de av tillverkaren och är återigen här för bekvämlighet.
    2. Förbered reagenser
      1. Tina och spinn ner alla reagenser.
      2. Förbered experimentell cocktail:
        1. Kombinera 1350 ìl 2x SABiosciences RT 2 qPCR SYBR Grön Master Mix, 102 mikroliter av utspädd cDNA och 1248 mikroliter av RF H ​​2 O till en slutlig volym av 2700 mikroliter.
      3. Ta försiktigt bort PCR-uppsättning från förseglade påsen.
      4. Fördela cocktail i en lastning reservoar.
      5. Tillsätt 25 mikroliter till varje brunn med en flerkanalig pipett.
      6. Täta omsorgsfullt PCR-uppsättning tallrik.
      7. Centrifugera plattan vid 10.000 rpm i 1 minut vid rumstemperatur.
      8. Placera på is tills PCR-programmet är klart.
    3. Kör lämplig cykel för din maskin.
      1. iCycler:
        1. 95 ° C, 10 min
        2. 40 cykler: 95 ° C, 15 sek, 60 ° C, 1 min.
        3. Smält kurva: 55 ° C, 1 min, 80 cykler av 0,5 ° C steg i 10 sekunder vardera med början vid 55 ° C
    4. Analysera data.
      1. Välj "Auto Beräknat" för baseline cykler.
      2. Välj "Användardefinierad" för tröskeln möjlighet att manuellt ställa tröskelvärdet.
        1. I "loggen", som gräns i den nedre en tredjedel av linjär fas av förstärkningen tomten.
        2. Var noga med att hålla tröskelvärde samma över hela körs.
      3. Exportera data.
      4. Ingång i en Excel-fil.
      5. Ladda upp till SABiosciences PCR Array dataanalys.
        1. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php
        2. Välj referens gener - vi använde Rpl13a.
      6. Vår praxis är att:
        1. Bekräfta resultat med åtminstone en dubblett av PCR-array.
        2. 3-faldig rad förändringar behöver inte bekräftats vid senare specifikt mål PCR-amplifiering. 6,7
        3. Mindre än 3-faldig förändringar bör bekräftas genom efterföljande specifikt mål PCR-amplifiering eller användning av 2-3 PCR-kedjor (för att bekräfta 2x förändringar.
    5. DNA pre-amplifiering används för att analysera målen med förväntade ultralåg uttryck (bild 6).
      1. SABiosciences är RT 2 Nano PREAMP cDNA syntes kit och blandar primer är avsedda för pre-amplifiering av RNA att tillåta användning av små mängder (1-100 ng) av provet RNA att köra en fullständig PCR-array.
      2. Varje primermix möjliggör förstärkning av 89 genspecifika cDNA mål mallar med minimal bias. Vi har använt detta system som ett sätt att förstärka låga signaler som IFN-λ till en spårbar nivå.
      3. RT 2 Nano PREAMP cDNA syntes kit - enligt tillverkarens anvisningar. Kortfattat:
        1. Tina och spinn ner alla reagenser.
        2. För varje RNA prov, kombinera följande i en PCR-rör.
          1. 1-100 ng av RNA, 2 mikroliter av 5x gDNA eliminering buffert och vatten till en slutlig volym av 10 mikroliter.
        3. Blanda försiktigt genom att pipettera och spinn ner en kort stund.
        4. Inkubera vid 42 ° C i 5 min.
        5. Chill på is i 1 min. Under tiden förbereder RT cocktail (per prov).
          1. Kombinera 4 mikroliter av 5x RT buffert 3, 1 mikroliter primer och extern kontroll mix, 1 mikroliter cDNA enzym syntes mix, 1 mikroliter RNase hämmare och 3 mikroliter vatten.
        6. Tillsätt 10 mikroliter av RT cocktail varje prov och blanda försiktigt.
        7. Inkubera vid 42 ° C i 15 min.
        8. Stoppa reaktionen genom att inkubera vid 95 ° C i 5 min.
        9. Förvara vid -20 ° C eller hålla på is tills det ska användas.
      4. cDNA förstärkning med specifika primers.
        1. Blanda följande i en PCR-rör:
          1. 12,5 mikroliter PCR Master Mix, 7,5 mikroliter specifika primers och 5 mikroliter av outspädd cDNA.
        2. Kör 12 cykler av PCR-amplifiering.
          1. 95 ° C, 10 min.
          2. 12 cykler: 95 ° C, 15 sek, 60 ° C, 2 min.
          3. Håll vid 4 ° C.
        3. Tillsätt 2 mikroliter reducering sida reaktion på varje prov.
        4. Inkubera vid 37 ° C i 15 min.
        5. Stoppa reaktionen genom att inkubera vid 95 ° C i 5 min.
        6. Tillsätt 84 mikroliter RF vatten till varje 27 mikroliter cDNA amplifieringsreaktionen.
      5. Förvara vid -20 ° C eller hålla på is tills det ska användas inom några timmar.
      6. Förstärk enskilda genen mål med hjälp av SAB primers och SYBR gröna Master Mix som beskrivs ovan.

4. Multiplexade fosfoprotein Analyser av cytokin Signaling

  1. Mutliplexed fosfoprotein analyser används för att definiera cytokin ligand-receptor nedströms signalering (bild 7).
  2. Bestäm mängden totalt protein i slice kulturer.
    1. Harvest skiva kulturer genom att försiktigt lyfta skivor ut av skär och lägg i 1 ml kallt (4 ° C) PBS.
    2. Centrifugrör i 30 sekunder och ta bort PBS. Placera på torr-is till färdigt skörd.
    3. Förvaras vid -80 ° C.
  3. Homogenisera slice kulturer totalprotein analysen.
    1. Förbered buffert cellslys enligt tillverkarens anvisningar.
      1. Lägg proteashämmare till en total volym av buffert som behövs för att placera minst 200 mikroliter av lyseringsbuffert på varje skiva kultur.
        1. Till exempel: lägg till 20 mikroliter av faktor 1, 10 mikroliter av faktor 2 och 20 l 500 mm PMSF i DMSO till 4,95 ml cellslys buffert.
    2. Tina slice kulturer i 200 mikroliter lyseringsbuffert på is.
    3. Sonikera slice kulturer fem gånger i 1 sekund pulser och omedelbart tillbaka på isen.
    4. Vortex prover för 10 sek.
    5. Centrifugera proverna vid 4 ° C i 15 min vid 13.000 rpm.
    6. Överför supernatanten till ett rent rör och hålla på is.
  4. Genomför totalt protein analys.
    1. Förbered protein standarder.
      1. Bered lager bovint serumalbumin (BSA) enligt tillverkarens anvisningar.
      2. Förbered standarder som sträcker sig från 0 till 1000 mikrogram / ml spädas med hög renhet vatten BCA protein analys.
    2. Beräkna volymen av att arbeta reagens som behövs utifrån antalet prover och replikat.
      1. Till exempel: (8 standarder + 18 okända prover) x (2 replikat per prov) x (0,2 ml arbetar reagens som behövs per brunn) = 10,4 ml totala volymen som behövs för att alla prover som lastas på mikroplattan.
        1. Runda upp till 12 ml volym för att säkerställa tillräckligt med volym.
      2. Vid blandning Reagens A med Reagens B för att arbeta reagens kan vissa grumlighet förekomma, men bör försvinna inom kort.
    3. Belastning 10 mikroliter av prover och standarder per brunn.
    4. Belastning 0,2 ml arbetar reagens i brunnar.
    5. Täck plattan med isoleringstejp och skaka i 30 sekunder för att blanda.
    6. Inkubera plattan vid 37 ° C i 30 min.
      1. Cool platta till rumstemperatur (ca 10 min) innan behandlingen om en plattläsaren vid 595 nm våglängd.
    7. Konstruera en kalibreringskurva med hjälp av Microsoft Excel med uppmätta absorbansen mot förväntade koncentrationen.
      1. En bra korrelationskoefficienten är lika med eller större än 0,98.
    8. Beräkna protein halterna i prover med den linjära ekvationen kommer från standardkurvan.
    9. Späd prover i lyseringsbuffert till lika mängder protein och förvara vid -80 ° C tills för vidare bearbetning.
    10. Protein koncentrationen vara 200 till 900 mikrogram / ml enligt tillverkarens anvisningar.
  5. Utför Multiplex analys.
    1. Obs: multiplexade fosfoprotein analyser ta 2 dagar totalt att slutföra, med 1 timmes första uppsättning och lastning av plåt följt av en övernattning incubation steg och ytterligare inkubation och tvätta steg följande dag.
    2. Karta reda på vilka brunnar kommer att innehålla, som lysat enligt kalkylblad i manualen.
    3. Tina homogeniserad vävnadsprover och lysates kitet vid rumstemperatur och placera sedan på is. Låt alla buffertar och reagens som anges i kitet till rumstemperatur (utom streptavidin och pärlor).
    4. Förbered pärlor för multiplex analys.
      1. Täck rören med tillsammans pärlor med aluminiumfolie för att skydda mot ljus. Vortexrör i 5 sek och håller på is.
      2. Späd tillsammans pärlor 1:50 i tvättbuffert.
        1. Varje brunn skall innehålla 1 mikroliter av kopplat pärlor i 49 mikroliter tvättbuffert för en total volym av 50 mikroliter per brunn.
    5. Kalibrera sugapparater.
      1. Tvätta plattan med 100 mikroliter tvättbuffert per brunn.
      2. Slå på vakuum och sug bort överflödig vätska inom 2-5 sek.
        1. Om fullständig borttagning av buffert tar längre eller kortare än 2-5 sekunder, justera trycket ventil därefter.
        2. Torka undersidan av plattan ordentligt innan du lägger prover.
    6. Vortex det utspädda kopplad pärlor i 5 sek och tillsätt 50 mikroliter till angivna brunnar.
      1. Omedelbart vakuumfilter och torr botten av plattan med en pappershandduk.
    7. Tvätta plattan två gånger med 100 mikroliter tvättbuffert per brunn. Torka undersidan av plattan efter varje tvätt.
    8. Vortex upptinade prover för 3 sek och tillsätt 50 mikroliter till angivna brunnar. Placera förseglingstejpen över plattan och inkubera i 15-18 timmar skaka vid 300 rpm vid rumstemperatur, skyddat för ljus.
    9. Vakuumfilter överflödig vätska och tvätta plattan tre gånger med 100 mikroliter tvättbuffert. Torka undersidan av plattan efter varje tvätt.
    10. Späd 1:25 detektionsantikropp i tvättbuffert.
      1. Varje brunn kräver 1 mikroliter detektionsantikropp i en total volym av 25 mikroliter tvättbuffert.
    11. Placera förseglingstejpen på tallriken och skydda den mot ljus med aluminiumfolie. Skaka om 30 sek, gradvis ökar hastigheten till 1100 rpm. Fortsätt att skaka vid 300 rpm i 30 min i rumstemperatur.
    12. Vakuumfilter plattan och tvätta tre gånger med 100 mikroliter tvättbuffert. Torka undersidan av plattan efter varje tvätt.
    13. Samtidigt skydda plåten från ljus, förbered en 1:100 utspädning av streptavidin-PE med tillräcklig volym för att lägga till 50 mikroliter per brunn. Skydda lösningen från ljus.
    14. Vortex noggrant och tillsätt 50 mikroliter utspätt streptavidin-PE per brunn. Inkubera med skakning vid 1100 rpm i 30 sekunder följt av 10 min vid 300 rpm.
      1. Vakuumfilter överflödig buffert av.
      2. Tvätta plattan tre gånger med 100 mikroliter resuspension buffert per brunn.
      3. Torka undersidan av plattan noggrant efter varje tvätt.
    15. Tillsätt 125 mikroliter resuspension buffert till varje brunn och skaka i 30 sekunder vid 1100 rpm.
    16. Omedelbart läsa plåt eller förvara vid 4 ° C borta från ljus upp till 24 timmar.

5. Efterlikna och modulering av cytokin Signaling

  1. Rekombinanta proteiner cytokin (med bärare) används för att efterlikna förändringar av SD.
    1. Frystorkat proteiner (t.ex. TNF-α) lagras i upp till 1 år vid -20 ° C.
    2. Efter spädning till en stamlösning med 0,1% bovint serumalbumin, alikvoter bereds, förvaras vid -20 ° C tills den ska användas inom 3 månader.
    3. Varje manipulationer för att skära kulturer uppdateras minst var tredje dag.
  2. Cytokin signalering tystas av:
    1. Användning av traditionella cytokin signalering kaskad farmakologiska agenter;
    2. Användning av lösliga ligand antagonist [t.ex. löslig TNF receptor 1 (som beskrivs ovan för rekombinant ligander)], eller
    3. Geners uttryck [dvs små störande RNA (siRNA)].
  3. Tillförsel av siRNA till neuronala celler är ofta problematisk.
    1. Vanliga lipid-baserat reagenser brukar resultera i lågt transfektion effektivitet och förlust av cellernas livskraft.
    2. Istället använder vi Thermo Scientifics Dharmacon Accell siRNA, som möjliggör hög effektivitet ÖVERVÄLDIGANDE utan användning av en transfektion reagens.
    3. Här visar vi ÖVERVÄLDIGANDE av cyklofilin B, en icke-väsentliga proteinet uttrycks i alla celltyper, som bekräftelse på att använda denna metod i slice kulturer.
    4. Leverans protokoll var anpassad för slice kulturer från tillverkarens instruktioner för användning i anhängare celler.
      1. Späd 5x siRNA buffert till 1x med RNas fritt vatten.
      2. Förbered en 100μM siRNA lösning i 1x buffert
        1. Cyklofilin B siRNA tillhandahålls på 5 nmol. Resuspendera i 50 mikroliter av 1x buffert för en 100 mikroM lager.
      3. Blanda siRNA med Accell leverans medium till en slutlig koncentration av 1μM siRNA.
        1. Tillsätt 11 mikroliter av 100 mikroM lager siRNA till 1100 ìl Accell leverans medium i en 6-brunnar.
        2. Placera i inkubatorn och låt temperaturen stabilisera sig till det normala inkubation under minst 20 min.
      4. Med hjälp av en BSL-2 huva och steril teknik, överföring sättas i leveransen mixen innehåller brunnar.
        1. Inkubera med leverans mix för 96 timmar för protein knockdown.
          1. Bedöm protein ÖVERVÄLDIGANDE med Western blot eller intensifierade immunfärgning.
          2. Western blotting, medan en potentiell första val för ÖVERVÄLDIGANDE effektivitet, kan vara för okänslig för lågaktivt immun signalering i samband med det icke-skadevållande fenomenet SD.
          3. Därför har vi följt negativa Western blot-mätningar med silver förbättrade Diaminobenzidin (DAB) immunfärgning och datorbaserade mätningar densitometri (se nedan).

6. Proteomik Bekräftelser

  1. Cell specificitet fosfoprotein förändringar görs via immunfärgning. 6,7
    1. Fix slice kulturer i 24 timmar med PLP fixativ som består av:
      1. 10 ml 16% paraformaldehyd, 1,096 g lysin, 0,42 g natriumfosfat, och 0,17 g natrium periodate, fylld till en total volym på 80 ml med ultrarent vatten (fixativ är 6,2 pH).
      2. Efter 24 timmar, försiktigt bort skiva kulturer från skär med en fin pensel och överföring till PBS som innehåller natriumazid (100 mg / L) tills den ska avsnitt.
      3. Då, inkubera skivor minst 24 timmar i PBS-20% sackaros, skär hel skiva kulturer till 20 m sektioner och montera till gel belagda bilder.
      4. Fluorescerande immunfärgning (t.ex. för NFκB) sker enligt följande med alla steg kopplat till skakningar vid ~ 50 rpm.
        1. Tvätta skiva kulturer i 3 mL PBS tre gånger i 10 min.
          1. Placera objektglasen med monterad 20 ìm slice kulturer Coplin burkar med ~ 40 mL PBS för alla tvätta steg.
        2. Tvätta skiva kulturer i PBS tre gånger, 10 min per tvätt.
        3. Placera några droppar SFX signal förstärkare på skivdel kulturer och inkubera i en fuktkammare i 30 min.
        4. Inkubera slice kulturer i 2 timmar vid 37 ° C med kanin anti-NFκβ antikroppar vid 1:100 spädas med 0,75% Triton X-100 i PBS.
          1. Pipettera antikropp lösning direkt på skivor.
        5. Ta bort skivor från antikroppar lösningen och tvätta tre gånger i PBS i 10 min per tvätt.
        6. Inkubera skivor i rumstemperatur i en timme i get-anti-kanin AlexaFluor 594 antikroppar vid 1:50 i 0,75% Triton X-100 i PBS.
          1. Centrifugera AlexaFluor 594 antikropp i 15 min vid 10.000 rpm för att ta bort eventuell fällning som kan ha bildats i lösning.
        7. Tvätta tre gånger i PBS, 10 min per tvätt.
        8. Doppa objektglasen i destillerat vatten för att skölja bort eventuella salter från PBS.
        9. Täck med Förläng antifade medelstora och låt torka i minst 2 timmar, täckt från ljus.
        10. Visualisera med traditionella eller konfokala (bild 7) fluorescensmikroskopi.
  2. Protein produktionen ändras från siRNA ÖVERVÄLDIGANDE kan finkänsligt bedömas genom att förbättra traditionella DAB immunfärgning 7 via silver intensifiering 16 och efterföljande densitometriska kvantifiering (t.ex. som här för cyklofilin B) (Video Figur 2).
    1. Immunfärgning för cyklofilin B följer standardprocedurer för ljusa fält avbildning vi nyligen detaljerad, 7 med hjälp av:
      1. Anti-mus cyklofilin B (1:100) i 24 timmar vid 4 ° C;
      2. Följt av pepparrotsperoxidas sekundär antikropp märkning (1:100);
      3. Och DAB visualisering.
    2. f DAB reaktionerna är för svag för att möjliggöra digitala densitometriska quantification17, de kan intensifieras med en differentierad silver förfarande enligt Quinn och Graybiel. 16
      1. Rehydrera diabilder och sedan tvätta x 3 i 10 minuter i hög renhet vatten.
      2. Placera objektglasen i hög renhet vatten i en Coplin burk och värm till 56 ° C.
      3. Förbered ammoniak silvernitrat (0,5%):
        1. Stock ammoniumklorid (25-30%) är färsk utspädd (1:1) med hög renhet vatten.
        2. Lägg ammoniumhydroxid (~ 500-600 mikroliter per 100 ml) droppe för droppe under omrörning till 0,5% silvernitratlösningen som i korthet blir grumlig och då tydliga.
        3. Värm lösningen till 56 ° C.
        4. Inkubera sektioner för 10-12 min.
      4. Tvätta diabilder i 15 sek i hög renhet vatten (denna och alla efterföljande steg ska utföras vid rumstemperatur med hjälp Coplin burkar).
      5. Doppa objektglasen i 15 sekunder i 1% natriumtiosulfat (pentahydrat).
      6. Doppa objektglasen 15 sek i hög renhet vatten.
      7. Tone bilderna i 2 min i 0,2% guld klorid.
      8. Doppa dem i hög renhet vatten i 15 sek.
      9. Exponera bilderna till 0,5% oxalsyra i 2 min.
      10. Doppa dem i 15 sek i hög renhet vatten.
      11. Behandla bilderna i 5 minuter i 5% natriumtiosulfat.
      12. Tvätta objektglasen noggrant i hög renhet vatten, torka och täckglas.
      13. Diabilder är nu redo för densitometriska kvantifiering. 17
        1. All utrustning, inklusive ljusa fält belysning är påslagen i minst 20 minuter innan avbildning.
        2. Hela skiva kultur avsnitten är avbildade på 5-10x på ett inverterat mikroskop.
        3. Ljusintensiteten är inställd på en enhetlig nivå (t.ex. ~ 2,6 V) och ändras inte i hela bilden förvärv.
          1. Neutrala täthetsfilter används som krävs för att minska hela bilden ljus intensitet till ~ 1500 på en 12-bitars skala (0-4095) där "0" är helt svart och 4095 är helt vit.
        4. Digitala bilder är sedan förvärvade och lagras elektroniskt för alla (dvs bluff kontroll och experimentella prov), inklusive en bakgrundsbild som utvunnits ur ett område i bilden utan att sektionerna bit kultur.
        5. Bakgrundsbilden subtraheras från alla bilder (bluff och experimentella) och ett område av intresse (AOI) dras runt varje skiva kultur och ljus intensitet registreras.
        6. Bild intensiteten är inställt på en konstant sortiment för alla experiment.
        7. För tydlighetens skull uttrycks resultatet som en relativ densitet jämfört med kontroll nivåer (bild 8).

7. Representativa resultat:

Figur 1
Figur 1. Skiva kultur elektrofysiologiska inspelning paradigm. Inspelning mikroelektrod är först placeras i CA3 pyramidala neuron lager och sedan en bipolär stimulerande elektrod placeras i dentate gyrus (GD).

Figur 2
Figur 2. CA3 framkallade fält potentialer och synaptically inducerad sprida depression. (A) Experiment börja med fastställandet av den ström som erfordras för att maximera standard CA3 området fältet potentiella svar och därefter halv-maximal intensitet används för att framkalla CA3 område framkallade fält potentialer. Detta dokumenterar normalitet av evoked synaptiska svaren mellan preparat. Om en skiva är fältet excitatoriska postsynaptiska potentialer inte är minst 3 mV, är skivor kasseras. Bestäms (höger, långsamma reaktioner) medan samtidigt fältet potentials (till vänster (B) Nästa, trans-synaptically framkallat tröskel för spridning av depression , snabbt svar) används för att dokumentera att förberedelserna är friska nog att följa 10 Hz stimulering (t.ex. amplituder av vertikala avvikelser i snabb potentiella poster liknande).

Figur 3
Figur 3. Microglial rörelse associerad med minskad synaptisk aktivitet. Erfarenheten visar att microglial grenar skjuta ut och dra med ökad synaptisk aktivitet, men långväga rörelse av dessa celler som svar på synaptisk aktivitet har inte beskrivits i oskadad hjärna. Våra resultat med fluorescerande isolectin B4 märkning av mikroglia visar att en bråkdel av dessa celler förflytta sig långa sträckor under normala förhållanden. Dessutom är många av dessa reser mikroglia betydligt större när synaptisk aktivitet avskaffas genom kulturen exponering för tetrodotoxin som visas i det bifogade bilden. Röda linjer markerar vägar åkte mikroglia över en period på 6 timmar med blå pilar markerar ursprung några exemplariska mikroglia. Kalibrering Bar, 50 ìm.

Figur 4
Figur 4. PCR-screening. (A) Vi använder TRIzol tillsammans med Qiagen kit för RNA isolering eftersom det i våra händer, detta resulterar i betydligt högre (P <0,001; t-test). RNA avkastningen från hippocampus slice kulturer än användning av Qiagen kit ensam (B) I Dessutom bekräftar vi regelbundet att våra RNA-extraktion producera högkvalitativa intakt RNA som bestäms genom en gel som visar skarpa RNA band. (C) Vi använder NormFinder programvara för att välja en referens gen med en bästa stabilitet värde. Till exempel, skiva kulturer utsättstill lipopolyssacharide (100 ng / ml för 2 timmar) analyserades för tre referens gener (Rpl13a, β-aktin, 18 år). Ct-värden används för att beräkna en stabilitet värde. Våra data här [och att för andra försök med att sprida depression (data visas inte)] visar att Rpl13a är en optimal referens gen. (D) Vi använder "ΔΔCt"-metoden som en känslig och reproducerbar medel för att upptäcka fold-change RNA skillnader mellan experimentella grupper och bluff kontroller.

Figur 5
Figur 5. PCR-reaktion kontroller. (A) Vi mäter förstärkningar utspädning kurva för primers som ett sätt att kontrollera kvaliteten på PCR-reaktioner. Till exempel optimal förstärkningar visar en jämn (1-5) ökade Ct trösklar. (B) Däremot förstärkningar inte är enhetlig med dålig primers (1-5). (C) Dessutom utför vi en smälta kurva vid ingående av PCR-analyser för att bekräfta att önskad amplicons detekteras (dvs en enkel topp kurva), vilket tyder på avsaknad av dubbelsträngat DNA med primern dimerer, kontaminerande DNA och misannealed PCR-produkt (som tycks som flera topp kurvor).

Figur 6
Figur 6. Nano pre-amplifiering tillåter detektion av IFN-λ i hippocampus slice kulturer. Eftersom endast ~ är 50 T-celler som finns i en bit kultur (av ~ 55,000-90,000 totala celler), använde vi RT 2 nano PREAMP cDNA syntes Kit ett sätt att upptäcka potentiella extremt låg nivå uttrycket av IFN-λ. Detta innebär att av cDNA Förförstärkning gav en 12-faldig ökning av känsligheten för RNA-nivåer. Resultaten ovan visar förmåga Förförstärkning att öka känslighet. Ct tröskeln för referens gen Rpl13a var 20,5 med inledande förstärkning och denna ökades till 14,1 med användning av förstärkarnivåer kit, en 12-faldig ökning motsvarande 12 cykler av PCR-amplifiering av cDNA. Parallellt med detta, IFN-λ inte detekterbara (0,0) men var väl inom detektionsområde (29,0) med Förförstärkning.

Figur 7
Figur 7. Innate cytokin väg fosfoprotein fosforylering förändringar. (A) Exemplarisk effekt av TNF-α förbehandling (dvs neuroprotektion) på medfödda cytokin väg fosfoprotein fosforylering 24 timmar efter excitotoxic skada i hippocampus slice kulturer. Resultaten visar CA1 området växlar mellan skivorna förbehandlas i 3 dagar med 100 ng / mL TNF-α före exponering till N-metyl-D-aspartat (NMDA) jämfört med dem som utsätts för NMDA ensam (dvs experimentell vs bluff) uttryckt som en procent. Observera att TNF-α inducerade ett ihållande fosforylering ökning JNK och ATF-2 samt en övergående ökning NFκB. (B) geografiska spridning NFκB aktivering (dvs närvaron av fosforyleras NFκB i kärnan) avslöjas genom immunfärgning ( röd). YoYo fläckar kärnor grönt i ett stycke kultur avsnitt [t.ex. i astrocyter (pilspets)]. Pyramidal nervceller, som annars verkar också grönt, i stället gula på grund av samtidig märkning med fosforylerat NFκB (röd). Kalibrering Bar, 25 ìm.

Figur 8
Figur 8. . Proteomik bekräftelse av siRNA effektivitet Differentierade silver intensifiering av peroxidas-Diaminobenzidin baserade immunfärgning för cyklofilin B visar att siRNA signifikant kan (P <0,001; ANOVA-Holm-Sidak metod) minska de globala hippocampus skiva cyklofilin B uttrycket 3 dagar efter applicering på 200, 500 eller 1000 nM siRNA.

Discussion

SD är ett paroxysmal störning av hjärnans vars egenskaper starkt konservativa i alla arter och områden i hjärnan undersöks hittills. SD är ofta studeras i neocortex. Men den neurala kretsen komplexiteten i denna struktur (jämfört med hippocampus), samt oförmåga att hålla neocortex vid liv in vitro med inaktiv immunförsvaret för utdragna perioder, gör den mindre användbar som en in vitro förberedelse för att definiera långsiktiga konsekvenserna SD känslighet. Däremot är hippocampus inte bara hjärnans struktur som är mest känsliga för SD, det är också en archicortical struktur med ett enklare neurala kretsen struktur och funktion, som lämpar sig väl för att definiera neuroimmune vilket sätt neural aktivitet kan modulera SD känslighet .

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NS-19.108), National Institute of Child Health and Disease (PO1-HD09402), migrän Research Foundation och Vita stiftelsen. Ms Marcia P. Kraig bistod vid utarbetandet och underhållet av kultur-system.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010
Earle's Balanced Salt Solution Sigma E2888
Horse Serum Invitrogen 26050-088
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
Fungizone Invitrogen 15295
D-glucose Sigma G8769

Table 1. Culture Preparation and Maintenance: Horse Serum Medium
Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Invitrogen 21103
Gem-21 Neuroplex Gemini Bioproducts 400-160-010
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
D-glucose Sigma G8769
Ascorbic acid Sigma A4544
Fungizone Invitrogen 15295
Sodium chloride Sigma S6546
Magnesium chloride Sigma M1028
Calcium chloride Sigma 21115

Table 2. Culture Preparation and Maintenance: Serum-free Medium
Name Company Catalog Number Comments
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) Thermo Fisher PICM0-3050
6-well Falcon culture dishes Thermo Fisher 08-772-1B
Sytox Green Invitrogen S7020

Table 3. Materials fabrication: Ground Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary tubes A-M Systems, Inc. 2mm x 1.16mm, 4 inches
KCl Sigma P5405
Agar Fisher Scientific A360
EDTA Sigma 5134
Tubing Masterflex 95809-34
1.5 mL centrifuge tube rack Fisher Scientific
Silver wire Medwire AG15X
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
Emery board Walgreens
Scintillation vial Fisher Scientific
Flexible adhesive sealant Amazing Goop
Bleach Clorox

Table 4. Materials fabrication: Ground Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Borosilicate filament Sutter Instruments BF150-86-10 1.5 x 0.86 mm
Micr–lectrode puller Narashige PE-2
Eye piece optical micrometer Zeiss
Stage optical micrometer Zeiss
Compound Microscope Zeiss
Microscope slides Surgipath 00210
1-Dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MO-10
3-dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MM-3
Adhesive putty Scotch
100 mm Nalgene containers Fisher Scientific

Table 5. Materials fabrication: Recording Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Teflon-coated platinum iridium wire A-M Systems 7780 125 μm bare, 200 μm coated
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
30 gauge wire Tensolite
Soldering iron Cooper Tools UTC 100
Solder Bernzomatic Resin core, lead free, silver bearing
Concentrated HCl Fisher Scientific A144-212
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-30
Water-resistant epoxy JB Weld
Banana jacks Newark Electronics

Table 6. Materials fabrication: Stimulating Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Falcon 35 mm culture dish Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Cotton squares Walgreens
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Tubing Masterflex 95809-34
Poly vinyl chloride film Fisher Scientific 01810 18 inches x 1000 feet
#9 single edge razor blade Smith

Table 7. Materials fabrication: Recording Dishes
Name Company Catalog Number Comments
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
pH meter Beckman 250 Battery operated
Mini Type-T thermocouples Physiotemp IT series
DigiSense thermometer Cole-Palmer 8528-10
Inline heater Warner Instruments SH278
Gibraltor table Burleigh
Inverted microscope Leica DMIRE2
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541
Cautery tool Gemini Battery operated
Micr–lectrode micromanipulators Narashige WR60 Left and right
Stabilized power supply MGE UPS systems Ellipse 1200 +/- 5 volts (120 total)
Axoprobe amplifier system Axon instruments 1-A
Active filter Frequency Devices Model 900
Axoscope Digidata Axoscope 1322-A
Axoscope software Axoscope v. 9
Computer systems Dell Precision T5400
Origin8 OriginLab Corp v. 8.1
Stimulator isolation unit Bak Electronics, Inc. BSI-II
1/2 inch position magnets Dexter PMO90-3
3 inch position magnets Dexter PMC-800T
Multiple X-Blocks Narishige X-12 For positioning ball joints
Valves Hamilton HVD-3 For medium delivery
Syringe pump Razel A99
Digital oscilloscope Agilant technologies
Digital camera system Quant EM 512-SC
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Microscope objective focus with Pi foc Physik Instrumente E-662.LR
Smart shutter Lambda SC
Dual wavelength fluorescent microscopy Applied Scientific Instruments Polychrome II
Peristaltic pumps Masterflex 77120-62
Aspirator Harvard Apparatus PDMI component

Table 8. Electrophysiological Setup
Name Company Catalog Number Comments
1 M Magnesium Chloride Sigma 057K8620
1 M Manganese Chloride Sigma 018K6107
1 M Calcium Chloride Sigma GA10984
AlexaFluor594-tagged Isolectin-IB4 Invitrogen I21413
Neurobasal Invitrogen 21103
Polyvinyl chloride film Fisher Scientific 01810
MetaMorph Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DMIRE2
Camera QuantEM 512SC
UV light Kubler CODIX
Bipolar Temperature Controller Medical Systems Corp TC-202
Smart shutter Lambda SC
Sytox Green Invitrogen S7020
Falcon 35 mm culture dishes Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Tubing Masterflex 95809-34
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
Gibraltor table Burleigh
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541

Table 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures
Name Company Catalog Number Comments
RNAlater Ambion AM7021
RNase/DNase-free 1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Diamond knife Fine science tools 10100-00
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
TRIzol Invitrogen 15596-026
Centrifuge Eppendorf 5451C
Vortex-genie VWR G-560

Table 10. PCR Preparation: Slice Culture Harvest
Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Sigma C-2432
Centrifuge Eppendorf 5451C in cold room
Ethanol, 200 proof for molecular biology Sigma E7023
RNeasy Micro kit Qiagen 74004

Table 11. PCR Preparation: RNA Extraction
Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 2000 Thermo Fisher ND-2000
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid Sigma M-1254
ssRNA ladder NEB N032S
Sodium acetate Sigma S-9513
EDTA Sigma E5134
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000

Table 12. PCR Preparation: RNA Quantification
Name Company Catalog Number Comments
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1
iCycler iQ PCR plates, 96 well Bio-Rad 2239441
Flat cap strips - optically clear. 8-cap strip Bio-Rad TCS0803
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8890
iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 170-8880
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
10x TAE buffer GibcoBRL 15558-026
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Name sequence
TNF-α F 5’ - ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3’
TNF-α R 5’ - CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3’
Rpl13a F 5’ - TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3’
Rpl13a R 5’ - CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3’

Table 13. PCR Activities: qPCR primer optimization and pre-screening
Name Company Catalog Number Comments
RT2 Profiler PCR array SABiosciences PARN-021
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis kit SABiosciences C-06
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis primer mix SABiosciences PBR-3021
RT2 SYBR Green/ fluorescein qPCR master mix SABiosciences PA-011
RT2 qPCR Primer Assay for Rat IFN-λ SABiosciences PPR45050C
Multichannel pipettor Corning
25 mL Bio-pure reservoir with divider Diversified biotech REBP-2000
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1

Table 14. qPCR array plates and low level signaling
Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Fisher Scientific Micro 7
Cell lysis kit Bio-Rad 171-304011
BSA protein stock Bio-Rad 500-0007
BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225
Sealing tape Bio-Rad 2239444
96-well plate reader Perkin Elmer 1420-multilabel counter
Phospho 6-plex Assay Lysates Bio-Rad X7000000502
Phospho 6-plex coupled beads Bio-Rad X700000050

Table 15. Multiplex Phosphoprotein Assay
Name Company Catalog Number Comments
Accell 5x siRNA Buffer Thermo Scientific B-002000-UB-100
Accell siRNA Delivery Medium Thermo Scientific B-005000-100
Accell Cyclophilin Pool-Rat Thermo Scientific D-001920-30-05

Table 16. siRNA

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Lysine Sigma L-6001
Sodium phosphate Fisher Scientific S374-1
Sodium periodate Sigma S-1878
Sodium azide Sigma S-2002
Cryostat Leica CM3050 S
Tissue-Tek Ted Pella Inc. 27050
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
Tissue slides Surgipath 00210
Coplin jars Fisher 08-815
Hydrogen peroxide (30%) Sigma H1009
SFX signal enhancer Invitrogen A31631
Goat serum Colorado Serum Company CS 0920
Triton X-100 Sigma T-8787
Anti-NFκβ antibody Santa Cruz SC-109
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012
Yo-yo nuclear counterstain Invitrogen Y-3601
ProLong antifade Invitrogen P7481

Table 17. Proteomic Confirmation Via Immunohistochemistry
Name Company Catalog Number Comments
Anti-cyclophilin B R&D Systems MAB5410
3,3-diaminobenzidine Sigma D8001
Water bath Pharmacia Biotech 56-1165-33 Gebrüder HAAKE GmbH
Ammonium hydroxide J.T.Baker 9721-03
Silver nitrate Sigma S-0139
Sodium thiosulfate (pentahydrate) J.T.Baker 3949-01 &nsp;
0.2% gold chloride Sigma G-4022
Oxalic acid Sigma O-0376
CoolSnap fx CCD camera Photmetrics
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DM IRBE
Neutral density filters Chroma 0.5-3.0 optical density unit range

Table 18. Proteomic Confirmation Via Silver Enhanced Immunohistochemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18 (9), 3416-3425 (1998).
  2. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25 (15), 3952-3961 (2005).
  3. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha. J Neurosci. 28 (47), 12199-12211 (2008).
  4. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11. J Neurochem DOI. , (2010).
  7. Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning. J Vis Exp. (43), (2010).
  8. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17 (1), 26-43 (1997).
  9. Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. Spreading depression sends microglia on Lévy flights. PLoS ONE. 6 (4), (2011).
  10. Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60 (1), 55-64 (1985).
  11. Gubern, C. Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia. BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).
  12. Tian, Y. F. The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR. Acta Anaesthesiol Scand. 51 (2), 158-164 (2007).
  13. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45-e45 (2001).
  14. Bustin, S. A. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  15. Pusic, A. D., Kraig, R. P. Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis. Soc Neurosci abst. , (2010).
  16. Quinn, B., Graybiel, A. M. A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction. J Histochem Cytochem. 44 (1), 71-74 (1996).
  17. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369 (1), 93-108 (1996).

Tags

Neurovetenskap 52 medfödd immunitet hormesis mikroglia T-celler hippocampus skiva kultur genuttryck laser dissektion mikroskopi i realtid qPCR interferon-gamma
Modellering Neurala Immun Signalering av episodiska och kronisk migrän Använda Spridning Depression<em> In Vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y.,… More

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter