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Neuroscience

Modélisation Neural signalisation immunitaire de migraine épisodique et chronique utilisant Dépression épandage In Vitro Published: June 13, 2011 doi: 10.3791/2910
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Neurology and Committee on Neurobiology, The University of Chicago Medical Center, 2Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Migraine et sa transformation à la migraine chronique sont immenses fardeaux de la santé qui ont besoin d'options de traitement améliorées. Nous cherchons à définir comment neurones signalisation immunitaire module la susceptibilité à la migraine, modélisés

Abstract

Migraine et sa transformation en une migraine chronique sont des charges de la santé qui ont besoin d'options de traitement améliorées. Nous cherchons à définir comment neurones signalisation immunitaire module la susceptibilité à la migraine, modélisé in vitro en utilisant la dépression épandage (SD), comme un moyen de développer de nouvelles cibles thérapeutiques de la migraine épisodique et chronique. SD est la cause probable de l'aura de migraine et la douleur migraineuse. C'est une perte de la fonction neuronale paroxystique déclenchée par l'activité neuronale d'abord augmenté, qui se propage lentement dans les régions cérébrales sensibles. Fonctionnement normal du cerveau est extrêmement sensible aux, et s'appuie sur, coïncidant bas niveau de signalisation immunitaire. Ainsi, neurales signalisation immunitaire affecte vraisemblablement l'activité électrique du DD, et donc la migraine. Des études perception de la douleur du DD dans des animaux entiers sont source de difficultés, mais des animaux entiers sont bien adaptés à examiner les aspects des systèmes de biologie de migraine depuis SD active trijumeau voies nociceptives. Cependant, les études animales toute seule ne peut pas être utilisée pour déchiffrer les mécanismes cellulaires et circuits neuronaux du DD. Au lieu de cela, dans des préparations in vitro où les conditions environnementales peuvent être contrôlées sont nécessaires. Ici, il est important de reconnaître les limites des tranches aiguës et des avantages distincts des cultures tranche de l'hippocampe. Tranches de cerveau aiguë ne peut pas révéler des changements subtils dans la signalisation immunitaire depuis la préparation des tranches déclenche seul: pro-inflammatoires changements qui durent des jours, le comportement épileptiforme due à des niveaux élevés de tension d'oxygène nécessaire pour revitaliser les tranches, et les blessures cellulaires irréversibles dans les centres tranche anoxique.

En revanche, nous examinons la signalisation immunitaire dans les cultures matures tranche de l'hippocampe, depuis les cultures de près parallèles en contrepartie de leur in vivo avec la fonction trisynaptic matures; montrent les astrocytes de repos, la microglie, et les niveaux de cytokine et SD est facilement induite dans une préparation non anesthésiés. Par ailleurs, les tranches sont de longue durée et SD peuvent être induites sur plusieurs jours consécutifs sans blessure, ce qui rend cette préparation le seul moyen à ce jour capable de modéliser les conséquences des maladies chroniques neuro SD, et donc peut-être de migraine chronique. Nous utilisons des techniques d'électrophysiologie et d'imagerie non invasive pour mesurer cellules neuronales et les fonctions du circuit qui coïncide avec les cartes SD. Neural immunitaires variables de l'expression des gènes sont mesurés avec le dépistage qPCR, tableaux qPCR, et, surtout, l'utilisation de préamplification ADNc pour la détection de cibles de niveau ultra-faible, comme l'interféron-gamma à l'aide de cellules entières, régionales ou spécifiques améliorée (par microscopie de dissection laser) l'échantillonnage. Cascade de signalisation des cytokines est encore évaluée avec des objectifs liés aux phosphoprotéine multiplexés l'expression des gènes et des changements phosphoprotéine confirmée par immunomarquage spécifique des cellules. Stratégies pharmacologiques et siARN sont utilisés pour imiter et de moduler la signalisation SD immunitaire.

Protocol

Plusieurs points méritent d'être soulignés pour la réussite des études de signalisation SD liées au système immunitaire dans des tranches de cerveau. Premièrement, les stimuli doivent initier synchrone dépolariser un volume suffisant de la matière grise du cerveau pour initier SD. Cela signifie une interface de configuration (par exemple, l'exposition aux liquides seulement au-dessous et l'échange gazeux au-dessus d'insérer la culture tranche) est requise. 1,2 seconde, des tranches de cerveau aiguë soutenir SD, mais un traumatisme de leur préparation, ainsi que l'utilisation de 95% d'oxygène aéré la solution de Ringer générer des pro-inflammatoires changements et les comportements épileptiformes, respectivement, ce qui peut altérer la fonction des circuits neuronaux et de l'homéostasie immunitaire. 3 Troisièmement, tandis que les cultures tranche hippocampique surmonter ces limitations tranche aiguë, il est important de noter que les cultures tranche devrait être maintenue pour des périodes adéquates avant l'utilisation (par exemple, plus de 10 jours in vitro), de sorte que la microglie et les astrocytes deviennent quiescentes. 3-5 Enfin, le DD devrait être induite en utilisant des techniques stériles et aseptiques. Les techniques décrites ci-dessous sont conçus pour répondre à ce besoin.

1. Répandre la dépression dans les cultures Slice

  1. Préparation de la Culture et de la maintenance.
    1. Trancher les cultures sont préparés et conservés dans les chevaux à base de sérum moyen ou un milieu sans sérum (SFM) 6,7, comme décrit précédemment 8 avec des modifications mineures à la moyenne. Paramètres d'incubation sont de 36 ° C, 5% de CO 2, 95% d'humidité d'équilibre de l'air.
      1. Nous constatons que les cultures peuvent être passés à un SFM après 18 jours in vitro et maintenu à au moins 35 jours in vitro par l'utilisation de nos GDF précédemment défini qui comprend plus de calcium et de magnésium.
      2. En outre, les antibiotiques et une antifungicide sont ajoutés pour prévenir la contamination infectieuse associée à des épisodes d'enregistrement multiples.
      3. Cette formulation de longue durée milieu (ou enregistrement) contient (pour 100 ml): moyen Neurobosal, 97 ml; Gem-21, 2,0 ml; Glutamax (200 mM), 0,5 mL; gentamycine (10 mg / ml), 10 pl; D-glucose (45%), 680 ul; acide ascorbique (0,5 M), 100 ul; Fungizone, (250 mg / ml), 400 ul; NaCl (5,0 M), 820 ul, Mg 2 Cl 2 (1,0 M) , 80 pl; CaCl2 (1,0 M), 160-240 ul.
      4. Les cultures sont utilisés pour la SD à partir de 21-35 jours in vitro.
    2. Vérification de la vitalité. 3,6,7
      1. Les cultures sont projetés des preuves de la mort des neurones pyramidaux avant utilisation.
        1. A 18 jours in vitro, les inserts sont incubées pendant 20 min dans le milieu (dans des conditions normales d'incubation) contenant 5 uM Sytox vert, un marqueur qui devient fluorescent lorsqu'il se lie à l'ADN (par exemple, en pénétrant dans les cellules mortes).
        2. Les inserts sont ensuite transférés vers leur moyenne précédente et examiné par microscopie à fluorescence (504 523 d'excitation et d'émission) des preuves de CA3 ou CA1 blessures couche pyramidale neurone.
          1. Tranches de plus de 20 cellules ou d'un niveau normalisé de plus de fluorescence de 250 UI ont été exclus de l'utilisation ultérieure.
  2. Matériaux de fabrication.
    1. Électrodes de masse sont fabriqués avec des tubes de verre (2,0 mm de diamètre extérieur / 1,16 mm ID) coupé à 4,5 mm de longueur et brièvement polies au feu aux deux extrémités.
      1. Nous faisons environ 20 électrodes à la fois, qui peut durer plus d'un an.
      2. Apportez de 100 mL de KCl 1M à ébullition et ajouter, en agitant, 3,5 g d'agar et de 0,5 g d'EDTA (acide éthylènediamine sel disodique dihydraté) pour produire une solution jaune clair.
      3. Utilisez une courte longueur de tuyau flexible équipé sur chaque tube de verre de tirer chaude KCl / agar solution dans les tubes de verre ainsi que sur une courte distance dans le tube flexible.
        1. Aspiration de presse et de permettre au KCl / agar au goutte à goutte lentement de la pointe ouverte d'un tube de verre, puis maintenez la pointe de verre ouverte tube contre un morceau de glace.
        2. La manœuvre dernière demandera à l'agar au gel à l'extrémité de l'électrode et non gel après recul de remonter dans le tube de verre.
      4. Une fois l'agar-agar a gélifié dans l'eau froide, le tube flexible peut être retiré sans altérer l'agar placé dans les tubes de verre.
      5. Placer 0,5 ml de 1 M de KCl dans chaque puits d'un rack centrifuger de 1,5 ml tube. Ensuite, placez une extrémité de chaque tube de KCl / agar en verre rempli de puits individuels.
      6. Ensuite, maintenez une longueur de 80 cm de fil d'argent de calibre 15 avec une pince hémostatique et propre de chacun des quatre côtés en grattant le fil par un conseil d'Emery lieu pour le comptoir.
      7. Coupez le fil en 4 cm de longueur et les placer dans un flacon à scintillation rempli de javel pendant 20-30 minutes pour placer une entreprise Ag-AgCl couche sur la surface de l'argent à nettoyer.
      8. Pliez chaque fil en deux et insérer les extrémités libres à une extrémité du tube de verre rempli wiKCl e / agar-agar, en laissant environ 4-6 mm exposés.
      9. Enfin, le manteau de la tige tube de verre contenant le fil d'argent et une faible mesure du fil avec Goop, une colle résistant à l'eau et flexible, afin de prévenir le KCl / agar de sécher. Répétez l'opération pour toutes les électrodes. Laisser sécher la colle durant la nuit.
      10. Stocker les électrodes à 4 ° C dans des flacons à scintillation (5-6 électrodes / flacon) contenant environ 5 mL 1 M KCl et 25 mg d'EDTA, ce qui retarde considérablement la croissance bactérienne.
    2. Les électrodes d'enregistrement sont fabriqués à partir de 1,5 mm de diamètre (0,86 mm ID, 10 cm de longueur) des tubes en verre borosilicate avec des filaments (Figure 1 vidéo).
      1. Tirez microélectrodes d'une pointe fine avec des tubes de verre courtes tiré à une extrémité pointue.
        1. En général, nous tirez électrodes ~ 7,5 cm de longueur avec un cône de 1 cm. Cela permet positionnement adéquat et la visualisation extrémité de l'électrode.
        2. Les électrodes sont tirés avec une Narishige PE-2 extracteur.
        3. Conseils de microélectrodes sont brisés revenir à 2-4 um sous visualisation en utilisant un microscope composé équipé d'un micromètre calibré optique. Nous utilisons le bord d'une lame d'histologie de verre standard (25 x 75 x 1 mm) attachés à un système hydraulique unidimensionnelle micromanipulateur détenu par un autre manipulateur 3 dimensions pour casser doucement les astuces de microélectrodes.
          1. Tout d'abord, l'électrode est monté attaché à une lame de microscope à l'aide d'argile.
          2. Puis la lame est placée sur le porte-lame de microscope qui est utilisé pour déplacer la pointe de microélectrodes sur le bord du verre glissé attaché au manipulateur hydraulique.
          3. Enfin, la pointe de la microélectrode est doucement rompu en le pressant contre le bord lame de microscope à commande hydraulique.
    3. Électrodes de stimulation sont tordus électrodes bipolaires de fil parce que:
      1. Ils permettent l'enregistrement des potentiels de champ évoqués qui, autrement, serait obscurci par l'artefact de stimulation de la stimulation monopolaire.
      2. Une électrode de stimulation bipolaire peut être doucement appliquée à la surface gyrus denté, sans blessure, contrairement électrodes bipolaires pointu.
      3. Enfin, courant appliqué est localisé à la transversale (nus) des surfaces circulaires de l'isolation des fils en téflon utilisé pour l'électrode.
        1. Électrode de stimulation de fabrication commence par couper ~ 20 cm de longueur de platine-iridium (diamètre 125 um nu; diamètre de 200 um couché) et de fils revêtus de téflon. Ensuite, pliez la longueur en deux et attacher les bouts dans un noeud lâche carrés, laissant environ 2 cm du noeud à l'extrémité du fil.
        2. Fixez le nœud dans le mandrin d'une perceuse électrique placé sur une table.
        3. Tout en tenant l'autre extrémité du fil avec une pince hémostatique, mettez brièvement la perceuse sur et en dehors jusqu'à ce que le fil est bien tordu (c'est à dire, chaque surface de coupe serait une égale distance de l'autre lorsque le fil est coupé dans le sens transversal, sans démêler ).
        4. Ensuite, les extrémités dénudées des fils de platine-iridium tordus ont besoin d'être attachés à fils de plomb utilisé pour connecter l'électrode de stimulation à un isolateur de relance.
          1. Cela se fait en soudant les extrémités libres du fil de platine-iridium à ~ 50 cm fils de calibre 30.
          2. D'abord, le ruban du fil de platine-iridium tordu pour une paillasse et déposer une flaque d'acide chlorhydrique concentré sur une extrémité libre du fil torsadé.
            1. Ensuite, enlevez environ 1 cm d'isolation de chaque fil en utilisant un coupe-fil.
            2. Placez l'extrémité dénudée sur un fil de plomb adjacent à l'extrémité du câble torsadé et d'appliquer la chaleur d'un fer à souder à pointe fine, puis souder jusqu'à ce que les deux fils sont solidement attachés.
          3. Glissez une petite longueur de gaine thermorétractable sur la connexion de fil exposés et rétrécir l'adapter à la chaleur.
          4. Répétez l'opération pour le deuxième fil.
          5. Incendie polonaise de la pointe d'une pipette Pasteur et 15 cm de guider les tordus platine-iridium fil bas de la pipette jusqu'à environ 6 cm de la saillie à tordues sur.
          6. Utilisez un époxy hydrofuge (par exemple, JB Weld) pour sceller les deux extrémités de l'électrode.
          7. Enfin, joignez les fiches banane pour les extrémités des fils de plomb pour la connexion à l'isolateur de relance.
          8. Sous observation stéréoscopique, placer la pointe de l'électrode dans du PBS et de chercher les bulles produites par électrolyse à partir de seulement venir à la fin du coupé les extrémités des électrodes. Si toutes les bulles viennent du côté des fils torsadés, couper l'électrode avec une coupe transversale en utilisant une seule lame de rasoir nouvelle pointe à rétablir l'isolation intacte aux axes long fil.
          9. Lors du dépannage pour résoudre les effets de stimulation aberrante, essayez de faire une pointe de l'électrode fraîchement coupé.
    4. Enregistrement plats consistent en tant queinsert de culture des poux dans un plat de 35 mm de la culture qui est sur deux 1,0 x 12 tiges de verre mm espacés d'environ 1,0 cm de distance. Fixer des baguettes de verre plat à la base par le chauffage des tubes de verre, puis en les pressant dans la base avec une pince.
      1. Pour les conditions d'enregistrement statique, ajouter 1,5 mL de milieu à l'antenne.
      2. Ensuite, trempez un morceau cm ~ 10 mm de large et 3-4 de longues coton stérile dans 1,0 ml de milieu. Plier le coton en deux le long de l'axe long et placez-le long du puits interne sur l'insert avec des pinces stériles. Le coton humide contribue à maintenir l'humidité plat.
      3. Trois longueurs compressibles 4 mm de tube sont également espacés autour de l'insert.
      4. Couvrir le plat hermétiquement avec un film de polychlorure de vinyle, qui permet les échanges gazeux.
      5. Couper autour de son mi-paroi verticale avec une lame de rasoir bord simple pour enlever l'excès du film de polychlorure de vinyle.
  3. Configuration électrophysiologique
    1. Une assemblée d'insérer tranche culture est placée dans la chambre d'enregistrement pour les enregistrements électrophysiologiques PDMI.
      1. Le montage plat insertion / culture dans la chambre PDMI est couvert par un disque en plastique épais de 2 mm fourni avec la chambre PDMI, avec divers petits trous positionnés comme nécessaire pour les électrodes d'enregistrements, support entrées / sorties des tubes, etc
      2. Nous surveiller périodiquement pH du milieu avec une électrode de pH combinée en miniature et de la température avec un type miniature T sonde thermocouple monté dans un semi-étanche pour assurer microélectrode 7,3 pH et 36,0 ° C conditions.
      3. La chambre d'insertion / est aérée avec de dioxyde de carbone d'équilibrer l'air 5% et milieu est soit statique ou détenues dans un flux (1,2 ml / minute) de configuration avec le centre d'insérer tenu, p. 35-36 ° C.
      4. Pour les conditions d'écoulement, milieu est chauffé avec un chauffage en ligne, à nouveau pour garder le centre de la chambre d'enregistrement à 36 ° C.
        1. Un système de pompe péristaltique avec un limiteur de pression apporte milieu dans les cultures tranche sans pulsations de la pompe. Un aspirateur fourni avec la chambre PDMI est utilisé pour éliminer le milieu de l'insert par aspiration douce.
      5. Pour la stabilité, la chambre est monté sur un spécialement conçu Burleigh-Gibraltar stade de microscope inversé qui détient un microscope inversé et s'assoit sur une table de vibration.
      6. Les petits trous sont ouverts à travers la pellicule de chlorure de polyvinyle insérez un petit outil de cautérisation fonctionnant sur batterie.
      7. Ensuite, si une configuration de débit doit être utilisé, l'entrée et le débit de sortie est commencé, suivi par le placement d'une électrode de masse. Sinon, il suffit de mettre l'électrode de terre en place.
      8. Electrodes, maintenu en place avec micromanipulateurs, sont positionnés juste au-dessus une tranche visualisées avec un microscope inversé à un grossissement de 5x (Fig. 1).
        1. Commencez avec l'électrode d'enregistrement suivie par l'électrode de stimulation.
        2. Nous utilisons un moniteur audio à noter lors de la microélectrode en contact avec la tranche. La pointe est positionnée à mi-chemin le long CA3 couche de cellules du corps pyramidal.
        3. Les enregistrements sont ouvertes, puis l'électrode de stimulation est toucha doucement à la surface médiane du gyrus denté.
        4. Dans les deux cas, les mouvements de l'électrode initiales sont réalisées avec des contrôles grossier, et le positionnement final seulement avec l'hydraulique, contrôle fines utilisant un éclairage en contraste de phase afin que les couches de cellules du corps peuvent être facilement distingués.
        5. Électrodes Advance par incréments de 25 ~ um sous visualisation microscopique direct.
        6. Une fois les électrodes toucher le tissu, l'avance des électrodes une autre de 20 à 30 um.
        7. Les enregistrements sont commencés avant l'électrode de stimulation est mis en place pour être certain que ce ne déclenche pas SD (par exemple, via un stimulus mécanique).
        8. ~ 10 minutes sont autorisés à s'écouler avant que les expériences sont ouvertes.
  4. Transynaptically induite SD.
    1. Optimiser les potentiels évoqués CA3 champ comme suit (fig. 2).
      1. CA3 potentiels sont évoqués sur le terrain avec des impulsions ms 100 (0,2 Hz) en commençant par un courant qui est suffisant pour déclencher une réponse (par exemple, ~ 1-5 mA).
      2. Déplacez l'électrode d'enregistrement par incréments long de l'axe des neurones pyramidaux long jusqu'à ce que le potentiel de champ est maximale.
      3. Ensuite, augmenter le courant de l'électrode d'enregistrement à cette position et noter la réponse maximale actuelle (par exemple, ~ 10-20 mA).
      4. Enfin, utilisez l'intensité du stimulus demi-maximale pour des expériences (par exemple, le contrôle simulacre stimulation périodique).
    2. Déterminer le seuil de synaptiquement évoqué SD (Fig. 2).
      1. Avec les électrodes configuré comme décrit ci-dessus pour les potentiels de champ évoqués, passer du paradigme de la stimulation à un seul, les éclats manuellement évoquéde 10 impulsions (10 Hz à 100 ms / impulsion), un paradigme précédemment appliquée dans les études animales entier.
      2. Augmenter progressivement l'intensité du courant par rafale de relance jusqu'à ce DD est déclenchée. Attendre au moins 60 à 120 secondes entre les stimuli.
      3. Signaler SD seuil en coulombs (ie courant x temps).
    3. Dans d'autres expériences qui nécessitent mesurant les réponses à l'induction de plusieurs DS, utilisez une force de relance susceptibles d'évoquer SD (par exemple, ~ 100-500 nC).
      1. Trigger DS tous les 9 min pendant une heure.
      2. Veillez à utiliser des techniques aseptiques à travers des expériences.
      3. Après la dernière SD, le retour de la culture à l'insertion des conditions d'incubation normale.
        1. Marquer la boîte de culture de noter la culture qui a connu SD.
        2. Notre habitude est de placer une marque unique pour la gauche et deux marques à la droite de l'insert de culture tranche, en notant chacun des trois cultures comme # 1, # 2 et # 3 de gauche à droite.
        3. Changer moyenne tous les 3-4 jours jusqu'à la récolte de la culture.
    4. Pour récurrentes SD, suivez les procédures décrites ci-dessus.
    5. Nous généralement de test pour un changement de DD seuil de 1, 3, 7 et 14 jours après une première heure de multiples DS.
    6. CA3 domaine en pleine potentiels et ralentir les changements potentiels sont enregistrées via séparées systèmes de traitement numérique du signal.

2. Exemplaire Imaging Vital dans les cultures Slice hippocampe

  1. Comportement dynamique fonctionnelle des cellules immunitaires résidentes (ie, les microglies) peuvent également être suivis dans les cultures tranche sans lésion des cellules ou de l'activation immunitaire (Fig. 3) 9.
    1. Par exemple, pour étiqueter les microglies pour évaluer leur mouvement associés aux changements de l'activité synaptique du DD, nous avons utilisé marquée par un fluorophore isolectine-IB 4.
    2. «Lectine PBS" est PBS avec des cations supplémentaires (0,1 mM chacun CaCl 2, MgCl 2, MnCl2) depuis cations bivalents (0,1-1,0 mM) sont nécessaires pour lier lectine à α-D-galactosyl moitiés sur les membranes cellulaires microgliales.
    3. Faire une solution de «lectine PBS":
      1. Pour 1 L de PBS, en utilisant une technique aseptique et la filtration stérile, ajouter:
      2. 100 uL de 1M MgCl 2
      3. 100 uL de 1M MnCl2
      4. 100 ul de CaCl 2 1M
    4. Bien mélanger pour combiner et conserver au réfrigérateur à 4 ° C.
      1. Seuls 500 ul de «lectine PBS" est nécessaire par flacon de isolectine, mais comme il peut être réfrigérés et conservés pendant des mois à un moment, il peut être utile pour combler des volumes plus importants.
    5. Reconstituer AlexaFluor 594-taggés isolectine-IB4 (isolectine) poudre lyophilisée à1 mg / mL dans "lectine PBS".
      1. Afin de minimiser photoblanchiment, effectuez cette étape aussi rapidement que possible, en minimisant l'exposition lumineuse.
      2. Isolectine peut être aliquotés à 20 uL fois reconstitué à 1mg/ml et conservés à -20 ° C jusqu'à un an.
      3. Diluer isolectine à 20 pg / ml dans un milieu de croissance et de cultures tranche incuber à des conditions d'incubation normale 4-10 heures avant l'imagerie.
    6. Imagerie set-up.
      1. Mise en place d'imagerie se compose de: microscope, l'obturateur, l'appareil photo, la lumière, 2,0 de densité neutre filtre, 36 ° C, gaz: 5% de CO2, de l'air (ou 20% d'oxygène, d'azote d'équilibre).
      2. Tourner sur le microscope, caméra, lumière UV, contrôle de température, et les gaz d'au moins une heure avant l'imagerie.
    7. Mettre en place MetaMorph Imaging Protocol.
      1. Depuis le «Journal» dans le menu déroulant, choisir "Exécuter ...". Journal
      2. Ceci devrait conduire à l'ouverture du dossier REVUES, à partir de laquelle vous devez sélectionner «Motion w-var AFS (Journal préalablement établi qui suit les étapes ci-dessous)", cliquez sur «Ouvrir».
      3. La "fréquence Autofocus" fenêtre pop up suivant, continuez Nombre à 1, cliquez sur "OK".
      4. Ensuite, la configuration "Fichier séquentiel Na ..." fenêtre pop up, tout garder tel quel:
        1. Nom de base: Image;
        2. Numéro d'image: 1;
        3. Largeur Nombre: 3;
        4. Enregistrer sous Type: MetaMorph TIFF;
        5. si l'image existe déjà -> Ecraser automatiquement;
        6. Cliquez sur "Select Directory ...", ce qui cause la" Rechercher un dossier "fenêtre pop up. Ici, sélectionnez le dossier (ou créer un nouveau dossier) où les trames film devrait être sauvés.
        7. Puis, quand le bon dossier (par exemple C: \ Data \ Dossier Nouvelle) est affichée en bas de la "Na Setup fichier séquentiel ..." fenêtre, cliquez sur "OK".
        8. Dans la fenêtre Acquire:
          1. Sélectionnez le réglage dans le coin inférieur gauche pour être DiIMGBIN2;
          2. "Temps d'exposition": 20ms; «binning»: 1.
        9. Puis, dans l'onglet spécial:
          1. "Mode capteur": FT;
          2. "Digitizer »: 10MHz (Gain EM);
          3. "Gain": Gain3 (3x);
          4. Sélectionnez «EM Gain: 45"; obturateur de caméra: Ouvert pour exposer; mode Effacer: Effacer EXP PRE, le comte clair: 2, Trigger Mode & Trigger Mode Live: Normal (MINUTERIE).
        10. "Cadres à AVG": 3.
        11. Cliquez sur «Fermer».
    8. Après la mise en place de l'imagerie MetaMorph, placer l'insert dans une boîte de culture 35mm avec deux tiges de verre 1 mm dans le fond.
      1. Placer trois pièces 2 mm de tube en caoutchouc monté entre les parois de l'insert et la boîte de culture à stabiliser davantage l'insertion.
      2. Placer un morceau ~ 10 mm de largeur de coton imbibé d'un supplément de 1 mL de milieu intérieur de l'insert de maintenir un environnement humidifié. Assurez-vous que ce soit au ras des murs et loin des coupes d'hippocampe.
      3. Couvrez le haut de la boîte de culture hermétiquement avec un film de polychlorure de vinyle pour éviter la perte de liquide.
    9. Assurez-vous que l'accent de l'imagerie est la couche de cellules CA3 pyramidale. Notez l'orientation de la tranche en prenant des photos de phase à 5x, 10x, 20x et.
    10. Dans le champ "Trouver Focus" fenêtre qui apparaît sur l'écran, plage définie, courant + / - d'être «8», et précision, en microns (s), soit "1" (les deux cases au fond doit être cochée) .
    11. Cliquez sur "Trouver Focus" pour garantir une image de mise au point.
    12. Dans le "Acquérir Timelapse" fenêtre, sélectionnez intervalle de temps à "1 minutes", et la durée pour être "6 heures" (ce sont nos paramètres d'acquisition de préférence).
      1. Pour saisir avec précision les mouvements de la microglie, l'imagerie ne doit pas être moins fréquentes que une fois par minute.
    13. Dans le stockage d'images, sélectionnez la pile.
    14. La boîte de fenêtre Mise à jour d'image doivent être vérifiés, mais pas les deux autres cases en dessous.
    15. Sélectionnez "Illum" être "Lambda".
    16. Cliquez sur "OK".
    17. Le film va maintenant commencer à courir. Cela signifie que rien ne peut être effectuée au sein du programme MetaMorph jusqu'à la fin du film ou jusqu'à ce que vous arrêter le film au début en cliquant sur Echap, après quoi le film s'arrête alors à l'étape d'acquisition chronométrée suivante.
    18. A la fin du film, vérifier lésion des cellules par le dépistage Sytox comme indiqué plus haut (A).

3. Extraction de l'ARN de bas niveau de cytokine de signalisation 11-15

  1. Nous avons déjà présenté des instructions détaillées pour la détection de bas niveau de cytokine de signalisation dans les cultures tranche en utilisant qPCR et des techniques de PCR array 6,7.
  2. Nous avons nettement amélioré la sensibilité de nos approches pour la détection des ARNm des cytokines dans les cultures de tranche et de présenter ces améliorations ici.
  3. Les améliorations comprennent notre approche de la récolte des tissus et d'isolement d'ARN, la présélection des échantillons pour facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) le changement, et preamplfication ADNc, qui sont ~ 6 fois plus sensible que les techniques précédentes et, par exemple, permettre la détection de la première fois de la culture tranche de l'interféron-gamma (IFN-λ) de détection 15.
  4. Préparation de la PCR.
    1. La récolte de la culture Slice.
      1. Expériences suivantes, inserts de culture tranche sont immergés dans 2-3 mL ARN tard et conservés à 4 ° C jusqu'à 3 jours jusqu'à traitement ultérieur.
      2. Pour la récolte, supprimez étrangers (ie, les tissus adjacents à l'hippocampe) des tissus en utilisant un couteau de diamant et soulever les tranches en individuels RNase / DNase gratuitement des tubes de 1,5 ml contenant 0,5 centrifugeuse phosphates ml tamponnée stérile (PBS) en utilisant une peinture fines pointes brosse.
      3. Échantillons Spin (10000 rpm x 1 min) dans un mode stéréotypé pour toutes les tranches adhérer au même côté de leurs tubes.
      4. Retirer du PBS surnageant et remettre en suspension dans l'échantillon 500 TRIzol ul.
      5. Conserver les échantillons à -80 ° C ou de garder sur la glace jusqu'à l'extraction d'ARN.
    2. Extraction de l'ARN usingTRIzol avec les résultats RNeasy Kit Micro dans le rendement en ARN supérieure (fig. 4) que l'utilisation du kit seul.
      1. Dégel TRIzol-échantillons et incuber à température ambiante pendant 5 min.
      2. Dissocier le tissu en tirant des échantillons de haut en bas avec 1 ml basculé pippetor et / ou vortex jusqu'au tissu solide n'est plus visible.
      3. Ajouter 100 uL RNase (RF) de chloroforme et inverser le tube 2-3 fois pour mélanger.
      4. Incuber 3 min à température ambiante, tous les vortex min.
      5. Centrifuger à 13000 rpm pendant 15 min à 4 ° C.
      6. Transférer le surnageant dans un microtube propre de 1,5 ml. Soyez prudent de ne pas déranger l'interface.
      7. Ajouter un volume égal de la température ambiante de 70% d'éthanol RF de qualité de biologie moléculaire (~ 300 uL).
      8. Mélanger doucement par aspiration et refoulement à quelques reprises.
      9. Continuer avec les étapes suivantes pour les directions RNeasy Kit Micro:
        1. Appliquer l'échantillon d'une colonne RNeasy placée dans une micro collectio 2mLTube n.
        2. Centrifuger à 10000 rpm pendant 15 sec, jetez accréditives.
        3. Laver la colonne RNeasy avec 350 pi de tampon RW1.
        4. Centrifuger à 10000 rpm pendant 15 sec, jetez accréditives.
        5. Ajouter 10 uL DNase solution stock de 1 à 70 uL de tampon RDD, mélanger délicatement.
        6. Appliquer 80 uL d'une solution de DNase directement sur la membrane et incuber à température ambiante pendant 20 min.
        7. Laver la colonne RNeasy avec 350 pi de tampon RW1.
        8. Centrifuger à 10000 rpm pendant 15 secondes, jeter des flux et le tube.
        9. Ajouter 500 pi de tampon RPE à la colonne RNeasy.
        10. Centrifuger à 10000 rpm pendant 15 sec, jetez accréditives.
        11. Ajouter 500 ul RF 80% d'éthanol de grade biologie moléculaire colonne RNeasy.
        12. Centrifuger à 10000 rpm pendant 2 min, jeter des flux et le tube.
        13. Placez colonne RNeasy dans de nouveaux tubes avec les capuchons ouverts.
        14. Centrifugeuse à vitesse maximale (c.-à-14000 rpm) pendant 5 min.
        15. Transfert colonne RNeasy dans un tube à centrifuger RF.
        16. Appliquer 14 uL d'eau RF directement à la membrane.
          1. Centrifuger à 10000 rpm pendant 1 min pour éluer.
          2. Conserver les échantillons à -80 ° C ou de continuer à les prochaines étapes.
    3. Quantification de l'ARN.
      1. Diluer RiboGreen 1:200 en RF 1x Tris-EDTA (TE) de mémoire tampon.
      2. Préparer ARNt de levure pour être utilisé comme norme ARN.
        1. Stock de travail est stocké dans -20 ° C à 100 pg / mL
        2. Diluer à 1 pg / mL (10 uL dans 990 uL de TE).
        3. Créer des normes comme suit: Pour 100 ng / uL, ajouter 100 ul, pour 80 ng / uL, ajouter 80 uL ARNt et 20 uL de TE, de 60 ng / uL, ajouter 60 uL ARNt et 40 uL de TE, de 40 ng / uL ajouter 40 uL ARNt et 60 uL de TE, de 20 ng / uL ajouter 20 uL ARNt et 80 uL de TE, et pour 0 ng / uL ajouter 100 ul de TE.
      3. Préparer les échantillons:
        1. Combinez 99 uL TE + 1 échantillon ul.
        2. Exécuter chaque échantillon en double.
      4. En utilisant une pipette multi-canaux, ajouter 100 ul de RiboGreen diluée par puits.
      5. Pipeter haut et en bas pour mélanger.
      6. Mesure de fluorescence sur un lecteur de plaque.
        1. Fluorescéine (485 nm/535 nm, 0,1 sec) du programme.
        2. Exporter les résultats dans un tableur Excel.
    4. Déterminer la concentration d'ARN.
      1. Graphique absorption versus concentration d'ARN et de créer une ligne de meilleur ajustement de régression linéaire dans Excel.
      2. Déterminer les concentrations d'ARN de l'échantillon de l'équation de régression associé à la ligne de meilleur ajustement.
    5. Déterminer la qualité d'ARN.
      1. Ribosomique intégrité bande ARN est mesurée par un gel d'agarose (fig. 4).
        1. Bien qu'il soit impossible d'exécuter une fraction de chaque échantillon d'ARN obtenu (depuis = 1 ug d'ARN est requise et nos rendements sont de petite taille), c'est une bonne idée d'exécuter périodiquement un gel dénaturant d'agarose sur un échantillon exemplaire comme preuve que la méthode , quand c'est fait correctement, les rendements de haute qualité d'ARN (ie, sans dégradation).
        2. Préparer un gel d'agarose 1% (pour un volume de 100 ml).
          1. Nettoyer la cuve d'électrophorèse, la coulée de gel plateau et peignes fond avec la RNase AWAY.
          2. Peser 1 g d'agarose ultrapure dans un flacon.
          3. Ajouter 83 ml de RNase eau libre et 10 ml de MOPS 10x [3 - (N-morpholino) propane sulfonique] tampon et micro-ondes jusqu'à agarose est dissous et la solution est claire (~ 3 min).
            1. Pour faire 10x tampon MOPS
              1. Combinez 83,7 MOPS g, 13,6 g d'acétate de sodium et 3,7 g d'EDTA.
              2. Ajouter 800 ml d'eau libre de RNase, mélanger pour dissoudre.
              3. Ajuster le pH à 7,0 et de remplir à 1 L.
              4. Stériliser par filtration ou autoclave.
              5. Stocker à température ambiante, protégé de la lumière.
          4. Laisser refroidir un gel à 55 ° C et ajouter 7 ml de formaldéhyde 37% (cette étape devrait être fait dans une hotte).
          5. Verser le gel dans la coulée plateau et permettent gel de se solidifier dans la hotte.
        3. Préparer les échantillons d'ARN.
          1. Tampon d'échantillon d'ARN (500 uL, faire des frais).
            1. Mélanger 50 uL MOPS 10x, 250 uL de formamide, 90 uL de formaldéhyde 37%, 108 uL RF H ​​2 O et 2 du bromure d'éthidium uL (solution stock à 10 mg / ml).
          2. Pour mg 1-10 de l'ARN, ajoutez doubler son volume en utilisant un tampon d'échantillon, pour une dilution de trois ordres.
          3. Dénaturer à 95 ° C pendant 5 min, puis refroidir sur glace pendant 5 min.
          4. Spin briefly et charger l'échantillon complet dans des puits à côté d'une échelle de l'ARN (ajouter colorant de chargement si désiré).
        4. Électrophorèse
          1. Remplir la chambre avec 1x tampon MOPS.
          2. Électrophorèse à 50-75 volts jusqu'à ce marqueurs ont migré au sujet 2/3rd de la longueur du gel.
        5. Visualisez le gel sur un transilluminateur UV.
          1. Vérifiez qu'il n'ya 18S et 28S forte ARN ribosomal (ARNr) les bandes, et que la bande 28S est deux fois plus intense que la bande 18S (Fig. 4).
          2. ARN dégradé aura un aspect enduit, bandes floues, ou ne sera pas présenter un ratio de 2:1.
    6. Typiquement, nous utilisons la densité optique pour évaluer la qualité totale ARN.
      1. Bien que pas aussi sensible, spectrophotométrie UV via un Nanodrop est un moyen rapide et rentable de vérifier la qualité de l'ARN.
      2. Cherchez la densité optique (DO) 260/280 ratio de 1.5 à 2.0.
      3. Gardez à l'esprit que la solution dans laquelle l'ARN est resuspendu (tampon TE versus eau) aura une incidence sur le ratio de DO.
  5. Activités de PCR.
    1. Pré-PCR configuration
      1. Conception des amorces spécifiques
        1. Utiliser Primerblast NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ :
          1. Entrez le numéro du gène cible de l'adhésion RefSeq.
          2. Spécifiez la taille du produit PCR de 70 à 200 pb.
          3. Spécifiez une Tm de 55 à 72 °, avec moins de 5 ° d'écart entre les amorces avant et arrière.
          4. Sélectionnez "Primer doit couvrir une jonction exon-exon" pour réduire de fond génomique.
          5. Cocher Activer spécificité pour l'ARN Rat RefSeq base de données pour s'assurer que les amorces ne reconnaissent pas d'autres cibles.
          6. Choisissez une paire d'amorces à partir des résultats correspondant aux critères suivants:
            1. 18-30 bases.
            2. Moins de 2000 bases en dehors de votre modèle.
            3. 40-60% guanine-cytosine contenu pour assurer la liaison stable de l'apprêt modèle.
      2. Choix d'un gène de référence.
        1. Pas tous les gènes de référence sera adapté à votre expérimentaux mis en place. Chaque fois qu'un nouveau paradigme est utilisé, la stabilité de votre référence doit être vérifiée. Par souci de cohérence, nous avons opté d'utiliser l'un des gènes de référence de quatre fournies sur le tableau RT 2 Profiler PCR.
        2. Un gène bonne référence devrait répondre aux critères suivants:
          1. Son niveau d'expression n'est pas altérée par le paradigme expérimental.
          2. Elle est exprimée à des niveaux similaires à celle du gène cible.
        3. Pour sélectionner une référence appropriée:
          1. Revue de la littérature afin d'identifier des candidats probables pour un gène de référence stable dans votre système. Par exemple, nous avons testé Rpl13a parce qu'il a été montré pour être stable dans les études de l'ischémie. 11,12
          2. Amorces de conception tel que discuté ci-dessus (ou trouver amorces déjà validés pour les gènes de référence commune dans une base de données comme RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ).
          3. Optimiser amorces amorces côtés gène cible (voir ci-dessous).
          4. Déterminer quelle référence candidat est le plus stable en utilisant un logiciel comme Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) qui calcule une valeur de stabilité pour chaque gène basé sur la variance intra-groupe et sélectionne le gène (s) avec la moindre expression variation sur les échantillons. Par exemple, Rpl13a est un gène de référence optimale pour le DD (fig. 4).
      3. Optimiser amorces.
        1. Pour obtenir des résultats cohérents et fiables à partir qPCR, les amorces doivent répondre à certains critères de reproductibilité, la sensibilité et de spécificité.
          1. Il est préférable de tester ces paramètres pour chaque paire d'amorces de nouvelles.
          2. La reproductibilité est testé pour en exécutant technique de répétitions.
          3. La sensibilité peut être évaluée par les performances avec une courbe standard de 4 successives dilutions.
          4. La spécificité est déterminée par la confirmation d'un seul produit par analyse de la courbe fondre et l'électrophorèse sur gel (fig. 5).
        2. Exécuter une plaque qPCR pour tester la qualité de vos amorces, et la concentration des amorces à utiliser.
          1. En utilisant l'ADNc synthétisé à partir du cerveau entier ARN, de créer une courbe standard (série de quatre consécutifs dilutions) comme suit: 1, 1:04, 1:16, 1:64, 1:256, et aucun contrôle de modèle (NTC) .
          2. Pour chaque dilution, exécutez 1 ul d'ADNc dans duplicationste pour chaque concentration d'amorces, (100 nM, 200 nM, 300 nM).
        3. Confirmez que techniques réplicats donnent cohérente valeurs Ct.
        4. Examinez les valeurs de Ct pour la courbe de dilution.
          1. Tracer les valeurs Ct contre la concentration pour chacune des dilutions. La courbe résultante devrait être linéaire avec un coefficient de corrélation de bons (ie,> 0,95).
        5. Examinez fondre la courbe de confirmer la présence d'un produit d'amplification unique (ie, un seul pic).
          1. Si il ya des pics multiples, ou les sommets ne sont pas similaires, ce qui pourrait suggérer la contamination, mispriming, amorce-dimère artefact, etc (fig. 5).
          2. Un pic dans les NTC correspondront vraisemblablement aux dimères d'amorces qui forment plus facilement en l'absence de matrice d'ADNc, et ne doit pas être une préoccupation.
        6. Confirmer fusion courbe de données en résolvant produits amplifiés sur un gel d'agarose 1%.
          1. Préparer un gel d'agarose 1% (pour un volume de 100 ml)
            1. Peser 1 g d'agarose dans un flacon.
            2. Ajouter 100 ml de 1x Tris-Acétate EDTA (TAE) tampons et micro-ondes jusqu'à agarose est dissous et la solution est claire.
              1. 1 L 50x tampon TAE de base se compose de 2 M Tris, 57 ml d'acide acétique glacial, et 0,05 M d'EDTA (pH 8,0).
              2. Diluer tampon TAE 1x avec de l'eau distillée (concentration finale: 40 mM Tris-acétate et 1,0 mM d'EDTA).
            3. Laisser refroidir un gel à 55 ° C avant d'ajouter le bromure d'éthidium à une concentration de 0,5 pg / mL.
            4. Verser le gel dans la coulée plateau et lui permettre de se solidifier à température ambiante.
          2. Pour exécuter, place du gel dans une chambre remplie d'électrophorèse TAE 1X, mélangez 10 uL d'échantillon de la plaque de qPCR avec 2 pi de colorant de chargement 6x, bien mélanger et charger dans des puits à côté d'une échelle de poids moléculaire.
          3. Électrophorèse à 50-150 volts jusqu'à ce marqueurs ont migré une distance appropriée, en fonction de la taille attendue de votre produit d'ADNc.
          4. Visualisez avec un transilluminateur UV.
          5. Vérifiez que le produit amplifié par PCR est de taille appropriée pour votre cible.
          6. Dimères d'amorces sera d'environ 50 pb.
    2. Pré-écran pour le TNF-α a augmenté.
      1. Depuis le TNF-α initie réactions d'inflammation dans la périphérie, nous suspectons ceci est également vrai pour le cerveau et l'utilisation de dépistage initial pour le TNF-α ARNm comme marqueur de l'état de la culture tranche immunitaire (ie, normal, imposture, et les groupes expérimentaux) avant de procéder à la pleine gamme des analyses PCR.
      2. Si normal et simulacre niveaux de contrôle ARNm du TNF-α ne sont pas dans une plage interdosage trouve au sein de notre laboratoire, des expériences (c'est à dire, normal, imposture, et les groupes expérimentaux) sont rejetés et ne procèdent pas à la pleine gamme des analyses PCR.
      3. iScript synthèse de l'ADNc.
        1. Pour chaque échantillon d'ARN, de combiner les éléments suivants dans un tube PCR: 4 mix uL réaction 5x, une transcriptase inverse ul, 25 ng d'ARN, et RF H ​​2 O pour un volume final de 20 pl.
        2. Mélanger doucement par pipetage et centrifuger brièvement.
        3. Incuber: 25 ° C, 5 min, 42 ° C, 30 min, 85 ° C, 5 min.
        4. Diluer 1:4 (ajouter 60 uL d'eau RNase).
        5. Conserver à -20 ° C ou de garder sur la glace jusqu'au moment de servir en quelques heures.
      4. qPCR pour le TNF-α.
        1. Préparer un master mix pour chaque paire d'amorces.
          1. Combinez 12,5 uL iQ SYBR vert, 1 mélange d'amorces uL d'eau et 10,5 l par échantillon.
          2. Pour nos deux Rpl13a et le TNF-α amorces, 200 nm est la concentration optimale.
          3. Ajustez la quantité d'amorces et de volume de gaspilleur que nécessaire dans un tube de 1,5 ml RF et de garder sur la glace pendant que vous mis en place la plaque.
        2. Mettre en place une plaque qPCR avec des commandes / Shams / Expérimentaux. Utilisez 1 ul d'échantillon par l'ADNc en double exemplaire pour chaque gène.
        3. Ajouter 24 uL de votre master mix dans chaque puits et la pipette de haut en bas pour mélanger.
        4. Soyez très prudent pour éviter les bulles, comme ils vont interférer avec les lectures de fluorescence.
        5. Exécuter 40 cycles d'amplification par PCR:
          1. 95 ° C, 8.5min;
          2. 40 cycles: 95 ° C, 10 sec, 60 ° C, 30 sec, 72 ° C, 20 sec / cycle.
          3. Faire fondre la courbe: 55 ° C, 1 min, 80 cycles d'incréments de 0,5 ° C pendant 10 secondes à chaque démarrage à 55 ° C.
      5. Analyser les données (méthode ΔΔCt;. Fig 4). 13
  6. synthèse de l'ADNc par PCR pour les tableaux.
    1. Calculer le volume (pi) de chaque échantillon à avoir 250 ng d'ARN.
      1. Choisissez une quantité d'ARN (100 ng à 1 ug) que vous pouvez toujours extraire de vos échantillons.
    2. RT 2 Kit First Strand - selon les instructions du fabricant. En bref:
      1. Décongeler et spin bas tous les réactifs.
      2. Pour chaque échantillon d'ARN, de combiner les éléments suivants dans un tube PCR:
        1. 250 ng d'ARN, 2 pl de l'ADN génomique 5x (ADNg) de tampon d'élimination et de l'eau à un volume final de 10 ul.
      3. Mélanger doucement par pipetage et centrifuger brièvement.
      4. Incuber à 42 ° C pendant 5 min.
      5. Réfrigérer la glace pendant 1 min.
      6. Dans le même temps, préparer la transcription inverse (RT) Cocktail (par échantillon):
        1. Combinez 4 pi de 5x tampon RT 3, 1 uL apprêt et mélanger le contrôle externe, 1 ul RT enzyme mélangez 3, et 3 uL d'eau.
      7. Ajouter 10 uL de cocktail RT à chaque échantillon et mélanger délicatement.
      8. Incuber à 42 ° C pendant 15 min.
      9. Arrêtez la réaction en incubation à 95 ° C pendant 5 min.
      10. Ajouter 91 uL de RF H ​​2 O à chaque réaction de synthèse 20 uL d'ADNc (dilué à un volume final de 111 uL).
      11. Mélangez bien à la pipette.
      12. Conserver à -20 ° C ou de garder sur la glace jusqu'au moment de servir en quelques heures.
  7. RT 2 Profiler PCR tableau.
    1. Les instructions ci-dessous suivent celles du fabricant et sont réitérés ici par commodité.
    2. Préparer des réactifs
      1. Décongeler et spin bas tous les réactifs.
      2. Préparer un cocktail expérimental:
        1. Combinez 1350 uL de 2x SABiosciences RT 2 qPCR SYBR Green Master Mix, 102 ul d'ADNc dilué et 1248 ul de H 2 O RF à un volume final de 2700 ul.
      3. Retirez délicatement éventail de PCR de sac scellé.
      4. Distribuer un cocktail dans un réservoir de chargement.
      5. Ajouter 25 uL à chaque puits avec une pipette multi-canaux.
      6. Soigneusement joint de la plaque array PCR.
      7. Centrifuger la plaque à 10000 rpm pendant 1 min à température ambiante.
      8. Placez-le sur la glace jusqu'à ce programme de PCR est prêt.
    3. Exécutez le programme de cyclisme adapté à votre machine.
      1. iCycler:
        1. 95 ° C, 10 min
        2. 40 cycles: 95 ° C, 15 sec, 60 ° C, 1 min.
        3. Faire fondre la courbe: 55 ° C, 1 min, 80 cycles d'incréments de 0,5 ° C pendant 10 secondes à chaque démarrage à 55 ° C
    4. Analyser les données.
      1. Sélectionnez «Auto calculé» pour les cycles de référence.
      2. Sélectionnez "User Defined" pour la position du seuil de régler manuellement la valeur seuil.
        1. Dans "Afficher le journal", seuil fixé dans la partie inférieure d'un tiers de la phase linéaire de l'intrigue d'amplification.
        2. Soyez sûr de garder la valeur seuil de la même partout s'exécute.
      3. Data Export.
      4. Entrée dans un fichier Excel.
      5. Télécharger pour SABiosciences tableau d'analyse des données de PCR.
        1. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php
        2. Sélectionnez gènes de référence -, nous avons utilisé Rpl13a.
      6. Notre pratique consiste à:
        1. Confirmer les résultats d'au moins une PCR array double.
        2. Changements array trois volets ne doivent pas être confirmée par amplification spécifique cible de PCR subséquente 6,7.
        3. Des changements moins de 3 fois devrait être confirmée par amplification spécifique cible de PCR subséquente ou l'utilisation de matrices PCR 2-3 (2x pour confirmer les modifications.
    5. L'ADN de pré-amplification est utilisé pour analyser les cibles avec des attendus très faible expression (fig. 6).
      1. SABiosciences du RT 2 Nano kit PreAmp synthèse de l'ADNc et les mélanges d'amorces sont destinées à pré-amplification de l'ARN pour permettre l'utilisation de petites quantités (1-100 ng) d'échantillon d'ARN pour exécuter un éventail complet de PCR.
      2. Chaque mélange d'amorces permet l'amplification du gène de 89 modèles spécifiques ADNc cible avec un biais minime. Nous avons utilisé ce système comme un moyen d'amplifier les signaux de bas niveau tels que l'IFN-λ à un niveau détectable.
      3. RT 2 Nano kit PreAmp synthèse de l'ADNc - selon les instructions du fabricant. En bref:
        1. Décongeler et spin bas tous les réactifs.
        2. Pour chaque échantillon d'ARN, de combiner les éléments suivants dans un tube PCR.
          1. 1-100 ng d'ARN, 2 pl de la mémoire tampon de l'élimination ADNg 5x et d'eau pour un volume final de 10 ul.
        3. Mélanger doucement par pipetage et centrifuger brièvement.
        4. Incuber à 42 ° C pendant 5 min.
        5. Réfrigérer la glace pendant 1 min. En attendant, préparer le cocktail RT (par échantillon).
          1. Combinez 4 pi de 5x tampon RT 3, 1 uL apprêt et mélanger le contrôle externe, 1 ul mélange d'ADNc synthèse de l'enzyme, une inhibiteur de RNase uL, et 3 uL d'eau.
        6. Ajouter 10 uL de cocktail RT à chaque échantillon et mélanger délicatement.
        7. Incuber à 42 ° C pendant 15 min.
        8. Arrêtez la réaction en incubation à 95 ° C pendant 5 min.
        9. Conserver à -20 ° C ou de garder sur la glace jusqu'à utilisation.
      4. d'amplification d'ADNc avec des amorces spécifiques.
        1. Mélanger les éléments suivants dans un tube PCR:
          1. 12,5 uL PCR Master Mix, 7,5 uL d'amorces spécifiques, et 5 pi d'ADNc dilué.
        2. Exécuter 12 cycles d'amplification par PCR.
          1. 95 ° C, 10 min.
          2. 12 cycles: 95 ° C, 15 sec, 60 ° C, 2 min.
          3. Tenir à 4 ° C.
        3. Ajouter 2 uL réducteur réaction secondaire à chaque échantillon.
        4. Incuber à 37 ° C pendant 15 min.
        5. Arrêtez la réaction en incubation à 95 ° C pendant 5 min.
        6. Ajouter de l'eau 84 RF uL à chaque réaction d'amplification 27 uL d'ADNc.
      5. Conserver à -20 ° C ou de garder sur la glace jusqu'au moment de servir en quelques heures.
      6. Amplifier gènes cibles individuelles en utilisant des amorces et des SAB SYBR green mélange maître tel que décrit ci-dessus.

4. Les dosages Phosphoprotein multiplexée of cytokine signaling

  1. Dosages phosphoprotéine Mutliplexed sont utilisés pour définir cytokine ligand-récepteur de signalisation en aval (fig. 7).
  2. Déterminer la quantité de protéines totales dans les cultures de tranche.
    1. Récolte des cultures tranche en soulevant doucement les tranches hors d'inserts et les placer dans 1 ml froid (4 ° C) PBS.
    2. Centrifuger les tubes pendant 30 secondes et retirez du PBS. Placez-le sur la glace sèche jusqu'à la récolte finie.
    3. Conserver à -80 ° C.
  3. Homogénéiser les cultures tranche pour le dosage des protéines totales.
    1. Préparer un tampon de lyse cellulaire selon les instructions du fabricant.
      1. Ajouter les inhibiteurs de protéase à un volume total de tampon nécessaire de placer au moins 200 pi de tampon de lyse sur chaque culture tranche.
        1. Par exemple: ajouter 20 ul de facteur 1, 10 ul de facteur 2, et 20 pi de 500 mM de PMSF dans le DMSO à 4,95 ml de tampon de lyse cellulaire.
    2. Dégel des cultures tranche dans 200 uL de tampon de lyse sur la glace.
    3. Soniquer cultures tranche de cinq fois en impulsions sec 1 et immédiatement revenir sur la glace.
    4. Échantillons Vortex pendant 10 sec.
    5. Centrifuger les échantillons à 4 ° C pendant 15 min à 13000 rpm.
    6. Transférer le surnageant dans un tube à nettoyer et à garder sur la glace.
  4. Effectuer dosage des protéines totales.
    1. Préparer les normes de protéines.
      1. Reconstituer des stocks de sérum albumine bovine (BSA) conformément aux instructions du fabricant.
      2. Préparer des normes allant de 0 à 1000 pg / ml dilué dans l'eau de grande pureté pour le dosage de protéines BCA.
    2. Calculer le volume de réactif de travail nécessaire en fonction du nombre d'échantillons et de répétitions.
      1. Par exemple: (8 + 18 normes échantillons inconnus) x (2 répétitions par échantillon) x (0,2 ml de réactif de travail nécessaire par puits) = 10,4 mL le volume total nécessaire pour tous les échantillons chargés sur la microplaque.
        1. Ronde de 12 ml volume total d'assurer un volume suffisant.
      2. Lorsque le mélange réactif A avec le réactif B pour le réactif de travail, certains turbidité peut se produire, mais devrait disparaître très prochainement.
    3. Charge 10 uL d'échantillons et des normes par puits.
    4. Charge 0,2 mL de réactif de travail dans les puits.
    5. Recouvrir la plaque avec du ruban d'étanchéité et agiter pendant 30 secondes pour mélanger.
    6. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 30 min.
      1. Plaque de refroidir à température ambiante (environ 10 min) avant de lire sur un lecteur de plaque à 595 nm.
    7. Construire une courbe standard à l'aide de Microsoft Excel avec l'absorbance mesurée vs concentration attendue.
      1. Un coefficient de corrélation de bons est égal ou supérieur à 0,98.
    8. Calculer les concentrations de protéines dans les échantillons en utilisant l'équation linéaire dérivé de la courbe standard.
    9. Diluer les échantillons dans un tampon de lyse à des quantités égales de protéines et de stocker à -80 ° C jusqu'au moment de son traitement ultérieur.
    10. La concentration en protéines devrait se situer 200 à 900 pg / ml selon les instructions du fabricant.
  5. Effectuer essai multiplex.
    1. Remarque: des tests phosphoprotéine multiplexés prendre 2 jours au total au complet, avec 1 heure de la configuration initiale et le chargement des plaques suivie par une nuit INCUbation et les étapes d'incubation supplémentaires et laver les étapes de la journée suivante.
    2. Carte des puits, qui contiendra ce qui lysat selon feuille dans le manuel.
    3. Dégeler les échantillons de tissus homogénéisés et lysats kit à température ambiante, puis placer sur la glace. Apportez tous les tampons et les réactifs fournis dans le kit à température ambiante (à l'exception de streptavidine et des perles).
    4. Préparer des billes pour le dosage multiplex.
      1. Couvrir les tubes contenant des billes couplées avec une feuille d'aluminium pour protéger de la lumière. Tubes vortex pendant 5 secondes et de garder sur la glace.
      2. Diluer billes couplées 1:50 dans un tampon de lavage.
        1. Chaque puits doit contenir 1 pl de billes couplées dans 49 uL de tampon de lavage pour un volume total de 50 ul par puits.
    5. Calibrer l'appareil à vide.
      1. Laver la plaque avec le tampon de lavage 100 ul par puits.
      2. Allumez le vide et d'aspiration hors tout excès de liquide sous 2-5 sec.
        1. Si l'élimination complète de la mémoire tampon prend plus ou moins longues de 2-5 sec, régler la vanne de pression en conséquence.
        2. Sécher le fond de l'assiette avant d'ajouter des échantillons.
    6. Vortex les perles dilué couplé pendant 5 sec et ajouter 50 uL aux puits désignés.
      1. Immédiatement sous vide filtrer et sécher le fond de la plaque avec une serviette en papier.
    7. Laver la plaque à deux reprises avec le tampon de lavage 100 ul par puits. Séchez le bas de la plaque après chaque lavage.
    8. Vortex décongelés échantillons pendant 3 secondes et ajouter 50 uL aux puits désignés. Placez ruban d'étanchéité sur la plaque et laisser incuber pendant 15-18 heures d'agitation à 300 rpm à température ambiante, protégé de la lumière.
    9. Vide de liquide filtre à l'excès et la plaque de laver trois fois avec 100 uL de tampon de lavage. Séchez le bas de la plaque après chaque lavage.
    10. Diluer 1:25 de détection des anticorps dans un tampon de lavage.
      1. Chaque puits nécessite une détection des anticorps uL dans un volume total de 25 uL de tampon de lavage.
    11. Placez ruban adhésif sur la plaque et les protéger de la lumière avec du papier aluminium. Agiter pendant 30 sec, en augmentant progressivement la vitesse de 1100 rpm. Continuer agitation à 300 rpm pendant 30 min à température ambiante.
    12. Filtre à vide la plaque et laver trois fois avec 100 uL de tampon de lavage. Séchez le bas de la plaque après chaque lavage.
    13. Tout en protégeant la plaque de la lumière, de préparer une dilution à 1:100 de streptavidine-PE avec assez de volume pour ajouter 50 ul par puits. Protéger la solution de la lumière.
    14. Vortex et ajouter 50 ul diluée streptavidine-PE par puits. Incuber sous agitation à 1100 rpm pendant 30 sec puis 10 min à 300 rpm.
      1. Vide le tampon en excès hors service le filtre.
      2. Laver la plaque trois fois avec 100 tampon de resuspension ul par puits.
      3. Sécher le fond de l'assiette à fond après chaque lavage.
    15. Ajouter 125 uL de tampon resuspension dans chaque puits et agiter pendant 30 sec à 1100 rpm.
    16. Immédiatement lire la plaque ou de conserver à 4 ° C loin de la lumière pour un maximum de 24 heures.

5. Imiter et la modulation de la signalisation des cytokines

  1. Protéines recombinantes cytokines (avec support) sont utilisés pour imiter les changements de DD.
    1. Protéines lyophilisées (par exemple, le TNF-α) sont stockés pendant 1 an à -20 ° C.
    2. Après dilution à une solution stock à 0,1% d'albumine sérique bovine, des aliquotes sont préparées, stockées à -20 ° C, jusqu'à leur utilisation dans les 3 mois.
    3. Toute les manipulations de cultures tranche sont rafraîchies au moins tous les trois jours.
  2. Signalisation des cytokines est réduit au silence par:
    1. Utilisation des cytokines en cascade de signalisation traditionnels des agents pharmacologiques;
    2. Utilisation des antagonistes ligand soluble [par exemple, un récepteur soluble du TNF 1 (tel que décrit ci-dessus pour les ligands recombinants)], ou
    3. Gene silencing [ie, les petits ARN interférents (siRNA)].
  3. Livraison de siRNA dans les cellules neuronales est souvent problématique.
    1. Commune à base de lipides réactifs entraînent généralement faible efficacité de la transfection et la perte de la viabilité cellulaire.
    2. Au lieu de cela, nous utilisons Thermo Scientific Dharmacon siRNA Accell, qui permettent de knockdown rendement élevé sans l'utilisation d'un réactif de transfection.
    3. Ici, nous montrons knockdown de la cyclophiline B, une protéine non essentiels exprimés dans tous les types cellulaires, comme la confirmation de l'utilisation de cette méthode dans les cultures de tranche.
    4. Protocole de livraison a été adapté pour les cultures tranche à partir des instructions du fabricant pour une utilisation dans des cellules adhérentes.
      1. Diluer tampon siARN 5x 1x avec la RNase eau libre.
      2. Préparer une solution de 100 microns siARN 1x tampon
        1. Cyclophiline B siARN est fourni à 5 nmol. Remettre en suspension dans 50 ul de tampon 1x pour un stock 100 pM.
      3. SiARN Mélanger avec la livraison Accell Medium à une concentration finale de 1 uM siARN.
        1. Ajouter 11 uL de 100 siARN stocks uM à 1100 ul de milieu de livraison Accell dans une plaque à 6 puits.
        2. Placer dans l'incubateur et de permettre la température s'équilibrer à des conditions d'incubation normale pendant au moins 20 min.
      4. Utiliser une hotte BSL-2 et une technique stérile, insère le transfert dans le mélange contenant de la livraison des puits.
        1. Incuber avec un mélange de livraison pour 96 heures pour abattre des protéines.
          1. Évaluer knockdown protéines par Western blot ou intensifiée immunomarquage.
          2. Western blot, tandis que le choix premier potentiel d'efficacité knockdown, peut-être trop insensibles à faible niveau de signalisation immunitaire associée au phénomène non préjudiciable de DD.
          3. En conséquence, nous avons suivi des mesures négatives à l'argent par Western blot amélioré diaminobenzidine (DAB) et des mesures de densitométrie immunomarquage par ordinateur (voir ci-dessous).

6. Confirmations protéomique

  1. Spécificité cellulaire des changements phosphoprotéine est établi en utilisant immunomarquage 6,7.
    1. Fix cultures tranche de 24 heures avec fixateur PLP composé de:
      1. 10 ml de paraformaldéhyde 16%, 1,096 g de lysine, 0,42 g de phosphate de sodium, et 0,17 g de periodate de sodium, rempli d'un volume total de 80 ml avec de l'eau ultra-pure (fixateur est de 6,2 pH).
      2. Après 24 heures, retirer délicatement les cultures tranche des inserts avec un pinceau fin et transfert à l'azide de sodium contenant du PBS (100 mg / L) jusqu'au moment de la section.
      3. Puis, incuber les tranches d'au moins 24 heures dans du PBS-20% de saccharose, couper des cultures tranche entière de 20 sections um, et monter sur des lames gel coat.
      4. Immunomarquage fluorescent (par exemple, pour NFkB) est réalisé comme suit, avec toutes les mesures couplées à des secousses à ~ 50 min.
        1. Lavez les cultures tranche dans 3 ml de PBS à trois reprises pendant 10 min.
          1. Placer les lames avec des cultures de 20 um montée tranche dans des jarres de Coplin avec ~ 40 ml de PBS pour toutes les étapes de lavage.
        2. Lavez les cultures tranche dans du PBS à trois reprises, à 10 min par lavage.
        3. Placez quelques gouttes de SFX Amplificateur de signal sur les cultures tranche et incuber dans une chambre humide pendant 30 min.
        4. Incuber les cultures tranche pendant 2 heures à 37 ° C avec de lapin anti-NFκβ anticorps à 1:100 dilué dans 0,75% de Triton X-100 dans le PBS.
          1. Solution d'anticorps pipette directement sur les tranches.
        5. Retirez les tranches de la solution d'anticorps et laver trois fois dans du PBS pendant 10 min par lavage.
        6. Incuber tranches à température ambiante pendant une heure dans de chèvre anti-lapin AlexaFluor 594 anticorps à 01h50 dans 0,75% de Triton X-100 dans le PBS.
          1. Centrifugeuse AlexaFluor 594 anticorps pour 15 min à 10000 rpm pour enlever tout précipité qui peut s'être formé dans la solution.
        7. Laver trois fois dans du PBS, 10 min par lavage.
        8. Trempez glisse dans l'eau distillée afin d'éliminer toute sels de PBS.
        9. Lamelle avec Prolongez moyennes Antifade et laisser sécher pendant au moins 2 heures, couvert abri de la lumière.
        10. Visualisez en traditionnel ou confocale (fig. 7) la microscopie à fluorescence.
  2. Changements de production de protéines à partir knockdown siARN peut être évaluée par l'amélioration sensible DAB traditionnelle immunomarquage 7 via l'intensification d'argent 16 et ultérieures quantification densitométrique (par exemple, comme ici pour la cyclophiline B) (figure vidéo 2).
    1. Immunocoloration la cyclophiline B suit les procédures standard pour l'imagerie en champ clair que nous avons récemment détaillé, 7 à l'aide:
      1. Anti-souris cyclophiline B (1:100) pendant 24 heures à 4 ° C;
      2. Suivi par la peroxydase de raifort anticorps étiquetage secondaires (1:100);
      3. Et la visualisation DAB.
    2. f les réactions DAB sont trop faibles pour permettre numériques quantification17 densitométrique, ils peuvent être intensifiés par une procédure d'argent différenciée selon Quinn et Graybiel 16.
      1. Réhydrater diapositives puis laver 3 x 10 minutes dans de l'eau de haute pureté.
      2. Placer les lames dans de l'eau de haute pureté dans une jarre de Coplin et chaud à 56 ° C.
      3. Préparer solution ammoniacale de nitrate d'argent (0,5%):
        1. Chlorure d'ammonium d'actions (25-30%) est fraîchement dilué (1:1) avec de l'eau de haute pureté.
        2. Ajouter de l'hydroxyde d'ammonium (~ 500-600 uL par 100 mL) goutte à goutte sous agitation à la solution de nitrate d'argent de 0,5% qui sera brièvement se trouble puis claire.
        3. Chauffez la solution à 56 ° C.
        4. Incuber sections pour 10-12 min.
      4. Laver les lames pendant 15 sec dans de l'eau de grande pureté (ceci et toutes les étapes subséquentes sont effectuées à température ambiante en utilisant des bocaux Coplin).
      5. Tremper les lames pendant 15 sec au thiosulfate de sodium à 1% (pentahydraté).
      6. Tremper les lames pendant 15 sec dans de l'eau de haute pureté.
      7. Tone les diapositives pendant 2 min dans du chlorure d'or de 0,2%.
      8. Plonger les lames dans de l'eau de haute pureté pour 15 sec.
      9. Exposer les diapositives à l'acide oxalique 0,5% pendant 2 min.
      10. Plonger les lames pendant 15 sec dans de l'eau de haute pureté.
      11. Traiter les diapositives pendant 5 min dans de thiosulfate de sodium à 5%.
      12. Laver abondamment à l'eau glisse de haute pureté, déshydrater et lamelle.
      13. Les diapositives sont maintenant prêts pour la quantification densitométrique. 17
        1. Tous les équipements, y compris l'éclairage fond clair, est activée pour au moins 20 min avant l'imagerie.
        2. Pans entiers de la culture tranche sont imagés à 5-10x sur un microscope inversé.
        3. L'intensité lumineuse est réglée à un niveau uniforme (par exemple, ~ 2,6 V) et ne change pas tout au long des acquisitions d'images.
          1. Les filtres neutres sont utilisées comme nécessaires pour réduire l'image pleine intensité de la lumière transmise à ~ 1500 sur une échelle de 12-bit (0 à 4095) où «0» est complètement noir et 4095 est entièrement blanc.
        4. Les images numériques sont ensuite acquises et stockées électroniquement à tous (c'est à dire, simulacre de contrôle et des échantillons expérimentaux), y compris une image de fond dérivées forment une zone de la diapositive sans sections culture tranche.
        5. L'image de fond est soustraite de toutes les images (simulacre et expérimentale) et une zone d'intérêt (AOI), élaboré autour de chaque tranche de la culture et de l'intensité lumineuse transmise enregistré.
        6. Gamme d'intensité d'image est réglée sur un périmètre constant pour toutes les expériences.
        7. Pour plus de clarté, résultante exprimée comme une densité relative par rapport aux niveaux de contrôle (fig. 8).

7. Les résultats représentatifs:

Figure 1
Figure 1. Trancher la culture de paradigme électrophysiologiques d'enregistrement Enregistrement de microélectrodes. Est d'abord placé dans la couche CA3 neurone pyramidal et ensuite une électrode de stimulation bipolaire est placée dans le gyrus denté (DG).

Figure 2
Figure 2. CA3 potentiels évoqués sur le terrain et synaptique induite répandre la dépression. (A) Expériences commencer par la détermination du courant nécessaire pour maximiser la norme CA3 réponses de terrain secteur potentiel et ensuite la moitié du maximum d'intensité est utilisée pour obtenir CA3 potentiels évoqués zone de champ. Ce document évoque la normalité de réponses synaptiques entre les préparations. Si les potentiels d'une tranche de terrain après synaptique excitatrice ne sont pas moins de 3 mV, les tranches sont jetés. (B) Ensuite, le seuil de trans-synaptique évoquée pour déclencher la dépression propagation est déterminé (à droite, des réponses lentes) tout les mêmes potentiels de terrain de temps (à gauche , réponses rapides) sont utilisés pour documenter que les préparatifs sont en assez bonne santé pour suivre une stimulation 10 Hz (par exemple, les amplitudes des déviations verticales dans les fast dossiers potentiels sont similaires).

Figure 3
Figure 3. Microgliales mouvement associé à une réduction synaptique activité. L'expérience montre que les branches microgliales s'étendre et se rétracter à l'activité synaptique accrue, mais longue distance le mouvement de ces cellules en réponse à l'activité synaptique n'a pas été décrit dans le cerveau intact. Nos résultats en utilisant fluorescentes étiquetage isolectine B4 des microglies qui montrent une fraction de ces cellules se déplacent sur de longues distances dans des conditions normales. Par ailleurs, le nombre de ces cellules microgliales voyage est significativement augmenté lorsque l'activité synaptique est abolie par l'exposition à la culture de la tétrodotoxine, comme indiqué dans l'image qui l'accompagne. Les lignes rouges marquent chemins parcourus par les microglies sur une période de 6 heures avec des flèches bleues marquant l'origine d'une microglie quelques exemplaires. Barre de calibrage, 50 um.

Figure 4
Figure 4. Activités de dépistage par PCR. (A) Nous utilisons TRIzol avec les kits Qiagen pour l'isolement d'ARN, car, dans nos mains, il en résulte significativement plus élevée (P <0,001; test t). Rendement en ARN provenant de cultures tranche de l'hippocampe à l'utilisation de kits Qiagen seul (B) Dans De plus, nous faisons périodiquement confirmer que nos procédures d'extraction d'ARN produire de l'ARN de haute qualité intacte telle que déterminée par l'intermédiaire d'un gel qui montre forte bandes d'ARN. (C) Nous utilisons des logiciels NormFinder de choisir un gène de référence avec une valeur meilleure stabilité. Par exemple, les cultures tranche exposéed'lipopolyssacharide (100 ng / mL pendant 2 heures) ont été analysés pour trois gènes de référence (Rpl13a, β-actine, 18s). Les valeurs Ct sont utilisés pour calculer une valeur de stabilité. Nos données ici [et que pour d'autres expériences utilisant la dépression épandage (données non présentées)] montrent que Rpl13a est un gène de référence optimale. (D) Nous utilisons le "ΔΔCt" méthode comme un moyen sensible et reproductible pour détecter rabattable changement de différences entre les groupes expérimentaux ARN et contrôle imposture.

Figure 5
Figure 5. Chèques réaction PCR. (A) Nous mesurons amplifications courbe de dilution pour les amorces comme un moyen de vérifier la qualité des réactions PCR. Par exemple, les amplifications optimale montrent un uniforme (1-5) relèvement des seuils Ct (B). En revanche, les amplifications ne sont pas uniformes avec des amorces mauvaise (1-5). (C) En outre, nous effectuons une courbe fondre à la conclusion de PCR pour confirmer que les amplicons sont détectés désirée (par exemple, une courbe de pointe unique), ce qui indique l'absence de tout ADN double brin dont dimères d'amorces, contaminant l'ADN et la PCR misannealed produit (ce qui semblerait que les courbes de pointe multiples).

Figure 6
Figure 6. Nano de pré-amplification permet la détection d'IFN-λ dans les cultures de tranches d'hippocampe. Étant donné que seulement ~ 50 T-cellules se trouvent dans une culture tranche (sur ~ 55,000-90,000 cellules au total), nous avons utilisé la RT 2 nano Kit PreAmp Synthèse ADNc un moyen de détecter d'éventuels niveau d'expression ultra-faible de l'IFN-λ. Ce moyen de préamplification ADNc fourni une augmentation de 12 fois la sensibilité à l'ARN niveaux. Les résultats présentés ci-dessus illustrent la capacité de préamplification pour augmenter la sensibilité de détection. Ct seuil de gène de référence était de 20,5 Rpl13a avec amplification initiale et cette base a augmenté à 14,1 à l'utilisation du kit de préamplification, soit une augmentation de 12 fois correspondant à 12 cycles d'amplification par PCR de l'ADNc. En parallèle, l'IFN-λ n'était pas détectable (0,0) mais était bien dans la plage de détection (29,0) avec préamplification.

Figure 7
Figure 7. Innate cytokine changements voie phosphoprotéine phosphorylation. (A) l'effet exemplaire du TNF-α prétraitement (c'est à dire, la neuroprotection) sur la phosphorylation des cytokines innées voie phosphoprotéine de 24 heures après la blessure excitotoxique dans les cultures de tranches d'hippocampe. Les résultats montrent des changements CA1 espace entre les tranches prétraitées pendant 3 jours avec 100 ng / ml de TNF-α avant l'exposition à la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) par rapport à ceux exposés au NMDA seul (c'est à dire, expérimental vs simulacre), exprimé en pourcentage. Notez que le TNF-α induit une augmentation soutenue de la phosphorylation de JNK et ATF-2 ainsi que d'une augmentation transitoire de NFkB. (B) La répartition spatiale de l'activation de NFkB (ie, présence de NFkB phosphorylés dans le noyau) est révélée par immunomarquage ( rouge). YoYo verts noyaux des taches dans une section de la culture tranche [par exemple, dans les astrocytes (flèche tête)]. Neurones pyramidaux, qui, autrement, serait aussi en vert, jaune, sont plutôt en raison des concomitante marquage avec phosphorylée NFkB (rouge). Barre de calibrage, 25 um.

Figure 8
Figure 8. . Confirmation de protéomique de l'efficacité de siRNA intensification de l'argent différenciée de la peroxydase diaminobenzidine immunomarquage base pour la cyclophiline B montre que siARN peut de manière significative (P <0,001; ANOVA-Holm-Sidak méthode) de réduire mondiale tranche hippocampique cyclophiline B expression 3 jours après l'application de 200, 500 , ou ARNsi 1000 nM.

Discussion

SD est une perturbation du cerveau paroxystique dont les caractéristiques sont hautement conservée dans toutes les régions du cerveau des espèces et examinés à ce jour. SD est couramment étudiée dans le néocortex. Pourtant, la complexité des circuits neuronaux de cette structure (par rapport à l'hippocampe), ainsi que l'incapacité à garder vivante néocortex in vitro avec les fonctions immunitaires au repos pendant des périodes prolongées, la rendre moins utile en tant que préparation in vitro permettant de définir les conséquences à long terme de la sensibilité SD. En revanche, l'hippocampe n'est pas seulement la structure du cerveau qui est le plus sensible au développement durable, c'est aussi une structure archicortical avec une structure de circuit neuronal plus simplifiée et la fonction, qui est bien adapté pour définir les moyens par lesquels neuro activité neuronale peut moduler la susceptibilité SD .

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NS-19108), le National Institute of Child Health et la maladie (PO1-HD09402), la Fondation de recherche Migraine et la Fondation Blanche. Mme Marcia P. Kraig aidé à la préparation et l'entretien des systèmes de culture.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010
Earle's Balanced Salt Solution Sigma E2888
Horse Serum Invitrogen 26050-088
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
Fungizone Invitrogen 15295
D-glucose Sigma G8769

Table 1. Culture Preparation and Maintenance: Horse Serum Medium
Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Invitrogen 21103
Gem-21 Neuroplex Gemini Bioproducts 400-160-010
Glutamax Invitrogen 35050
Gentamicin Invitrogen 15710-064
D-glucose Sigma G8769
Ascorbic acid Sigma A4544
Fungizone Invitrogen 15295
Sodium chloride Sigma S6546
Magnesium chloride Sigma M1028
Calcium chloride Sigma 21115

Table 2. Culture Preparation and Maintenance: Serum-free Medium
Name Company Catalog Number Comments
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) Thermo Fisher PICM0-3050
6-well Falcon culture dishes Thermo Fisher 08-772-1B
Sytox Green Invitrogen S7020

Table 3. Materials fabrication: Ground Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Glass capillary tubes A-M Systems, Inc. 2mm x 1.16mm, 4 inches
KCl Sigma P5405
Agar Fisher Scientific A360
EDTA Sigma 5134
Tubing Masterflex 95809-34
1.5 mL centrifuge tube rack Fisher Scientific
Silver wire Medwire AG15X
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
Emery board Walgreens
Scintillation vial Fisher Scientific
Flexible adhesive sealant Amazing Goop
Bleach Clorox

Table 4. Materials fabrication: Ground Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Borosilicate filament Sutter Instruments BF150-86-10 1.5 x 0.86 mm
Micr–lectrode puller Narashige PE-2
Eye piece optical micrometer Zeiss
Stage optical micrometer Zeiss
Compound Microscope Zeiss
Microscope slides Surgipath 00210
1-Dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MO-10
3-dimensional micr–lectrode manipulator Narashige MM-3
Adhesive putty Scotch
100 mm Nalgene containers Fisher Scientific

Table 5. Materials fabrication: Recording Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Teflon-coated platinum iridium wire A-M Systems 7780 125 μm bare, 200 μm coated
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Hemostat Fine Scientific Tools 13018-14
30 gauge wire Tensolite
Soldering iron Cooper Tools UTC 100
Solder Bernzomatic Resin core, lead free, silver bearing
Concentrated HCl Fisher Scientific A144-212
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-30
Water-resistant epoxy JB Weld
Banana jacks Newark Electronics

Table 6. Materials fabrication: Stimulating Electrodes
Name Company Catalog Number Comments
Falcon 35 mm culture dish Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Cotton squares Walgreens
Forceps Thermo Fisher 13-812-38
Tubing Masterflex 95809-34
Poly vinyl chloride film Fisher Scientific 01810 18 inches x 1000 feet
#9 single edge razor blade Smith

Table 7. Materials fabrication: Recording Dishes
Name Company Catalog Number Comments
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
pH meter Beckman 250 Battery operated
Mini Type-T thermocouples Physiotemp IT series
DigiSense thermometer Cole-Palmer 8528-10
Inline heater Warner Instruments SH278
Gibraltor table Burleigh
Inverted microscope Leica DMIRE2
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541
Cautery tool Gemini Battery operated
Micr–lectrode micromanipulators Narashige WR60 Left and right
Stabilized power supply MGE UPS systems Ellipse 1200 +/- 5 volts (120 total)
Axoprobe amplifier system Axon instruments 1-A
Active filter Frequency Devices Model 900
Axoscope Digidata Axoscope 1322-A
Axoscope software Axoscope v. 9
Computer systems Dell Precision T5400
Origin8 OriginLab Corp v. 8.1
Stimulator isolation unit Bak Electronics, Inc. BSI-II
1/2 inch position magnets Dexter PMO90-3
3 inch position magnets Dexter PMC-800T
Multiple X-Blocks Narishige X-12 For positioning ball joints
Valves Hamilton HVD-3 For medium delivery
Syringe pump Razel A99
Digital oscilloscope Agilant technologies
Digital camera system Quant EM 512-SC
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Microscope objective focus with Pi foc Physik Instrumente E-662.LR
Smart shutter Lambda SC
Dual wavelength fluorescent microscopy Applied Scientific Instruments Polychrome II
Peristaltic pumps Masterflex 77120-62
Aspirator Harvard Apparatus PDMI component

Table 8. Electrophysiological Setup
Name Company Catalog Number Comments
1 M Magnesium Chloride Sigma 057K8620
1 M Manganese Chloride Sigma 018K6107
1 M Calcium Chloride Sigma GA10984
AlexaFluor594-tagged Isolectin-IB4 Invitrogen I21413
Neurobasal Invitrogen 21103
Polyvinyl chloride film Fisher Scientific 01810
MetaMorph Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DMIRE2
Camera QuantEM 512SC
UV light Kubler CODIX
Bipolar Temperature Controller Medical Systems Corp TC-202
Smart shutter Lambda SC
Sytox Green Invitrogen S7020
Falcon 35 mm culture dishes Becton Dickinson Labware
Glass filament tubes Sutter Instrument Co. BF100-58-10 1.0 mm, 12 mm long
Tubing Masterflex 95809-34
Recording chamber Medical Systems Corp. PDMI-2 Recording chamber
Bipolar temperature control Medical Systems Corp. TC-202
Combination pH electrode Microelectrodes Inc. MI-413
Gibraltor table Burleigh
Anti-vibration Table Technical Manufacturer’s Corp 63-541

Table 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures
Name Company Catalog Number Comments
RNAlater Ambion AM7021
RNase/DNase-free 1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
Diamond knife Fine science tools 10100-00
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
TRIzol Invitrogen 15596-026
Centrifuge Eppendorf 5451C
Vortex-genie VWR G-560

Table 10. PCR Preparation: Slice Culture Harvest
Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Sigma C-2432
Centrifuge Eppendorf 5451C in cold room
Ethanol, 200 proof for molecular biology Sigma E7023
RNeasy Micro kit Qiagen 74004

Table 11. PCR Preparation: RNA Extraction
Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 2000 Thermo Fisher ND-2000
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid Sigma M-1254
ssRNA ladder NEB N032S
Sodium acetate Sigma S-9513
EDTA Sigma E5134
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000

Table 12. PCR Preparation: RNA Quantification
Name Company Catalog Number Comments
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1
iCycler iQ PCR plates, 96 well Bio-Rad 2239441
Flat cap strips - optically clear. 8-cap strip Bio-Rad TCS0803
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8890
iQ SYBR Green supermix Bio-Rad 170-8880
Ultrapure Agarose GibcoBRL 15510-019
10x TAE buffer GibcoBRL 15558-026
Microwave Samsung SJ0390W
RNase Away Molecular Bioproducts 7000
Ethidium Bromide solution Bio-Rad 161-0433
OWL easycast horizontal mini-gel systems Thermo Fisher B1
Electrophoresis power source Bio-Rad PowerPac HC
Name sequence
TNF-α F 5’ - ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3’
TNF-α R 5’ - CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3’
Rpl13a F 5’ - TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3’
Rpl13a R 5’ - CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3’

Table 13. PCR Activities: qPCR primer optimization and pre-screening
Name Company Catalog Number Comments
RT2 Profiler PCR array SABiosciences PARN-021
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis kit SABiosciences C-06
RT2 Nano preAMP cDNA synthesis primer mix SABiosciences PBR-3021
RT2 SYBR Green/ fluorescein qPCR master mix SABiosciences PA-011
RT2 qPCR Primer Assay for Rat IFN-λ SABiosciences PPR45050C
Multichannel pipettor Corning
25 mL Bio-pure reservoir with divider Diversified biotech REBP-2000
iCycler thermocycler Bio-Rad iCycler Optical Module
iCycler system software Bio-Rad v. 3.1

Table 14. qPCR array plates and low level signaling
Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Fisher Scientific Micro 7
Cell lysis kit Bio-Rad 171-304011
BSA protein stock Bio-Rad 500-0007
BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225
Sealing tape Bio-Rad 2239444
96-well plate reader Perkin Elmer 1420-multilabel counter
Phospho 6-plex Assay Lysates Bio-Rad X7000000502
Phospho 6-plex coupled beads Bio-Rad X700000050

Table 15. Multiplex Phosphoprotein Assay
Name Company Catalog Number Comments
Accell 5x siRNA Buffer Thermo Scientific B-002000-UB-100
Accell siRNA Delivery Medium Thermo Scientific B-005000-100
Accell Cyclophilin Pool-Rat Thermo Scientific D-001920-30-05

Table 16. siRNA

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Lysine Sigma L-6001
Sodium phosphate Fisher Scientific S374-1
Sodium periodate Sigma S-1878
Sodium azide Sigma S-2002
Cryostat Leica CM3050 S
Tissue-Tek Ted Pella Inc. 27050
Fine-tip paint brush Ted Pella 11806
Tissue slides Surgipath 00210
Coplin jars Fisher 08-815
Hydrogen peroxide (30%) Sigma H1009
SFX signal enhancer Invitrogen A31631
Goat serum Colorado Serum Company CS 0920
Triton X-100 Sigma T-8787
Anti-NFκβ antibody Santa Cruz SC-109
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012
Yo-yo nuclear counterstain Invitrogen Y-3601
ProLong antifade Invitrogen P7481

Table 17. Proteomic Confirmation Via Immunohistochemistry
Name Company Catalog Number Comments
Anti-cyclophilin B R&D Systems MAB5410
3,3-diaminobenzidine Sigma D8001
Water bath Pharmacia Biotech 56-1165-33 Gebrüder HAAKE GmbH
Ammonium hydroxide J.T.Baker 9721-03
Silver nitrate Sigma S-0139
Sodium thiosulfate (pentahydrate) J.T.Baker 3949-01 &nsp;
0.2% gold chloride Sigma G-4022
Oxalic acid Sigma O-0376
CoolSnap fx CCD camera Photmetrics
MetaMorph software Molecular Devices v. 7.5.04
Inverted microscope Leica DM IRBE
Neutral density filters Chroma 0.5-3.0 optical density unit range

Table 18. Proteomic Confirmation Via Silver Enhanced Immunohistochemistry

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References

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  3. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha. J Neurosci. 28 (47), 12199-12211 (2008).
  4. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
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  7. Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for study of neuroprotection from cold-preconditioning. J Vis Exp. (43), (2010).
  8. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17 (1), 26-43 (1997).
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