Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering Neurale Immune Signalering van episodische en chronische migraine gebruik verspreiden Depressie In Vitro Published: June 13, 2011 doi: 10.3791/2910
* These authors contributed equally

Summary

Migraine en de transformatie tot chronische migraine zijn enorm gezondheidszorg lasten die behoefte hebben aan betere behandelingsmogelijkheden. Wij streven ernaar om te bepalen hoe de neurale immuun signaleren van de gevoeligheid moduleert naar migraine, gemodelleerd

Abstract

Migraine en de transformatie tot chronische migraine zijn gezondheidszorg lasten behoefte hebben aan betere behandelingsmogelijkheden. Wij streven ernaar om te bepalen hoe de neurale immuun signaleren van de gevoeligheid moduleert naar migraine, gemodelleerd in vitro gebruik van het verspreiden van depressie (SD), als een middel om nieuwe therapeutische targets voor de episodische en chronische migraine te ontwikkelen. SD is de waarschijnlijke oorzaak van de migraine aura en migraine pijn. Het is een aanvalsgewijs optredende verlies van neuronale functie in eerste instantie veroorzaakt door verhoogde neuronale activiteit, die langzaam zich voortplant binnen gevoelig gebieden van de hersenen. Normale functioneren van de hersenen is uiterst gevoelig voor, en vertrouwt op, samenvallende low-level immuun signalering. Zo, neurale immune signalerings beïnvloedt waarschijnlijk elektrische activiteit van SD, en dus migraine. Pijnperceptie studies van de SD in hele dieren worden beladen met moeilijkheden, maar ook hele dieren zijn zeer geschikt voor systeembiologie aspecten van migraine te onderzoeken, aangezien SD activeert trigeminus nociceptieve paden. Kan echter hele dierproeven alleen niet worden gebruikt om het ontcijferen van de cellulaire en neurale circuit mechanismen van SD. In plaats daarvan, in-vitro-preparaten waarvoor milieu-omstandigheden kan worden gecontroleerd noodzakelijk zijn. Hier is het belangrijk te erkennen beperkingen van acute plakjes en duidelijke voordelen van de hippocampus slice culturen. Acute hersenen plakjes kan niet onthullen subtiele veranderingen in het immuunsysteem van signaleren, omdat de voorbereiding van de schijfjes alleen triggers: pro-inflammatoire veranderingen die laatste dagen, epileptiforme gedrag te wijten aan hoge niveaus van zuurstof spanning die nodig is om de plakjes vitaliseren, en onomkeerbare celschade op zuurstofloze slice centra.

In tegenstelling, onderzoeken we immuun signalisatie in de volwassen hippocampus slice culturen, omdat de cultuur nauw hun parallel in vivo tegenhanger met volwassen trisynaptic functie; tonen rust astrocyten, microglia en cytokine niveaus, en SD is gemakkelijk geïnduceerd in een unanesthetized voorbereiding. Bovendien zijn de schijfjes hebben een lange levensduur en SD kan worden geïnduceerd op opeenvolgende dagen zonder letsel, waardoor deze voorbereiding het enige middel to-date in staat is het modelleren van de gevolgen van chronische neuro-SD, en dus misschien chronische migraine. We maken gebruik van elektrofysiologische technieken en niet-invasieve beeldvorming tot neuronale cellen en het circuit functies samenvalt met SD te meten. Neurale immuun genexpressie variabelen worden gemeten met qPCR screening, qPCR arrays, en, belangrijker nog, het gebruik van cDNA voorversterking voor de detectie van ultra-low level targets, zoals interferon-gamma met behulp van hele, regionale of specifieke cel verbeterd (via laser dissectie microscopie) bemonstering. Cytokine cascade signalering wordt verder beoordeeld met multiplex fosfoproteïne verwante doelen met gen-expressie en fosfoproteïne veranderingen bevestigd via cel-specifieke immunokleuring. Farmacologische en siRNA strategieën worden gebruikt om na te bootsen en te moduleren SD immuun signalering.

Protocol

Een aantal punten zijn de moeite waard te benadrukken voor een succesvolle studie van immuun gerelateerde SD signalering in hersengebieden die plakjes. Ten eerste moet het initiëren stimuli synchroon depolariseren een voldoende volume van de grijze stof de hersenen op een SD te starten. Dit betekent dat een configuratie-interface (dat wil zeggen, vloeiende blootstelling alleen onder-en gasuitwisseling boven slice cultuur insert) is vereist. 1,2 Ten tweede, acute hersenen plakjes te ondersteunen SD, maar trauma's uit de voorbereiding, evenals het gebruik van 95% zuurstof-beluchte Ringer's oplossing genereren pro-inflammatoire veranderingen en epileptiforme het gedrag van respectievelijk, die neurale circuit functie en immuun homeostase kan veranderen. 3 Ten derde, terwijl de hippocampus slice culturen overwinnen van deze acute slice beperkingen, is het belangrijk op te merken dat slice culturen moeten worden gehandhaafd voor een adequate periode vóór gebruik (dwz, meer dan 10 dagen in vitro), zodat microglia en astrocyten worden stil. 3-5 tot slot, SD moet worden opgewekt met behulp van steriele en aseptische technieken. De technieken die hieronder beschreven zijn ontworpen om aan deze behoefte te voldoen.

1. Het verspreiden van Depressie bij Slice culturen

  1. De bereiding en het onderhoud.
    1. Slice culturen worden voorbereid en onderhouden in de paarden-serum op basis van medium of een serum-vrij medium (SFM) 6,7 zoals eerder beschreven 8 met kleine aanpassingen aan het medium. Incubatie parameters zijn 36 ° C, 5% CO 2, 95% luchtvochtigheid in de balans lucht.
      1. We vinden dat culturen kan worden overgeschakeld naar een SFM na 18 dagen in vitro en in stand gehouden ten minste 35 dagen in vitro door het gebruik van onze eerder gedefinieerde duurzaam bosbeheer dat ook extra calcium en magnesium.
      2. Daarnaast, antibiotica en een antifungicide worden toegevoegd aan besmettelijke besmetting gekoppeld aan meerdere opname episodes te voorkomen.
      3. Deze lange-termijn (of opnemen) medium formulering bevat (per 100 ml): Neurobosal medium, 97 ml, Gem-21, 2,0 ml; Glutamax (200 mm), 0,5 ml; Gentamycine (10 mg / ml), 10 pi; D-glucose (45%), 680 pL, ascorbinezuur (0,5 M), 100 ul, fungizone, (250 mg / ml), 400 pi, NaCl (5,0 M), 820 uL, Mg 2 Cl 2 (1,0 M) , 80 pL, CaCl 2 (1,0 M), 160-240 pi.
      4. Culturen worden gebruikt voor SD 21 tot 35 dagen in vitro.
    2. Vitaliteit verificatie. 3,6,7
      1. Culturen zijn gescreend op het bewijs van piramidale neuron sterfte voor gebruik.
        1. Op 18 dagen in vitro, zijn inserts geïncubeerd gedurende 20 min in medium (onder normale omstandigheden incubatie) met 5 uM Sytox Green, een marker die overgaat in fluorescerend wanneer het bindt aan DNA (dat wil zeggen, door binnen te dringen in de dode cellen).
        2. Inserts worden vervolgens weer overgebracht naar hun vorige medium en onderzocht met fluorescentie microscopie (504 excitatie en 523 emissie) voor het bewijs van CA3 of CA1 pyramidale neuron laag letsel.
          1. Schijfjes met meer dan 20 cellen of een gestandaardiseerd niveau van de fluorescentie van meer dan 250 IE werden uitgesloten van verder gebruik.
  2. Materialen fabricage.
    1. Massa-elektroden zijn gemaakt van glazen buisjes (2,0 mm OD / 1,16 mm ID) snijden tot 4,5 mm lengte en een korte brand gepolijst aan beide uiteinden.
      1. We maken ongeveer 20 elektroden in een tijd, die langer dan een jaar.
      2. Breng 100 ml 1 M KCl aan de kook en voeg onder roeren 3,5 g agar en 0,5 g EDTA (ethyleendiaminetetra zuur dinatriumzoutdihydraat) op een heldere gele oplossing te produceren.
      3. Gebruik een korte lengte van de flexibele slang aangebracht over elke glazen buis warm KCl / agar-oplossing te trekken in de glazen buizen en een korte afstand in de flexibele slang.
        1. Laat zuig-en laat de KCl / agar om langzaam te druppelen uit de open uiteinde van een glazen buis, houd dan de open glazen buis tip tegen een stuk ijs.
        2. De laatste manoeuvre vraagt ​​de agar aan gel bij de elektrode tip en geen gel na het terugwijkende back-up in de glazen buis.
      4. Zodra de agar heeft gegeleerde in de koud stromend water, kan de flexibele buis worden verwijderd zonder dat de agar geplaatst in de glazen buisjes.
      5. Plaats 0,5 ml van 1 M KCl in elk putje van een 1,5 ml centrifugebuis rek. Plaats dan een tip van elk KCl / agar gevulde glazen buisje in de afzonderlijke putten.
      6. Vervolgens bezit zijn van een 80 cm lengte van 15 meter zilverdraad met een hemostat en schone elk van de vier zijden door te schrapen om de draad door een Emery boord gehouden om het aanrechtblad.
      7. Snijd de draad in 4 cm lengte en leg ze in een scintillatieflesje gevuld met bleekmiddel voor 20-30 minuten tot een stevige Ag-AgCl jas plaats over het gereinigde zilveren oppervlak.
      8. Buig elke draad in de helft en plaats de vrije uiteinden in een uiteinde van de glazen buis gevuld wie KCl / agar, waardoor ongeveer blootgesteld 4-6 mm.
      9. Ten slotte is de vacht van de glazen buis schacht met de zilveren draad en een geringe mate van de draad met Goop, een water-bestendig en flexibele lijm, om de KCl / agar te voorkomen drogen. Herhaal dit voor alle elektroden. Laat de lijm een ​​nacht drogen.
      10. Bewaar de elektroden bij 4 ° C in scintillatieflesjes (5-6 elektroden / flacon) met ~ 5 ml 1 M KCl en 25 mg EDTA, die duidelijk vertraagt ​​de groei van bacteriën.
    2. Registrerende elektroden zijn gemaakt van 1,5 mm diameter (0,86 mm ID, 10 cm lang) borosilicaat glazen buizen met filamenten (Video figuur 1).
      1. Trek micro-elektroden een boete tip met korte glazen buizen getrokken om een ​​scherpe punt.
        1. We meestal trek elektroden ~ 7,5 cm in lengte met een 1 cm conus. Dit maakt een adequate positionering en elektrode tip visualisatie.
        2. Elektroden zijn getrokken met een Narishige PE-2 trekker.
        3. Micro-elektrode tips zijn rug gebroken met 2-4 um onder visualisatie met behulp van een samengestelde microscoop uitgerust met een gekalibreerde optische micrometer. We gebruiken de rand van een standaard glas histologie slide (25 x 75 x 1 mm) bevestigd aan een hydraulische eendimensionale micromanipulator die door een andere 3-dimensionale manipulator om voorzichtig breken micro-elektrode tips.
          1. Eerst wordt de elektrode bevestigd aan een objectglaasje met behulp van klei.
          2. Dan is de slide is geplaatst op de microscoop diahouder die wordt gebruikt om de micro-elektrode tip de buurt van de rand van het glas te verplaatsen gleed aan de hydraulische manipulator.
          3. Tot slot is het topje van de micro-elektrode voorzichtig gebroken door te drukken tegen de hydraulisch aangedreven microscoopglaasje rand.
    3. Stimulatie-elektroden worden gedraaid draad bipolaire elektroden omdat:
      1. Ze laten opnemen van evoked potentials veld, die anders zouden worden gestoord door de stimulus artefact uit monopolaire stimulatie.
      2. Een bipolaire stimulerende elektrode kan voorzichtig worden toegepast op de dentate gyrus oppervlak zonder letsel, in tegenstelling tot scherp getipt bipolaire elektroden.
      3. Tot slot, toegepaste stroom is gelokaliseerd in het dwarse (kale) ronde oppervlakken van de Teflon geïsoleerde draden gebruikt worden voor de elektrode.
        1. Elektrode fabricage begint met het snijden van ~ 20 cm lengte van platina-iridium (125 micrometer bare diameter van 200 micrometer gecoat diameter) en Teflon gecoate draad. Vervolgens buigen de lengte doormidden en knoop de losse eindjes in een losse platte knoop, waardoor ~ 2 cm van de knoop aan de uiteinden van de draad.
        2. Maak de knoop in de klauw van een elektrische handboormachine op een tafel.
        3. Terwijl het andere uiteinde van de draad met een hemostat kort zet de boor aan en uit totdat de draad strak gedraaid (dat wil zeggen, elk snijvlak zou een gelijke afstand van de andere wanneer de draad wordt gesneden in de dwarsrichting, zonder het ontrafelen van zijn ).
        4. Vervolgens de kale uiteinden van de platina-iridium getwiste draden moeten worden bevestigd aan draden gebruikt om de stimulerende elektrode te sluiten op een stimulus isolator leiden.
          1. Dit wordt gedaan door het solderen van de vrije uiteinden van de platina-iridium draad op ~ 50 cm 30 gauge draden.
          2. De eerste, tape de platina-iridium gedraaid draad aan op een bankje top-and-drop een plas van geconcentreerde HCl meer dan een vrije uiteinde van de gedraaide draad.
            1. Vervolgens off strip ongeveer 1 cm isolatie van elke draad met behulp van een tang.
            2. Plaats de gestripte uiteinde aan de leiband draad naast de gedraaide draad te beëindigen en toepassen van warmte uit een fijne punt soldeerbout, soldeer dan totdat de twee draden stevig bevestigd.
          3. Slip een kleine lengte van de krimpkous over de blootliggende draden verbinding en krimpen het past met warmte.
          4. Herhaal dit voor de tweede draad.
          5. Brand polish de punt van een 15 cm Pasteur pipet en de gedraaide platina-iridium de draad van de pipet gids tot ongeveer 6 cm van de gedraaide steekt uit.
          6. Gebruik een waterafstotend epoxy (bv, JB Weld) aan beide uiteinden van de elektrode afdichting.
          7. Tot slot hechten banaanstekkers het voortouw draadeinden voor aansluiting op de stimulus isolator.
          8. Onder stereoscopische waarneming, plaats de elektrode in PBS en op zoek naar elektrolytisch geproduceerd bellen vanuit alleen het afgesneden uiteinde van de elektrode tips. Als er luchtbelletjes uit de zijkanten van de getwiste draden, knip de elektrode met een dwarse snede met behulp van een verse enkele rand scheermesje te herstellen intact isolatie om de draad lange assen.
          9. Bij het oplossen van problemen met afwijkende stimulus-effecten op te lossen, probeer dan het maken van een vers gesneden elektrode tip.
    4. Het opnemen van gerechten uit alsluizen cultuur invoegen in een 35 mm cultuur schotel die zit op twee 1,0 x 12 mm glazen staafjes ongeveer 1,0 cm afstand van elkaar. Bevestig de glazen staven om de schotel te voet door het verwarmen van de glazen buizen en vervolgens op hen in de basis met een tang.
      1. Voor statische opnameomstandigheden, voeg 1,5 ml medium aan het gerecht.
      2. Vervolgens weken een ~ 10 mm breed en 3-4 cm lang stuk van steriele katoen in 1,0 ml medium. Vouw het katoen in half langs de lange as en plaats deze langs de binnenste goed op de plaats met een steriele pincet. De natte katoen zorgt voor het behoud schotel vochtigheid.
      3. Drie samendrukbare 4 mm lengte van de buizen zijn gelijke afstand van elkaar rond de in te voegen.
      4. Strak Bedek de schotel met polyvinylchloride film, die gasuitwisseling mogelijk maakt.
      5. Snijd rond zijn mid-verticale wand met een enkele rand scheermesje om het overtollige polyvinylchloride film te verwijderen.
  3. Elektrofysiologische setup
    1. Een stukje cultuur insert vergadering is geplaatst in de PDMI opname kamer voor elektrofysiologische opnames.
      1. De insert / cultuur schotel montage in de PDMI kamer wordt gedekt door een 2 mm dikke plastic schijfje meegeleverd met de PDMI kamer, met verschillende kleine gaten gepositioneerd als nodig is voor opnames elektroden, middelgrote instroom / uitstroom buizen, etc.
      2. We periodiek monitoren medium pH met een miniatuur combinatie pH-elektrode en de temperatuur met een miniatuur Type T thermokoppel gemonteerd in een gesloten semi-micro-elektrode tot 7,3 pH en 36,0 ° C te verzekeren.
      3. De insert / kamer wordt belucht met 5% kooldioxide-balans lucht en medium is ofwel gehouden statisch of in een flow (1,2 ml / minuut) configuratie met de insert centrum gehouden op 35-36 ° C.
      4. Voor flow omstandigheden, is medium verwarmd met een inline heater, opnieuw naar het midden van de opname kamer te houden bij 36 ° C.
        1. Een peristaltische pomp systeem met een druk verlichting brengt medium in de slice culturen zonder pulsaties van de pomp. Een aspirator geleverd met de PDMI kamer wordt gebruikt voor het medium te verwijderen van de insert via zachte zuigkracht.
      5. Voor stabiliteit, is de kamer gemonteerd op een speciaal ontworpen Burleigh-Gibraltar omkeermicroscoop stadium dat een omgekeerde microscoop houdt en zit op een trillingsvrije tafel.
      6. Kleine gaatjes worden geopend door de polyvinylchloride insert wrap met een klein, batterij-aangedreven cauterisatie tool.
      7. Vervolgens, als een stroom configuratie wordt gebruikt, is in-en uitlaat stroom begonnen, gevolgd door de plaatsing van een massa-elektrode. Anders, simpel gezegd de massa-elektrode op zijn plaats.
      8. Elektroden, op zijn plaats gehouden met micromanipulators, zijn gepositioneerd net boven een plakje gevisualiseerd met een omgekeerde microscoop bij 5x vergroting (afb. 1).
        1. Beginnen met de registratie-elektrode, gevolgd door de stimulerende elektrode.
        2. We maken gebruik van een audio-monitor op te merken wanneer de micro-elektrode maakt contact met de slice. De tip is gepositioneerd in het midden langs de CA3 piramidale cellichaam laag.
        3. Opnames worden gestart, waarna de elektrode voorzichtig aangeraakt om het middelpunt oppervlak van de dentate gyrus.
        4. In beide gevallen worden de eerste elektrode bewegingen uitgevoerd met grove controle, en de uiteindelijke plaatsing alleen met de hydraulische, fijne controles met behulp van fase-contrast-verlichting, zodat cellichaam lagen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden.
        5. Advance elektroden in ~ 25 micrometer stappen onder directe microscopische visualisatie.
        6. Zodra de elektroden raken de weefsels, vooraf de elektroden een 20-30 um.
        7. Opnames worden begonnen voordat de elektrode is ingesteld om er zeker van dit niet SD activeren (dat wil zeggen via een mechanische stimulus).
        8. ~ 10 minuten zijn te verstrijken voordat experimenten worden gestart.
  4. Transynaptically geïnduceerde SD.
    1. Optimaliseer CA3 veld potentials opgeroepen als volgt (fig. 2).
      1. CA3 veld potentieel worden opgeroepen met 100 microseconden pulsen (0,2 Hz) begint met een stroom die voldoende is om een ​​respons (bijvoorbeeld, ~ 1-5 uA) activeren.
      2. Verplaats de registratie-elektrode in stappen langs de piramidale neuron lange as totdat het veld potentieel is maximaal.
      3. Dan, verhoging van de stroom met de registratie-elektrode op deze positie en let op de maximale stroom respons (bijvoorbeeld, ~ 10-20 uA).
      4. Gebruik tenslotte half-maximale stimulus intensiteit voor experimenten (bijv. sham controle periodieke stimulatie).
    2. Bepaal de drempel voor synaptisch opgeroepen SD (afb. 2).
      1. Met de elektroden geconfigureerd zoals hierboven beschreven voor evoked potentials veld, schakelt de stimulatie paradigma om afzonderlijke, handmatig opgeroepen barstvan 10 pulsen (10 Hz @ 100 ps / impuls), een paradigma eerder toegepast in heel dierstudies.
      2. Geleidelijk stroomsterkte per stimulus burst tot SD is geactiveerd. Wacht ten minste 60 tot 120 sec tussen stimuli.
      3. Rapport SD drempel in coulomb (dat wil zeggen, de huidige x tijd).
    3. In andere experimenten die vereisen dat het meten van reacties op de inductie van meerdere SDS, gebruik maken van een stimulus sterkte waarschijnlijk SD roepen (bijvoorbeeld ~ 100 tot 500 nC).
      1. Trigger SD om de 9 minuten voor een uur.
      2. Zorg ervoor dat u aseptische technieken te gebruiken in heel experimenten.
      3. Na de laatste SD, de terugkeer van de cultuur te voegen naar de normale incubatie omstandigheden.
        1. Markeer de cultuur schotel naar de cultuur die SD ervaren noot.
        2. Onze gewoonte is om een ​​enkel merkteken plaats naar links en twee merken aan de rechterkant van het plakje cultuur te voegen, en merkt elk van de drie culturen als # 1, # 2 en # 3 van links naar rechts.
        3. Verandering medium om de 3-4 dagen tot cultuur oogst.
    4. Voor terugkerende SD, volgen procedures zoals hierboven beschreven.
    5. We meestal test voor een verandering in SD drempel van 1, 3, 7, en 14 dagen na een eerste uren van meerdere SDS.
    6. CA3 gebied snel mogelijke en langzame mogelijke veranderingen worden geregistreerd via aparte digitale signaalverwerking-systemen.

2. Voorbeeldige Vital Imaging in de hippocampus Slice culturen

  1. Dynamische functionele gedrag van de aldaar gevestigde immuuncellen (dat wil zeggen, microglia), kan op dezelfde wijze worden gecontroleerd in slice culturen zonder cel letsel of activering van het immuunsysteem (afb. 3). 9
    1. Bijvoorbeeld om het etiket microglia om hun beweging geassocieerd met synaptische activiteit veranderingen van SD te beoordelen, gebruikten we fluorofoor-tagged isolectin-IB 4.
    2. "Lectin PBS" is PBS met extra kationen (0,1 mM elk CaCl 2, MgCl 2, MnCl 2) sinds tweewaardige kationen (0,1-1,0 mm) zijn verplicht om te binden lectine aan α-D-galactosyl groepen op microgliacellen celmembranen.
    3. Maak een oplossing van "Lectin PBS":
      1. Voor een L PBS, met behulp van aseptische techniek en steriele filtratie, toe te voegen:
      2. 100 ul van 1 M MgCl 2
      3. 100 pi van 1M MnCl 2
      4. 100 ul van 1 M CaCl 2
    4. Meng goed te combineren en gekoeld bewaren bij 4 ° C.
      1. Slechts 500 pi van "lectine PBS" is nodig per flacon van isolectin, maar omdat het kan worden gekoeld en bewaard gedurende maanden op een moment, kan het nuttig zijn om make-up grotere volumes.
    5. Reconstitueer AlexaFluor 594-tagged isolectin-IB4 (isolectin) gevriesdroogd poeder tot1 mg / ml in "lectine PBS".
      1. Om zo min mogelijk photobleaching, voert u deze stap zo snel mogelijk, het minimaliseren van blootstelling aan licht.
      2. Isolectin kan worden gealiquoteerd tot 20 pi een keer opgelost bij 1mg/ml en bewaard bij -20 ° C gedurende maximaal een jaar.
      3. Verdunnen isolectin tot 20 ug / ml in groeimedium en incubeer slice culturen normale incubatie-omstandigheden 4-10 uur voor de beeldvorming.
    6. Imaging set-up.
      1. Imaging set-up bestaat uit: microscoop, sluitertijd, camera, licht, 2,0 grijsfilter, 36 ° C, gas: 5% CO2, lucht (of 20% zuurstof, balans stikstof).
      2. Zet de microscoop, camera, UV-licht, temperatuur controle, en gassen ten minste een uur voor de beeldvorming.
    7. Stel Metamorph Imaging Protocol.
      1. Van de "Journal" drop-down menu, kies "Run Journal ...".
      2. Dit moet de opening van de tijdschriften map, waaruit u moet selecteren "Motion w-var afs (tijdschrift eerder vastgesteld dat volgt op de onderstaande stappen)" prompt, klikt u op "Open".
      3. De "Autofocus Frequency" venster zal volgende pop, houden Number op 1, klik op "OK".
      4. Vervolgens wordt het Setup "Sequential File Na ..." venster zal verschijnen, houden alles zoals het is:
        1. Base Naam: Image;
        2. Afbeelding Aantal: 1;
        3. Nummer Breedte: 3;
        4. Opslaan als Type: Metamorph TIFF;
        5. als afbeelding al bestaat -> automatisch overschrijven;
        6. Klik op "Selecteer Directory ...", dit zal ertoe leiden dat de" Map "venster pop-up. Hier selecteert u de map (of maak een nieuwe map) waar de film beelden moeten worden opgeslagen.
        7. Dan, wanneer de juiste map (bv. C: \ Data \ Nieuwe map) wordt weergegeven in de bodem van de 'Setup Sequential File Na ... " venster, klik op "OK".
        8. In de Acquire venster:
          1. Selecteert u de instelling in de linker benedenhoek te DiIMGBIN2;
          2. "Exposure Time": 20ms, "binning": 1.
        9. Daarna, in de Special tab:
          1. "Sensor Mode": FT;
          2. "Digitizer ": 10MHz (EM Gain);
          3. "Gain": Gain3 (3x);
          4. Selecteer "EM Gain: 45"; sluiter van de camera: Open voor Expose; Clear-modus: CLEAR PRE EXP; Helder Count: 2, Trigger Mode & Live Trigger Mode: Normaal (TIJD).
        10. "Frames te Gem": 3.
        11. Klik op "Close".
    8. Na het opzetten van de Metamorph beeldvorming, plaats de insert in een 35mm cultuur schotel met twee 1 mm glazen staven in de bodem.
      1. Plaats drie 2 mm stukjes rubber slang aangebracht tussen de wanden van de insert en de cultuur schotel om verder te stabiliseren van de in te voegen.
      2. Plaats een ~ 10 mm breed stuk katoen gedrenkt in een extra 1 ml medium in de plaatsen om een ​​vochtige omgeving te houden. Zorg ervoor dat het gelijk met de muren en uit de buurt van de hippocampus plakjes.
      3. Strak Bedek de bovenkant van de cultuur schotel met polyvinylchloride film vochtverlies te voorkomen.
    9. Zorg ervoor dat de focus van de beeldvorming is het CA3 piramidale cellaag. Let op de slice oriëntatie door het nemen van fase foto's op 5x, 10x, en 20x.
    10. In de "Zoek Focus" venster dat verschijnt op het scherm, stel Range, de huidige + / - om "8", en nauwkeurigheid, in micron (s), als "1" (beide vakjes aan de onderkant moet worden gecontroleerd) .
    11. Klik op "Zoek Focus" aan een in-focus afbeelding te garanderen.
    12. In de "Acquire Timelapse" venster, selecteer Tijd interval te worden "1 minuut", en duur te zijn "6 uur" (dit zijn onze voorkeur acquisitie parameters).
      1. Om nauwkeurig vast te leggen microgliale bewegingen, moet beeldvorming niet minder frequent dan een keer per minuut.
    13. In beeldopslag, selecteert u Stack.
    14. De Update Image Window box moet worden gecontroleerd, maar niet de andere twee dozen eronder.
    15. Selecteer "Illum" to be "Lambda".
    16. Klik op "OK".
    17. De film zal nu beginnen te lopen. Dit betekent dat niets anders kan worden uitgevoerd binnen het programma Metamorph tot de film klaar is of totdat u eerder stopt met de film door te klikken op Esc, waarna de film zal dan stoppen bij de volgende getimede overname stap.
    18. Aan het einde van de film, te controleren op celschade door Sytox screening, zoals hierboven aangegeven (A).

3. RNA-extractie voor Low-Level Cytokine Signaling 11-15

  1. We hebben eerder gedetailleerde instructies gepresenteerd voor de detectie van low-level cytokine signaling in slice culturen met behulp van qPCR en PCR-array technieken. 6,7
  2. We hebben aanzienlijk verbeterd de gevoeligheid van onze aanpak voor cytokine mRNA detectie in slice culturen en hier aanwezig deze verbeteringen.
  3. De verbeteringen omvatten onze benadering van weefsel oogst en RNA-isolatie, prescreening van monsters voor tumor necrose factor-alfa (TNF-α) te wijzigen, en cDNA preamplfication, die ~ 6 keer gevoeliger dan de vorige technieken en, bijvoorbeeld, detectie mogelijk te maken voor de eerste keer van slice cultuur interferon-gamma (IFN-λ) detectie. 15
  4. PCR-voorbereiding.
    1. Slice cultuur oogst.
      1. Na experimenten, slice cultuur inserts worden ondergedompeld in 2-3 ml RNA later en bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen tot verdere verwerking.
      2. Om te oogsten, te verwijderen vreemde (dat wil zeggen, alle weefsels grenzend aan de hippocampus juiste) weefsel met behulp van een diamant mes en til de plakjes in individuele RNase / DNase vrij 1,5 ml centrifuge buisjes met 0,5 ml steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een fijne getipt verf borstel.
      3. Spin monsters (10.000 rpm x 1 min) in een stereotype manier, zodat alle segmenten zich aan dezelfde kant van hun buizen.
      4. Verwijder de PBS supernatant en resuspendeer monster in 500 ui TRIzol.
      5. Bewaar monsters bij -80 ° C of te houden op ijs tot RNA-extractie.
    2. RNA-extractie usingTRIzol met de RNeasy Micro kit resulteert in een grotere RNA opbrengst (afb. 4) is dan het gebruik van de kit alleen.
      1. Dooi TRIzol-monsters en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
      2. Distantiëren weefsel door monsters op en neer met 1 ml getipt pippetor en / of vortexen tot de massieve weefsel is niet meer zichtbaar.
      3. Voeg 100 ul RNase vrij (RF), chloroform en omkeren tube 2-3 keer om te mengen.
      4. Incubeer 3 min bij kamertemperatuur, vortexen elke min.
      5. Centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 15 min bij 4 ° C.
      6. Overdracht supernatans een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. Wees voorzichtig niet te gebruiken interface storen.
      7. Voeg een gelijk volume van de ruimtetemperatuur RF 70% moleculaire biologie kwaliteit ethanol (~ 300 pi).
      8. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren een paar keer.
      9. Ga verder met de volgende stappen per RNeasy Micro kit richtingen:
        1. Van toepassing zijn monster tot een RNeasy micro kolom geplaatst in een 2 ml Collection buis.
        2. Centrifugeer bij 10.000 rpm voor 15 sec, gooi flow-through.
        3. Was RNeasy kolom met 350 pi buffer RW1.
        4. Centrifugeer bij 10.000 rpm voor 15 sec, gooi flow-through.
        5. Voeg 10 uL DNase een stockoplossing aan 70 pi buffer RDD, voorzichtig mengen.
        6. Van toepassing zijn 80 pi van DNase oplossing direct op membraan en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
        7. Was RNeasy kolom met 350 pi buffer RW1.
        8. Centrifugeer bij 10.000 rpm voor 15 sec, gooi doorstroom en de buis.
        9. Voeg 500 ul buffer RPE te RNeasy kolom.
        10. Centrifugeer bij 10.000 rpm voor 15 sec, gooi flow-through.
        11. Voeg 500 ul RF 80% moleculaire biologie kwaliteit ethanol te RNeasy kolom.
        12. Centrifugeer bij 10.000 rpm gedurende 2 min, gooi doorstroom en de buis.
        13. Plaats RNeasy column in de nieuwe buizen met de doppen open.
        14. Centrifugeer op volle snelheid (dat wil zeggen, 14.000 rpm) gedurende 5 minuten.
        15. Overdracht RNeasy kolom om een ​​RF microcentrifugebuis.
        16. Van toepassing zijn 14 pi RF water direct aan het membraan.
          1. Centrifugeer bij 10.000 rpm gedurende 1 minuut te elueren.
          2. Bewaar monsters bij -80 ° C of doorgaan met de volgende stappen.
    3. RNA kwantificatie.
      1. Verdunnen RiboGreen 1:200 in RF 1x Tris-EDTA (TE) buffer.
      2. Bereid gist tRNA om te worden gebruikt als de RNA-standaard.
        1. Werkvoorraad wordt opgeslagen in -20 ° C bij 100 ug / ml
        2. Verdun tot 1 ug / ml (10 pi in 990 pi TE).
        3. Maak normen als volgt: Voor 100 ng / ul, voeg 100 ul, voor 80 ng / ul, voeg 80 ul tRNA en 20 uL TE, voor 60 ng / ul, voeg 60 ul tRNA en 40 uL TE, voor 40 ng / ul Voeg 40 uL tRNA en 60 uL TE, voor 20 ng / ul voeg 20 ul tRNA en 80 pi TE, en voor 0 ng / ul toe te voegen 100 pi TE.
      3. Voor te bereiden monsters:
        1. Combineer 99 pi TE + 1 pi monster.
        2. Lopen elk monster in duplo.
      4. Met behulp van een multi-channel pipet, voeg 100 ul van de verwaterde RiboGreen per putje.
      5. Pipet op en neer om te mengen.
      6. Meten fluorescentie op een bord lezer.
        1. Fluoresceïne (485 nm/535 nm, 0,1 sec)-programma.
        2. Exporteren resulteert in een Excel spreadsheet.
    4. Bepaal RNA-concentratie.
      1. Grafiek absorptievermogen versus RNA-concentratie en een best-fit lineaire regressielijn in Excel.
      2. Te bepalen monster RNA concentraties van de regressievergelijking worden geassocieerd met het best passende lijn.
    5. Bepaal RNA kwaliteit.
      1. Ribosomaal RNA band integriteit is gemeten via agarose gel (afb. 4).
        1. Hoewel het onpraktisch is het uitvoeren van een fractie van elk RNA-monster verkregen (= sinds 1 ug van RNA is vereist en onze rendementen zijn klein), is het een goed idee om een ​​denaturerende agarosegel periodiek draaien op een voorbeeldige monster als bewijs dat de methode , wanneer goed uitgevoerd, levert een hoge kwaliteit-RNA (dat wil zeggen, zonder degradatie).
        2. Bereid een 1% agarose gel (voor een 100 ml volume).
          1. Het reinigen van de tank elektroforese, casting lade en gel kammen grondig met RNase AWAY.
          2. Weeg 1 g van ultrapuur agarose in een kolf.
          3. Voeg 83 ml RNase vrij water en 10 ml van 10x MOPS [3 - (N-morfolino) propanesulfonic zuur] buffer en een magnetron tot de agarose is opgelost en oplossing helder is (~ 3 min).
            1. 10x MOPS buffer te maken
              1. Combineer 83,7 g MOPS, 13,6 g natriumacetaat, en 3,7 g EDTA.
              2. Voeg 800 ml RNase vrij water, meng op te lossen.
              3. Breng de pH tot 7,0 en vul tot 1 L.
              4. Filter steriliseren of autoclaaf.
              5. Bewaren bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
          4. Laat gel afkoelen tot 55 ° C en voeg 7 ml 37% formaldehyde (deze stap dient te gebeuren in een chemische dampkap).
          5. Giet gel in het gieten lade en laat gel te stollen in de motorkap.
        3. Bereid de RNA-monsters.
          1. RNA-sample buffer (500 pL, het maken van verse).
            1. Combineer 50 uL 10x MOPS, 250 ui formamide, 90 pi 37% formaldehyde, 108 uL RF H ​​2 O 2 en pi ethidiumbromide (voorraad-oplossing 10 mg / ml).
          2. Tot 1-10 ug van RNA, voeg het dubbele volume met behulp van sample-buffer, voor een drie-voudige verdunning.
          3. Denatureren bij 95 ° C gedurende 5 minuten, en daarna chillen op ijs gedurende 5 minuten.
          4. Spin briefly en laad de volledige steekproef in putten naast een RNA-ladder (voeg laden kleurstof indien gewenst).
        4. Electrophorese
          1. Vul de kamer met 1x MOPS buffer.
          2. Electrophorese op 50-75 volt tot de markers zijn gemigreerd over 2/3e van de lengte van de gel.
        5. Visualiseer de gel op een UV-transilluminator.
          1. Controleer of er scherpe 18S en 28S ribosomaal RNA (rRNA) bands, en dat de 28S band is twee keer zo intens als de 18S band (afb. 4).
          2. Gedegradeerd RNA zal een besmeurd uiterlijk, fuzzy bands, of zal niet vertonen een 2:1 verhouding.
    6. Normaal gesproken gebruiken we optische dichtheid van de totale RNA kwaliteit te beoordelen.
      1. Hoewel niet zo gevoelig, UV-spectrofotometrie via een Nanodrop is een snelle en kosten efficiënte manier van het controleren van RNA kwaliteit.
      2. Kijk voor optische dichtheid (OD) 260/280 ratio van 1.5-2.0.
      3. Houd in gedachten dat de oplossing waarin RNA is gesuspendeerd (TE-buffer versus water) zal de OD-ratio beïnvloeden.
  5. PCR-activiteiten.
    1. Pre-PCR setup
      1. Ontwerp specifieke primers
        1. Met behulp van Primerblast NCBI's http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ :
          1. Voer de target-gen van de toetreding van Refseq nummer.
          2. Geef PCR-product grootte van 70 tot 200 bp.
          3. Geef een Tm van 55 tot 72 °, met minder dan 5 ° verschil tussen vooruit en achteruit primers.
          4. Selecteer "Primer moet een exon-exon knooppunt span" om genomische achtergrond te verminderen.
          5. Schakel specificiteit controleren Rat Refseq RNA-database om te voorkomen dat primers niet extra targets te herkennen.
          6. Kies een primerpaar van resultaten die aan de volgende criteria past:
            1. 18-30 basen lang.
            2. Minder dan 2000 bases van elkaar op uw sjabloon.
            3. 40-60% guanine-cytosine content om een ​​stabiele binding van primer te template te verzekeren.
      2. Het kiezen van een referentie-gen.
        1. Niet elke referentie-gen zijn geschikt voor uw experimentele set up. Elke keer dat een nieuw paradigma wordt gebruikt, moet de stabiliteit van uw referentie worden geverifieerd. Aan consistentie, hebben we ervoor gekozen om een van de vier referentie-genen die op de RT 2 Profiler PCR array te gebruiken.
        2. Een goede referentie-gen dienen te voldoen aan de volgende criteria:
          1. De uitdrukking niveau is niet veranderd door de experimentele paradigma.
          2. Het wordt uitgedrukt op een niveau vergelijkbaar met dat van de target-gen.
        3. Om een ​​geschikte referentie te selecteren:
          1. Bekijk de literatuur te verwachten kandidaten te identificeren voor een stabiele referentie-gen in uw systeem. Bijvoorbeeld, we getest Rpl13a omdat werd aangetoond stabiel te zijn in studies van ischemie. 11,12
          2. Ontwerp van primers, zoals hierboven besproken (of vind reeds gevalideerd primers voor gemeenschappelijke referentie genen in een database zoals RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ).
          3. Optimaliseren van primers naast target-gen primers (zie hieronder).
          4. Bepaal welke kandidaat verwezen wordt meest stabiele behulp van software zoals Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm), die een waarde voor de stabiliteit van elk gen berekent op basis van de binnen de groep variantie en selecteert het gen (s) met de minste uitdrukking variatie over de monsters. Bijvoorbeeld, Rpl13a is een optimale referentie gen voor SD (afb. 4).
      3. Optimaliseren van primers.
        1. Voor het verkrijgen van consistente en betrouwbare resultaten van qPCR, primers aan bepaalde criteria van reproduceerbaarheid, gevoeligheid en specificiteit voldoen.
          1. Het beste is om deze parameters te testen voor elke nieuwe primer paar.
          2. Reproduceerbaarheid is getest door het uitvoeren van technische repliceert.
          3. De gevoeligheid kan worden beoordeeld door prestaties met een standaard curve van opeenvolgende 4-voudige verdunningen.
          4. Specificiteit wordt bepaald door het bevestigen van een enkel product door smelt curve analyse en gelelektroforese (afb. 5).
        2. Voer een qPCR plaat aan de kwaliteit van uw primers te testen, en de concentratie van de primers worden gebruikt.
          1. Met behulp van cDNA gesynthetiseerd uit de hersenen als geheel RNA, een standaard curve (reeks van opeenvolgende 4-voudige verdunningen) als volgt: 1, 1:4, 1:16, 1:64, 1:256, en geen template controle (NTC) .
          2. Voor elke verdunning, run 1 ui cDNA in gedupliceerdte voor elke concentratie van primers, (dat wil zeggen, 100 nM, 200 nM, 300 nM).
        3. Bevestigen dat de technische repliceert geven consistent Ct-waarden.
        4. Onderzoek Ct-waarden voor de verdunning curve.
          1. Plot de Ct-waarden tegen de concentratie voor elk van de verdunningen. De resulterende grafiek moet lineair zijn met een goede correlatie coëfficiënt (dat wil zeggen,> 0,95).
        5. Onderzoek smelten bocht naar de aanwezigheid van een enkele versterking product (dat wil zeggen, enkele piek) te bevestigen.
          1. Als er meerdere pieken, of de toppen niet soortgelijk zijn, kan dit wijzen verontreiniging, mispriming, primer-dimeer artefact, etc. (Fig. 5).
          2. Een piek in het NTC zal waarschijnlijk overeenkomen met primer dimeren die gemakkelijker vorm in de afwezigheid van template cDNA, en mag niet worden een bron van zorg.
        6. Bevestig smelt-curve gegevens door het oplossen van geamplificeerde producten op een 1% agarose gel.
          1. Bereid een 1% agarose gel (voor een 100 ml volume)
            1. Weeg 1 g agarose in een kolf.
            2. Voeg 100 ml 1x Tris-acetaat EDTA (TAE)-buffer en magnetron tot de agarose is opgelost en de oplossing is duidelijk.
              1. 1 L 50x TAE-buffer bestaat uit 2 M Tris base, 57 ml ijsazijn en 0,05 M EDTA (pH 8,0).
              2. Verdunnen TAE buffer om 1x met gedestilleerd water (eindconcentraties: 40 mM Tris-acetaat en 1,0 mM EDTA).
            3. Laat gel tot 55 ° C afkoelen voordat u ethidiumbromide tot een concentratie van 0,5 pg / ml.
            4. Giet gel in het gieten bak en laat het stollen op kamertemperatuur.
          2. Te lopen, gel in electroforese kamer gevuld met 1x TAE, combineer 10 pi van het monster uit de qPCR plaat met 2 pl van 6x laden kleurstof, goed mengen en laden in putten naast een moleculair gewicht ladder.
          3. Electrophorese op 50 tot 150 volt tot de markers zijn gemigreerd een gepaste afstand, afhankelijk van de verwachte grootte van uw cDNA product.
          4. Visualiseer met een UV-transilluminator.
          5. Bevestigen dat het geamplificeerde PCR-product is van de juiste grootte voor uw doelgroep.
          6. Primer dimeren zal rond 50 bp.
    2. Pre-screening op verhoogde TNF-α.
      1. Omdat TNF-α initieert ontstekingsreacties in de periferie, vermoeden we dat dit ook geldt voor de hersenen en het gebruik van de eerste screening voor TNF-α mRNA als een marker van de slice cultuur immune status (dat wil zeggen, normaal, schijn, en de experimentele groep) voordat u verder gaat naar volledige PCR-array-analyses.
      2. Indien de normale en sham controle TNF-α mRNA niveaus worden niet binnen een interassay range te vinden in ons laboratorium, experimenten (dat wil zeggen, normaal, schijn, en de experimentele groep) worden afgevoerd en niet over tot de volledige reeks PCR-analyses.
      3. iScript cDNA synthese.
        1. Voor elk RNA-monster, combineren de volgende in een PCR tube: 4 pi 5x reactie mix, 1 ui reverse transcriptase, 25 ng RNA, en RF H ​​2 O tot een eindvolume van 20 pi.
        2. Meng voorzichtig door pipetteren en in het kort spin down.
        3. Incubeer: 25 ° C, 5 min, 42 ° C, 30 min, 85 ° C, 5 minuten.
        4. Verdunnen 1:4 (toevoegen 60 pi RNase vrij water).
        5. Bewaren bij -20 ° C of te houden op ijs pas klaar voor gebruik binnen enkele uren.
      4. qPCR voor TNF-α.
        1. Bereid een master mix voor elke primer paar.
          1. Combineer 12,5 pi iQ SYBR groen, 1 ui primer mix en 10,5 uL water per monster.
          2. Voor zowel onze Rpl13a en TNF-α primers, 200 nM is de optimale concentratie.
          3. Pas de hoeveelheid primers en het volume van waster als noodzakelijk in een 1,5 ml RF microcentrifugebuis en blijf op het ijs, terwijl u het opzetten van de plaat.
        2. Stel een qPCR plaat met controle / schijn / experimentals. Gebruik 1 pi van cDNA per monster in tweevoud voor elk gen.
        3. Voeg 24 ul van uw master mix aan elk putje en pipet op en neer om te mengen.
        4. Wees erg voorzichtig om luchtbellen te vermijden, want zij zullen interfereren met fluorescentie metingen.
        5. Run 40 cycli van PCR-amplificatie:
          1. 95 ° C, 8.5min;
          2. 40 cycli: 95 ° C, 10 sec; 60 ° C, 30 sec; 72 ° C, 20 sec / cyclus.
          3. Smelt curve: 55 ° C, 1 min, 80 cycli van 0,5 ° C in stappen van 10 sec voor elk beginnend bij 55 ° C.
      5. Analyseren van gegevens (ΔΔCt methode. Afb. 4). 13
  6. cDNA synthese voor PCR-arrays.
    1. Bereken het volume (pi) van elk monster tot 250 ng van RNA hebben.
      1. Kies voor een bedrag van RNA (100 ng tot 1 ug) die u kunt consequent uit je monsters.
    2. RT 2 Eerste Strand Kit - volgens instructies van de fabrikant. In het kort:
      1. Ontdooien en spin down alle reagentia.
      2. Voor elk RNA-monster, combineren de volgende in een PCR-buis:
        1. 250 ng van RNA, 2 pi van de 5x genomische DNA (gDNA) eliminatie buffer en water tot een eindvolume van 10 pi.
      3. Meng voorzichtig door pipetteren en in het kort spin down.
      4. Incubeer bij 42 ° C gedurende 5 minuten.
      5. Chill op ijs gedurende 1 minuut.
      6. In de tussentijd, de voorbereiding van de reverse transcriptie (RT) cocktail (per monster):
        1. Combineer vier pi van 5x RT buffer 3, 1 ui primer en externe controle mix, 1 ui RT enzym mix 3, en 3 pi van water.
      7. Voeg 10 ul van RT cocktail aan elk monster en meng voorzichtig.
      8. Incubeer bij 42 ° C gedurende 15 minuten.
      9. Stop reactie door incubatie bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
      10. Voeg 91 ul van RF-H 2 O tot elk 20 pi cDNA-synthese reactie (verdunnen tot een eindvolume van 111 pi).
      11. Meng goed door pipetteren.
      12. Bewaren bij -20 ° C of te houden op ijs pas klaar voor gebruik binnen enkele uren.
  7. RT 2 Profiler PCR array.
    1. De volgende instructies op te volgen die van de fabrikant en worden hier herhaald voor het gemak.
    2. Bereid reagentia
      1. Ontdooien en spin down alle reagentia.
      2. Bereid experimentele cocktail:
        1. Combineer 1350 pi van 2x SABiosciences RT 2 qPCR SYBR Green Master Mix, 102 pi van verdunde cDNA en 1248 pi van RF-H 2 O tot een eindvolume van 2700 pi.
      3. Verwijder voorzichtig PCR array van verzegelde tas.
      4. Doseer cocktail in een laad-reservoir.
      5. Voeg 25 ul aan elk putje met een multi-channel pipet.
      6. Zorgvuldig seal PCR-reeks plaat.
      7. Centrifugeer de plaat bij 10.000 rpm gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
      8. Plaats op ijs totdat PCR-programma klaar is.
    3. Voer het juiste fiets-programma voor uw machine.
      1. ICycler:
        1. 95 ° C, 10 min
        2. 40 cycli: 95 ° C, 15 sec; 60 ° C, 1 min.
        3. Smelt curve: 55 ° C, 1 min, 80 cycli van 0,5 ° C in stappen van 10 sec voor elk beginnend bij 55 ° C
    4. Analyseren van gegevens.
      1. Selecteer "Auto Berekend" voor baseline cycli.
      2. Selecteer "User Defined" voor de drempel staat om handmatig in te stellen drempelwaarde.
        1. In "Log View", stelt drempel in het onderste een-derde van de lineaire fase van de versterking plot.
        2. Zorg ervoor dat u drempelwaarde hetzelfde over loopt te houden.
      3. Gegevens exporteren.
      4. Inbreng in een Excel-bestand.
      5. Uploaden naar SABiosciences PCR Array data-analyse.
        1. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php
        2. Selecteer de referentie-genen - gebruikten we Rpl13a.
      6. Onze praktijk is:
        1. Bevestigen de resultaten met minimaal een dubbele PCR array.
        2. 3-voudige reeks veranderingen hoeft niet te worden bevestigd door de volgende specifieke doelgroepen PCR-amplificatie. 6,7
        3. Minder dan 3-voudige wijzigingen moeten worden bevestigd door de volgende specifieke doelgroepen PCR-amplificatie of het gebruik van 2-3 PCR-arrays (tot 2x wijzigingen te bevestigen.
    5. DNA voorversterking wordt gebruikt om de doelstellingen met de verwachte ultra-lage expressie (afb. 6) te analyseren.
      1. SABiosciences's RT 2 Nano PreAmp cDNA synthese kit en primer mixen zijn bedoeld voor pre-amplificatie van RNA voor het gebruik van kleine hoeveelheden (1-100 ng) van het monster RNA laten een volledige reeks PCR-run.
      2. Elke primer mix zorgt voor de amplificatie van 89 gen-specifieke cDNA doelgroep templates met minimale bias. We hebben gebruik gemaakt van dit systeem als een middel van het versterken van laag niveau signalen zoals IFN-λ naar een waarneembaar niveau.
      3. RT 2 Nano PreAmp cDNA synthese kit - volgens instructies van de fabrikant. In het kort:
        1. Ontdooien en spin down alle reagentia.
        2. Voor elk RNA-monster, combineren de volgende in een PCR-buis.
          1. 1-100ng van RNA, 2 pi van de 5x gDNA eliminatie buffer en water tot een eindvolume van 10 pi.
        3. Meng voorzichtig door pipetteren en in het kort spin down.
        4. Incubeer bij 42 ° C gedurende 5 minuten.
        5. Chill op ijs gedurende 1 minuut. In de tussentijd, de voorbereiding van de RT cocktail (per monster).
          1. Combineer vier pi van 5x RT buffer 3, 1 ui primer en externe controle mix, 1 ui cDNA-synthese enzym mix, 1 ui RNase-remmer, en 3 pi van water.
        6. Voeg 10 ul van RT cocktail aan elk monster en meng voorzichtig.
        7. Incubeer bij 42 ° C gedurende 15 minuten.
        8. Stop reactie door incubatie bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
        9. Bewaren bij -20 ° C of te houden op ijs pas klaar voor gebruik.
      4. cDNA amplificatie met specifieke primers.
        1. Meng de volgende in een PCR-buis:
          1. 12,5 pi PCR Master Mix, 7,5 pi specifieke primers, en 5 ul onverdund cDNA.
        2. Run 12 cycli van PCR-amplificatie.
          1. 95 ° C, 10 minuten.
          2. 12 cycli: 95 ° C, 15 sec; 60 ° C, 2 min.
          3. Houd bij 4 ° C.
        3. Voeg 2 pi nevenreactie verloopstuk naar elk monster.
        4. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
        5. Stop reactie door incubatie bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
        6. Voeg 84 ul RF water om elk 27 pi cDNA amplificatie reactie.
      5. Bewaren bij -20 ° C of te houden op ijs pas klaar voor gebruik binnen enkele uren.
      6. Amplify individuele gen doelen met behulp van SAB primers en SYBR groene master mix zoals hierboven beschreven.

4. Multiplexed fosfoproteïne Testen van Cytokine Signaling

  1. Mutliplexed fosfoproteïne assays worden gebruikt om de cytokine ligand-receptor stroomafwaarts signalering (afb. 7) te definiëren.
  2. Bepaal hoeveelheid totale hoeveelheid eiwit in slice culturen.
    1. Oogst slice culturen door voorzichtig op te tillen plakjes off van inserts en plaats in 1 ml koud (4 ° C) PBS.
    2. Centrifuge buizen voor 30 seconden en verwijder de PBS. Plaats op droog ijs tot het werk klaar oogsten.
    3. Bewaren bij -80 ° C.
  3. Homogeniseer slice culturen voor totaal eiwit assay.
    1. Bereid cellysis buffer volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Voeg proteaseremmers tot een totaal volume van de buffer nodig om ten minste 200 pi van lysis buffer op elk sneetje cultuur.
        1. Bijvoorbeeld: voeg 20 pi van Factor 1, 10 pL van Factor 2, en 20 pi 500 mM PMSF in DMSO tot 4,95 mL cel lysis buffer.
    2. Dooi slice culturen in 200 pi lysisbuffer op ijs.
    3. Ultrasone trillingen slice culturen vijf keer in 1 sec pulsen en plaats meteen weer op ijs.
    4. Vortex monsters voor 10 sec.
    5. Centrifugeer monsters bij 4 ° C gedurende 15 minuten bij 13.000 rpm.
    6. Overdracht supernatans een schone buis en te houden op ijs.
  4. Voer totaal eiwit assay.
    1. Bereid eiwit normen.
      1. Reconstitueer voorraad bovine serum albumine (BSA) volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Bereid normen, variërend 0 tot 1000 ug / ml verdund in zuiver water voor BCA proteïne test.
    2. Bereken het volume van het werken reagens dat nodig is op basis van het aantal monsters en repliceert.
      1. Bijvoorbeeld: (8 normen + 18 onbekende monsters) x (2 duplo's per monster) x (0,2 ml werken reagens dat nodig is per well) = 10,4 ml totale volume nodig voor alle monsters geladen op de microplaat.
        1. Ronde tot 12 mL totaal volume om voldoende volume te garanderen.
      2. Bij het mengen van Reagens A met Reagens B voor de werkende reagens, sommige troebelheid kunnen optreden, maar zal binnenkort verdwijnen.
    3. Belasting 10 il van monsters en standaarden per well.
    4. Belasting 0,2 ml van het werken reagens in putten.
    5. Afdekplaat met afdichting tape en schud gedurende 30 seconden om te mengen.
    6. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
      1. Koude plaat op kamertemperatuur (ongeveer 10 min) voor het lezen op een bord lezer bij 595 nm golflengte.
    7. De bouw van een standaard curve met behulp van Microsoft Excel met de gemeten absorptie versus verwachte concentratie.
      1. Een goede correlatie coëfficiënt gelijk is aan of groter dan 0,98.
    8. Bereken eiwit concentraties in monsters met behulp van de lineaire vergelijking afgeleid van de standaard curve.
    9. Verdunnen monsters in lysisbuffer om gelijke hoeveelheden eiwit en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor verdere verwerking.
    10. Eiwit concentratie range 200 tot 900 ug / ml volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Voer Multiplex Assay.
    1. Let op: multiplexed fosfoproteïne assays neemt twee dagen in totaal in beslag, met een uur van de initiële set-up en het laden van de plaat, gevolgd door een 's nachts incubation stap en extra incubatie en wassen stappen de volgende dag.
    2. In kaart te brengen welke putten zal bevatten die lysaat volgens werkblad in de handleiding.
    3. Dooi gehomogeniseerd weefselmonsters en kit lysaten bij kamertemperatuur en vervolgens op ijs. Breng alle buffers en reagentia die in kit op kamertemperatuur (met uitzondering van streptavidine en kralen).
    4. Bereid je kralen voor multiplex assay.
      1. Cover buizen die gekoppeld kralen met aluminium folie ter bescherming tegen licht. Vortex buizen voor 5 sec en blijf op ijs.
      2. Verdunnen gekoppeld kralen 01:50 in wasbuffer.
        1. Elk putje moet bevatten een pi van gekoppelde kralen in 49 uL wasbuffer voor een totaal volume van 50 ul per putje.
    5. Kalibreer het vacuüm apparaat.
      1. Was de plaat met 100 ul wasbuffer per well.
      2. Zet vacuüm en zuig het overtollige vloeistoffen in 2-5 sec.
        1. Indien volledige verwijdering van de buffer duurt langer of korter dan 2-5 sec, dienovereenkomstig aan te passen druk ventiel.
        2. Droog de onderzijde van de plaat voor het toevoegen van samples.
    6. Vortex de verdunde gekoppeld kralen voor 5 seconden en voeg 50 ul aangewezen putten.
      1. Onmiddellijk vacuüm filter en de onderkant van de plaat droog met een papieren handdoek.
    7. Twee keer was de plaat met 100 ul wasbuffer per well. Droog de onderzijde van de plaat na elke wasbeurt.
    8. Vortex ontdooid monsters voor 3 seconden en voeg 50 ul aangewezen putten. Plaats afdichting tape over bord en incubeer 15-18 uur schudden bij 300 rpm bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
    9. Vacuümfilter overtollige vloeistof en was bord drie maal met 100 pi wasbuffer. Droog de onderzijde van de plaat na elke wasbeurt.
    10. Verdunnen detectieantilichaam 01:25 in wasbuffer.
      1. Elk putje vereist een pi-detectie antilichaam in een totaal volume van 25 ul wasbuffer.
    11. Plaats afdichtband op plaat en beschermen tegen licht met aluminiumfolie. Schud gedurende 30 sec, geleidelijk toenemende snelheid tot 1100 tpm. Blijven schudden bij 300 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
    12. Vacuümfilter de plaat en was drie maal met 100 pi wasbuffer. Droog de onderzijde van de plaat na elke wasbeurt.
    13. Terwijl het beschermen van de plaat van het licht, bereid een 1:100 verdunning van streptavidine-PE met voldoende volume om 50 ul toe te voegen per well. Bescherm de oplossing tegen licht.
    14. Vortex grondig en voeg 50 ul verdund streptavidine-PE per well. Incubeer met schudden bij 1100 tpm gedurende 30 seconden gevolgd door 10 min bij 300 rpm.
      1. Vacuümfilter overtollige buffer af.
      2. Was de plaat drie maal met 100 ul resuspensie buffer per well.
      3. Droog de onderzijde van de plaat grondig na elke wasbeurt.
    15. Voeg 125 ul resuspensie buffer in elk putje en schud gedurende 30 seconden bij 1100 tpm.
    16. Onmiddellijk lezen plaat of bewaar bij 4 ° C verwijderd van licht tot 24 uur.

5. Nabootsen en Modulatie van Cytokine Signaling

  1. Recombinant cytokine eiwitten (met drager) worden gebruikt om veranderingen van SD na te bootsen.
    1. Gevriesdroogde eiwitten (bijv. TNF-α) worden opgeslagen voor maximaal 1 jaar bij -20 ° C.
    2. Na verdunning van een stamoplossing met 0,1% bovine serum albumine, aliquots worden bereid, opgeslagen bij -20 ° C, tot gebruik binnen 3 maanden.
    3. Alle manipulaties aan slice culturen zijn vernieuwd ten minste om de derde dag.
  2. Cytokine signalering wordt het zwijgen opgelegd door:
    1. Gebruik van traditionele cytokine signaalcascade farmacologische middelen;
    2. Het gebruik van oplosbare ligand antagonist [bijvoorbeeld oplosbare TNF-receptor 1 (zoals hierboven beschreven voor recombinant liganden)], of
    3. Gene silencing [dwz, kleine interfererende RNA (siRNA)].
  3. Levering van siRNA tot neuronale cellen is vaak problematisch.
    1. Gemeenschappelijke lipide-gebaseerde reagentia meestal resulteren in lage transfectie-efficiëntie en het verlies van levensvatbaarheid van de cellen.
    2. In plaats daarvan maken we gebruik van Thermo Scientific Dharmacon Accell siRNA's, die voor een hoog rendement knockdown mogelijk te maken zonder gebruik van een transfectie reagens.
    3. Hier laten we knockdown van cyclophilin B, een niet-essentiële eiwitten, uitgedrukt in alle celtypen, als een bevestiging van het gebruik van deze methode in slice culturen.
    4. Levering protocol werd aangepast voor slice culturen van de instructies van de fabrikant voor het gebruik in hechtende cellen.
      1. Verdunnen 5x siRNA buffer om 1x met RNase vrij water.
      2. Bereid een 100 urn siRNA oplossing in 1x buffer
        1. Cyclophilin B siRNA wordt gegeven aan 5 nmol. Resuspendeer in 50 ul 1x buffer voor een 100 uM voorraad.
      3. Meng siRNA met Accell levering medium tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM siRNA.
        1. Voeg 11 ul van 100 uM voorraad siRNA tot 1100 ul van Accell levering medium in een 6-wells plaat.
        2. Plaats in de incubator en laat de temperatuur naar normale incubatie omstandigheden equilibreren voor ten minste 20 minuten.
      4. Met behulp van een BSL-2 kap en steriele techniek, transfer inserts in de levering mix-bevattende putten.
        1. Incubeer met de levering mix voor 96 uur voor proteïne knockdown.
          1. Beoordeel proteïne knockdown door Western blot of geïntensiveerd immunokleuring.
          2. Western blots, terwijl een mogelijke eerste keus voor knockdown efficiëntie, kan worden te ongevoelig voor low-level immuun signalering in verband met de niet-schadelijke fenomeen van de SD.
          3. Daarom hebben we gevolgd negatieve Western blot metingen met zilveren verbeterde diaminobenzidine (DAB) immunokleuring en computer-based densitometrie metingen (zie hieronder).

6. Proteomics bevestigingen

  1. Cel specificiteit van fosfoproteïne veranderingen is vastgesteld aan de hand immunokleuring. 6,7
    1. Fix slice culturen voor 24 uur met PLP fixatief bestaande uit:
      1. 10 ml 16% paraformaldehyde, 1,096 g lysine, 0,42 g natrium fosfaat, en 0,17 g natrium perjodaat, gevuld tot een totaal volume van 80 ml met ultrapuur water (fixatief is 6,2 pH).
      2. Na 24 uur, verwijder voorzichtig slice culturen uit de inzetstukken met een fijn penseel en transfer naar het PBS met natriumazide (100 mg / L) tot klaar om sectie.
      3. Dan, incubeer plakjes minimaal 24 uur in PBS-20% sucrose, knippen hele slice culturen tot 20 urn secties en monteren aan gel coating dia's.
      4. TL-immunokleuring (bijvoorbeeld voor NFκB) wordt bereikt als volgt met alle stappen gekoppeld aan schudden bij ~ 50 rpm.
        1. Was slice culturen in 3 mL PBS drie keer voor 10 minuten.
          1. Plaats de glaasjes met 20 micrometer slice culturen gemonteerd in Coplin potten met ~ 40 ml PBS voor alle wasstappen.
        2. Was slice culturen in PBS drie keer, tien minuten per wasbeurt.
        3. Leg een paar druppels SFX-signaal versterker aan slice culturen en incuberen in een vochtige kamer gedurende 30 minuten.
        4. Incubeer slice culturen gedurende 2 uur bij 37 ° C met konijn anti-NFκβ antilichaam op 1:100 verdund in 0,75% Triton X-100 in PBS.
          1. Pipetteer antilichaam oplossing direct op plakken.
        5. Verwijder de segmenten van antilichaam-oplossing en was drie keer in PBS gedurende 10 min. per wasbeurt.
        6. Incubeer plakken bij kamertemperatuur gedurende een uur in de geit anti-konijn AlexaFluor 594 antilichaam om 1:50 in 0,75% Triton X-100 in PBS.
          1. Centrifuge AlexaFluor 594 antilichamen gedurende 15 min bij 10000 rpm aan een neerslag die kan hebben gevormd in de oplossing te verwijderen.
        7. Was drie keer in PBS, 10 min. per wasbeurt.
        8. Dompel dia's in gedestilleerd water af te spoelen eventuele zouten van PBS.
        9. Dekglaasje met ProLong antifade medium en laat drogen gedurende minstens 2 uur, overdekte weg van het licht.
        10. Visualiseer met traditionele of confocale (afb. 7) fluorescentie microscopie.
  2. Eiwitproductie verandert van siRNA knock-down kan gevoelig worden beoordeeld door het verbeteren van de traditionele DAB immunokleuring 7 via zilver intensivering 16 en de daaropvolgende densitometrische kwantificering (bijvoorbeeld zoals hier getoond voor cyclophilin B) (Video figuur 2).
    1. Immunokleuring voor cyclophilin B volgt de standaard procedures voor helderveld imaging we onlangs gedetailleerde, 7 met behulp van:
      1. Anti-muis cyclophilin B (1:100) voor 24 uur bij 4 ° C;
      2. Gevolgd door mierikswortelperoxidase secundair antilichaam labeling (1:100);
      3. En DAB visualisatie.
    2. f de DAB reacties zijn te zwak om digitale densitometrische quantification17 toelaten, kunnen ze worden geïntensiveerd, met een gedifferentieerd zilveren procedure volgens Quinn en Graybiel. 16
      1. Rehydrateren dia's en daarna goed x 3 wassen gedurende 10 minuten in zuiver water.
      2. Plaats de glaasjes in zuiver water in een pot en Coplin warm tot 56 ° C.
      3. Bereid ammoniakale zilvernitraatoplossing (0,5%):
        1. Stock ammoniumchloride (25-30%) is vers verdund (1:1) met zuiver water.
        2. Voeg ammoniumhydroxide (~ 500-600 il per 100 ml) druppelsgewijs onder roeren tot de 0,5% zilvernitraatoplossing dat kort zal troebel worden en dan duidelijk.
        3. Verwarm de oplossing tot 56 ° C.
        4. Incubeer secties voor 10-12 minuten.
      4. Was dia's voor 15 sec in zuiver water (dit en alle volgende stappen zijn gedaan bij kamertemperatuur met behulp Coplin potten).
      5. Dompel dia's voor 15 sec in 1% natriumthiosulfaat (pentahydraat).
      6. Dompel dia's voor 15 sec in zuiver water.
      7. Toon de dia's voor 2 minuten in 0,2% goud chloride.
      8. Dompel de dia's in hoge zuiverheid water gedurende 15 sec.
      9. Expose de dia's tot 0,5% oxaalzuur gedurende 2 minuten.
      10. Dompel de dia's voor 15 sec in zuiver water.
      11. Behandel de dia's voor 5 min in 5% natriumthiosulfaat.
      12. Was dia's grondig in zuiver water, drogen en dekglaasje aan.
      13. Dia's zijn nu klaar voor densitometrische kwantificering. 17
        1. Alle apparatuur, inclusief helder veld verlichting wordt ingeschakeld voor ten minste 20 minuten voor de beeldvorming.
        2. Hele slice cultuur secties worden afgebeeld op 5-10x op een omgekeerde microscoop.
        3. Lichtintensiteit is ingesteld op een uniform niveau (bijvoorbeeld ~ 2,6 V) en niet veranderd is in alle foto acquisities.
          1. Neutrale dichtheid filters worden gebruikt als nodig is om volledige beeld doorgelaten licht intensiteit aan ~ 1500 op een 12-bits schaal (0 tot 4095) waarbij "0" is volledig zwart en 4095 is helemaal wit te verminderen.
        4. Digitale beelden worden dan verworven en elektronisch opgeslagen voor alle (dat wil zeggen, sham-controle en experimentele monsters), inclusief een achtergrondafbeelding afgeleide vorm een ​​gedeelte van de dia zonder slice cultuur secties.
        5. De achtergrond afbeelding wordt afgetrokken van alle beelden (sham en experimenteel) en een oppervlakte van belang (AOI) dat rondom elke slice cultuur en overgedragen geregistreerde lichtintensiteit.
        6. Beeldintensiteit bereik is ingesteld op een constant bereik voor alle experimenten.
        7. Voor de duidelijkheid, resulterende uitgedrukt als een relatieve dichtheid vergelijking met de controlegroep niveaus (Fig. 8).

7. Representatieve resultaten:

Figuur 1
Figuur 1. Slice cultuur elektrofysiologische opname paradigma. Opnemen micro-elektrode wordt eerst geplaatst in de CA3 piramidale neuron laag en vervolgens een bipolaire stimulerende elektrode wordt geplaatst in de dentate gyrus (DG).

Figuur 2
Figuur 2. CA3 evoked potentials veld en synaptisch geïnduceerde verspreiding van depressie. (A) experimenten beginnen met de bepaling van de huidige standaard die nodig is om CA3 gebied veld mogelijke reacties en vervolgens half-maximale intensiteit wordt gebruikt om CA3 gebied evoked potentials gebied te lokken maximaliseren. Dit document van de normaliteit van de opgeroepen synaptische reacties tussen preparaten. Als er een plakje veld van prikkelende bericht synaptische potentialen zijn niet ten minste 3 mV, zijn plakjes weggegooid. (B) Next, trans-synaptisch opgeroepen drempel voor het verspreiden van een depressie is bepaald (rechts, trage reacties), terwijl op hetzelfde moment veld potentialen (links , snelle respons) worden gebruikt om te documenteren dat de voorbereidingen zijn gezond genoeg om 10 Hz stimulatie (bijv. amplitudes van verticale afwijkingen in snel mogelijke records zijn vergelijkbaar) te volgen.

Figuur 3
Figuur 3. Microgliale beweging geassocieerd met een verminderde synaptische activiteit. Uit onderzoek blijkt dat microgliale vestigingen uitbreiden en trekken met een verhoogde synaptische activiteit, maar lange afstand beweging van deze cellen in reactie op synaptische activiteit is niet beschreven in de hersenen ongedeerd. Onze resultaten met behulp van fluorescerende isolectin B4 de etikettering van microglia tonen aan dat een deel van deze cellen lange afstanden te verplaatsen onder normale omstandigheden. Verder wordt het aantal van deze reizen microglia aanzienlijk toegenomen wanneer synaptische activiteit is afgeschaft door de cultuur blootstelling aan tetrodotoxine zoals weergegeven in de bijgevoegde afbeelding. Rode lijnen markeren paden afgelegd door microglia over een periode van 6 uur met blauwe pijlen markeren van de herkomst van een paar voorbeeldige microglia. Kalibratie bar, 50 urn.

Figuur 4
Figuur 4. PCR screening activiteiten. (A) We gebruiken TRIzol samen met Qiagen kits voor RNA-isolatie, aangezien in onze handen, dit resulteert in een significant groter (p <0,001; t-test). RNA opbrengst van de hippocampus slice culturen dan gebruik van Qiagen kits alleen (B) In Daarnaast hebben we regelmatig bevestigen dat onze RNA-extractie procedures van hoge kwaliteit intact RNA te produceren, zoals bepaald door middel van een gel die scherpe RNA bands shows. (C) We NormFinder software te gebruiken om een referentie-gen te kiezen met een beste stabiliteit waarde. Bijvoorbeeld, slice culturen blootnaar lipopolyssacharide (100 ng / ml voor 2 uur) werden geanalyseerd voor drie referentie-genen (Rpl13a, β-actine, 18 jaar). Ct-waarden worden gebruikt om een ​​stabiel waarde te berekenen. Onze gegevens hier [en dat voor andere experimenten met het verspreiden van depressie (gegevens niet getoond)] tonen aan dat Rpl13a is een optimale referentie-gen. (D) Wij gebruiken de "ΔΔCt" methode als een gevoelige en reproduceerbare wijze te vouwen-change RNA verschillen tussen de experimentele groepen en sham controles op te sporen.

Figuur 5
Figuur 5. PCR-reactie controles. (A) We meten verdunning curve amplificaties voor primers als een middel om de kwaliteit van de PCR-reacties te verifiëren. Bijvoorbeeld, een optimale amplificaties tonen een uniform (1-5) verhoging van de Ct drempels. (B) In tegenstelling, amplificaties niet uniform zijn met een slechte primers (1-5). (C) Daarnaast hebben we een smelt curve op de uit te voeren sluiten van PCR-testen om te bevestigen dat de gewenste amplicons worden gedetecteerd (dat wil zeggen, een enkele piek curve), waarin het ontbreken van een dubbelstrengs DNA inclusief primer dimeren aangeeft, verontreinigende DNA en misannealed PCR-product (dat zou verschijnen als meerdere piek curves).

Figuur 6
Figuur 6. Nano voorversterking maakt de ontdekking van IFN-λ in de hippocampus slice culturen. Aangezien slechts ~ 50 T-cellen zijn te vinden in een slice cultuur (van ~ 55,000-90,000 totaal cellen), hebben we de RT 2 nano PreAmp cDNA synthese kit gebruikt als een middel om te detecteren potentiële ultra-lage expressie van IFN-λ. Dit betekent dat van cDNA voorversterking leverde een 12-voudige toename in gevoeligheid voor het niveau RNA. De resultaten bovenstaande illustreren de capaciteit van de voorversterking om detectie gevoeligheid te verhogen. Ct drempel voor referentie-gen Rpl13a was 20,5 met een eerste versterking en dit werd verhoogd tot 14,1 met het gebruik van de voorversterking kit, een 12-voudige toename die overeenkomt met 12 cycli van de PCR-amplificatie van cDNA. Parallel, IFN-λ was niet detecteerbaar (0.0), maar was goed binnen detectie bereik (29,0) met voorversterking.

Figuur 7
Figuur 7. Aangeboren cytokine pad fosfoproteïne fosforylering veranderingen. (A) Voorbeeldige effect van TNF-α voorbehandeling (dat wil zeggen, neuroprotectie) op aangeboren cytokine pad fosfoproteïne fosforylering 24 uur na excitotoxische letsel in de hippocampus slice culturen. De resultaten tonen CA1 gebied verandert tussen de plakjes voorbehandeld voor 3 dagen met 100 ng / ml TNF-α voor de blootstelling aan N-methyl-d-aspartaat (NMDA) vergeleken met die blootgesteld worden aan NMDA alleen (dat wil zeggen, experimenteel versus sham) uitgedrukt als een percentage. Merk op dat TNF-α een aanhoudende stijging van de fosforylering JNK en ATF-2, alsmede een tijdelijke toename van NFκB geïnduceerde. (B) De ruimtelijke verdeling van NFκB activering (dat wil zeggen, aanwezigheid van gefosforyleerd NFκB in de kern) wordt onthuld door immunokleuring ( rood). YoYo vlekken kernen groen in een stukje cultuur sectie [bijvoorbeeld in astrocyten (pijlpunt)]. Piramidale neuronen, die anders zou ook de kleur groen, in plaats geel vanwege de gelijktijdige markering met gefosforyleerd NFκB (rood). Kalibratie bar, 25 pm.

Figuur 8
Figuur 8. . Proteoom bevestiging van siRNA efficiency Gedifferentieerde zilver intensivering van de peroxidase-diaminobenzidine op basis van immunokleuring voor cyclophilin B laat zien dat siRNA kan significant (p <0,001; ANOVA-Holm-Sidak methode) wereldwijd de hippocampus plak cyclophilin B uitdrukking te verminderen drie dagen na het aanbrengen van 200, 500 , of 1.000 nM siRNA.

Discussion

SD is een aanvalsgewijs optredende verstoring van de hersenen waarvan de kenmerken zijn sterk geconserveerd in alle soorten en gebieden van de hersenen onderzocht tot nu toe. SD wordt vaak bestudeerd in neocortex. Toch is de neurale circuit complexiteit van deze structuur (in vergelijking met hippocampus), evenals het onvermogen te houden neocortex leven in vitro met rustige immuun functies voor langdurige periodes, maar minder bruikbaar als een te maken in vitro voorbereiding voor het bepalen van de gevolgen op lange termijn van de SD-gevoeligheid. In tegenstelling, hippocampus is niet alleen de hersenstructuur die het meest gevoelig is voor SD, is het ook een archicortical structuur met een meer eenvoudige neurale circuit structuur en functie, die goed geschikt is voor het definiëren van de neuro-middelen waarmee neurale activiteit kunnen moduleren SD gevoeligheid .

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NS-19108), het National Institute of Child Health and Disease (PO1-HD09402), de Migraine Research Foundation en de Witte Foundation. Mw. Marcia P. Kraig bijgestaan ​​bij de voorbereiding en het onderhoud van de cultuur-systemen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010
Earle's Balanced Salt Solution Sigma E2888
Horse Serum Invitrogen 26050-088
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
Fungizone Invitrogen 15295
D-glucose Sigma G8769

Table 1. Culture Preparation and Maintenance: Horse Serum Medium

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Invitrogen 21103
Gem-21 Neuroplex Gemini Bioproducts 400-160-010
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
D-glucose Sigma G8769
Ascorbic acid Sigma A4544
Fungizone Invitrogen 15295
Sodium chloride Sigma S6546
Magnesium chloride Sigma M1028
Calcium chloride Sigma 21115

Table 2. Culture Preparation and Maintenance: Serum-free Medium

Name Company Catalog Number Comments
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) Thermo Fisher PICM0-3050
6-well Falcon culture dishes Thermo Fisher 08-772-1B
Sytox Green Invitrogen S7020

Table 3. Materials fabrication: Ground Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary tubes A-M Systems, Inc. 2mm x 1.16mm, 4 inches
KCl Sigma P5405
Agar Fisher Scientific A360
EDTA Sigma 5134
Tubing Masterflex 95809-34
1.5 mL centrifuge tube rack Fisher Scientific
Silver wire Medwire AG15X
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
Emery board Walgreens
Scintillation vial Fisher Scientific
Flexible adhesive sealant Amazing Goop
Bleach Clorox

Table 4. Materials fabrication: Ground Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Borosilicate filament Sutter Instruments BF150-86-10 1.5 x 0.86 mm
Micr–lectrode puller Narashige PE-2
Eye piece optical micrometer Zeiss
Stage optical micrometer Zeiss
Compound Microscope Zeiss
Microscope slides Surgipath 00210
1-Dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MO-10
3-dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MM-3
Adhesive putty Scotch
100 mm Nalgene containers Fisher Scientific

Table 5. Materials fabrication: Recording Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Teflon-coated platinum iridium wire A-M Systems 7780 125 μm bare, 200 μm coated
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
30 gauge wire Tensolite
Soldering iron Cooper Tools UTC 100
Solder Bernzomatic Resin core, lead free, silver bearing
Concentrated HCl Fisher Scientific A144-212
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-30
Water-resistant epoxy JB Weld
Banana jacks Newark Electronics

Table 6. Materials fabrication: Stimulating Electrodes

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 35 mm culture dish Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Cotton squares Walgreens
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Tubing Masterflex 95809-34
Poly vinyl chloride film Fisher Scientific 01810 18 inches x 1000 feet
#9 single edge razor blade Smith

Table 7. Materials fabrication: Recording Dishes

Name Company Catalog Number Comments
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
pH meter Beckman 250 Battery operated
Mini Type-T thermocouples Physiotemp IT series
DigiSense thermometer Cole-Palmer 8528-10
Inline heater Warner Instruments SH278
Gibraltor table Burleigh
Inverted microscope Leica DMIRE2
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541
Cautery tool Gemini Battery operated
Micr–lectrode micromanipulators Narashige WR60 Left and right
Stabilized power supply MGE UPS systems Ellipse 1200 +/- 5 volts (120 total)
Axoprobe amplifier system Axon instruments 1-A
Active filter Frequency Devices Model 900
Axoscope Digidata Axoscope 1322-A
Axoscope software Axoscope v. 9
Computer systems Dell Precision T5400
Origin8 OriginLab Corp v. 8.1
Stimulator isolation unit Bak Electronics, Inc. BSI-II
1/2 inch position magnets Dexter PMO90-3
3 inch position magnets Dexter PMC-800T
Multiple X-Blocks Narishige X-12 For positioning ball joints
Valves Hamilton HVD-3 For medium delivery
Syringe pump Razel A99
Digital oscilloscope Agilant technologies
Digital camera system Quant EM 512-SC
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Microscope objective focus with Pi foc Physik Instrumente E-662.LR
Smart shutter Lambda SC
Dual wavelength fluorescent microscopy Applied Scientific Instruments Polychrome II
Peristaltic pumps Masterflex 77120-62
Aspirator Harvard Apparatus PDMI component

Table 8. Electrophysiological Setup

Name Company Catalog Number Comments
1 M Magnesium Chloride Sigma 057K8620
1 M Manganese Chloride Sigma 018K6107
1 M Calcium Chloride Sigma GA10984
AlexaFluor594-tagged Isolectin-IB4 Invitrogen I21413
Neurobasal Invitrogen 21103
Polyvinyl chloride film Fisher Scientific 01810
MetaMorph Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DMIRE2
Camera QuantEM 512SC
UV light Kubler CODIX
Bipolar Temperature Controller Medical Systems Corp TC-202
Smart shutter Lambda SC
Sytox Green Invitrogen S7020
Falcon 35 mm culture dishes Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Tubing Masterflex 95809-34
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
Gibraltor table Burleigh
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541

Table 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures

Name Company Catalog Number Comments
RNAlater Ambion AM7021
RNase/DNase-free 1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Diamond knife Fine science tools 10100-00
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
TRIzol Invitrogen 15596-026
Centrifuge Eppendorf 5451C
Vortex-genie VWR G-560

Table 10. PCR Preparation: Slice Culture Harvest

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Sigma C-2432
Centrifuge Eppendorf 5451C in cold room
Ethanol, 200 proof for molecular biology Sigma E7023
RNeasy Micro kit Qiagen 74004

Table 11. PCR Preparation: RNA Extraction

Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 2000 Thermo Fisher ND-2000
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid Sigma M-1254
ssRNA ladder NEB N032S
Sodium acetate Sigma S-9513
EDTA Sigma E5134
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000

Table 12. PCR Preparation: RNA Quantification

Name Company Catalog Number Comments
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1
iCycler iQ PCR plates, 96 well Bio-Rad 2239441
Flat cap strips - optically clear. 8-cap strip Bio-Rad TCS0803
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8890
iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 170-8880
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
10x TAE buffer GibcoBRL 15558-026
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Name sequence
TNF-α F 5’ - ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3’
TNF-α R 5’ - CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3’
Rpl13a F 5’ - TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3’
Rpl13a R 5’ - CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3’

Table 13. PCR Activities: qPCR primer optimization and pre-screening

Name Company Catalog Number Comments
RT2 Profiler PCR array SABiosciences PARN-021
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis kit SABiosciences C-06
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis primer mix SABiosciences PBR-3021
RT2 SYBR Green/ fluorescein qPCR master mix SABiosciences PA-011
RT2 qPCR Primer Assay for Rat IFN-λ SABiosciences PPR45050C
Multichannel pipettor Corning
25 mL Bio-pure reservoir with divider Diversified biotech REBP-2000
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1

Table 14. qPCR array plates and low level signaling

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Fisher Scientific Micro 7
Cell lysis kit Bio-Rad 171-304011
BSA protein stock Bio-Rad 500-0007
BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225
Sealing tape Bio-Rad 2239444
96-well plate reader Perkin Elmer 1420-multilabel counter
Phospho 6-plex Assay Lysates Bio-Rad X7000000502
Phospho 6-plex coupled beads Bio-Rad X700000050

Table 15. Multiplex Phosphoprotein Assay

Name Company Catalog Number Comments
Accell 5x siRNA Buffer Thermo Scientific B-002000-UB-100
Accell siRNA Delivery Medium Thermo Scientific B-005000-100
Accell Cyclophilin Pool-Rat Thermo Scientific D-001920-30-05

Table 16. siRNA

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Lysine Sigma L-6001
Sodium phosphate Fisher Scientific S374-1
Sodium periodate Sigma S-1878
Sodium azide Sigma S-2002
Cryostat Leica CM3050 S
Tissue-Tek Ted Pella Inc. 27050
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
Tissue slides Surgipath 00210
Coplin jars Fisher 08-815
Hydrogen peroxide (30%) Sigma H1009
SFX signal enhancer Invitrogen A31631
Goat serum Colorado Serum Company CS 0920
Triton X-100 Sigma T-8787
Anti-NFκβ antibody Santa Cruz SC-109
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012
Yo-yo nuclear counterstain Invitrogen Y-3601
ProLong antifade Invitrogen P7481

Table 17. Proteomic Confirmation Via Immunohistochemistry

Name Company Catalog Number Comments
Anti-cyclophilin B R&D Systems MAB5410
3,3-diaminobenzidine Sigma D8001
Water bath Pharmacia Biotech 56-1165-33 Gebrüder HAAKE GmbH
Ammonium hydroxide J.T.Baker 9721-03
Silver nitrate Sigma S-0139
Sodium thiosulfate (pentahydrate) J.T.Baker 3949-01 &nsp;
0.2% gold chloride Sigma G-4022
Oxalic acid Sigma O-0376
CoolSnap fx CCD camera Photmetrics
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DM IRBE
Neutral density filters Chroma 0.5-3.0 optical density unit range

Table 18. Proteomic Confirmation Via Silver Enhanced Immunohistochemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18, (9), 3416-3425 (1998).
  2. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25, (15), 3952-3961 (2005).
  3. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha. J Neurosci. 28, (47), 12199-12211 (2008).
  4. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, (4), 319-331 (1996).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Mitchell, H. M., White, D. M., Domowicz, M. S., Kraig, R. P. Cold pre-conditioning neuroprotection depends on TNF-αlpha and is enhanced by blockade of interleukin-11. J Neurochem DOI. (2010).
  7. Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning. J Vis Exp. (43), (2010).
  8. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17, (1), 26-43 (1997).
  9. Grinberg, Y. Y., Milton, J. G., Kraig, R. P. Spreading depression sends microglia on Lévy flights. PLoS ONE. 6, (4), (2011).
  10. Koroleva, V. I., Oitzl, M. S., Bures, J. Threshold of synaptically elicited cortical spreading depression: drug-induced changes in rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 60, (1), 55-64 (1985).
  11. Gubern, C. Validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR in in-vivo and in-vitro models of cerebral ischaemia. BMC Mol Biol. 10, 57-57 (2009).
  12. Tian, Y. F. The quantification of ADAMTS expression in an animal model of cerebral ischemia using real-time PCR. Acta Anaesthesiol Scand. 51, (2), 158-164 (2007).
  13. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, (9), e45-e45 (2001).
  14. Bustin, S. A. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55, (4), 611-622 (2009).
  15. Pusic, A. D., Kraig, R. P. Inflammatory gene micro array profiling demonstrates "T-cell-like" activation after recurrent spreading depression - implications for migraine pathogenesis. Soc Neurosci abst. (2010).
  16. Quinn, B., Graybiel, A. M. A differentiated silver intensification procedure for the peroxidase-diaminobenzidine reaction. J Histochem Cytochem. 44, (1), 71-74 (1996).
  17. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369, (1), 93-108 (1996).
Modellering Neurale Immune Signalering van episodische en chronische migraine gebruik verspreiden Depressie<em> In Vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).More

Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter