Summary
هنا ، نحن تصف كفاءة عالية الإنتاجية
Abstract
تطوير الجهاز البولي التناسلي السفلي (طرفية) هي عملية معقدة. ويتجلى هذا التعقيد خلال تشكيل البروستاتا من مجرى البول الجنين الذكر ، والذي يعتمد على إشارات وأندروجيني الظهارية - الوسيطة 1،2 التفاعلات. قد فهم الآليات الجزيئية المسؤولة عن التنمية البروستاتا تكشف آليات النمو التي أيقظ بشكل غير لائق في وقت لاحق في الحياة أن يؤدي إلى نشوء أمراض البروستاتا مثل تضخم البروستاتا الحميد وسرطان البروستاتا.
وLUT النامية معقدة تشريحيا. من البروستاتا الوقت الناشئين يبدأ في تصور آخر 16.5 يوما (DPC) ، العديد من أنواع الخلايا موجودة. الأوعية الدموية والأعصاب والعضلات الملساء الموجودة داخل سدى الوسيطة 3. هذا سدى يحيط ظهارة متعددة الطبقات ويثير البروستاتا الجنين من خلال مستقبلات الاندروجين التي تعتمد على اشارات نظير الصماوي 4. هوية مستقبلات الاندروجين اللحمية التي تستجيب للجينات اللازمة للتنمية البروستاتا والآلية التي لا تشكل البروستاتا ظهارة الأقنية استجابة لهذه الجينات مفهومة تماما. القدرة على التعرف على أنواع الخلايا بدقة التعبير وتوطين من العوامل المحددة في داخلها لا بد من زيادة فهم التنمية البروستاتا. التهجين في الموقع (ISH) يسمح لتوطين mRNAs داخل الأنسجة. وبالتالي ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد نمط وتوقيت التعبير عن جزيئات الإشارات والمستقبلات الخاصة بهم ، وبالتالي توضيح المنظمين المحتملين البروستاتا التنموية.
هنا ، نحن تصف ISH إنتاجية عالية التقنية لتحديد أنماط التعبير مرنا في طرفية الماوس الجنين باستخدام تهتز مشراح قطع المقاطع. هذا الأسلوب يوفر مزايا عديدة أكثر من البروتوكولات ISH الأخرى. أداء ISH على المقاطع رقيقة تنضم إلى شريحة من الصعب من الناحية الفنية ، وكثيرا ما cryosections نوعية الهيكلية الفقراء في حين أن كلا cryosections البارافين والمقاطع غالبا ما تؤدي إلى القرار إشارة ضعيفة. ويمكن أداء ISH على أنسجة جبل بأكمله في محاصرة نتيجة التحقيق. في المقابل ، لدينا إنتاجية عالية التقنية تستخدم قطع سميكة المقاطع التي تكشف بالتفصيل بنية الأنسجة. أنابيب microfuge تعديل تسمح سهولة التعامل من خلال المقاطع الإجراء ISH. ويمكن فحص كحد أقصى المحاضر مرنا 4 من طرفية a 17.5dpc واحد مع ما يصل الى 24 مرنا النصوص المكتشفة في شوط واحد ، وبالتالي تقليل التكاليف وتعظيم الكفاءة. هذا الأسلوب يسمح لمعالجتها معالجة مجموعات متعددة مماثل وكوحدة واحدة ، وبالتالي إزالة أي تحيز لتفسير البيانات. الأكثر تعلقا الباحثين البروستاتا ، وهذا الأسلوب يوفر الموقع المكاني والزماني للالمنخفضة والعالية وفرة النصوص مرنا في مجرى البول الماوس الجنين الذي يولد لشبكة الأقنية البروستاتا.
Protocol
1. التوليف من Riboprobe Digoxigenin - 11 - UTP المسمى من قالب PCR - منشأ
- لتوليف riboprobe الجينات المحددة ، واستخدام الجينات Entrez (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) للحصول على تسلسل الجين مرجع [كدنا] (RefSeq). استخدام برنامج Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 لتصميم جينات محددة الاشعال PCR ضد المنطقة 3' - تسلسل [كدنا]. يتم وصف المعلمات الموصى بها لاختيار التمهيدي PCR في مكان آخر (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
- استخدام برنامج MegaBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi؟taxid=10090) 6 لتقييم نوعية من تسلسل الحمض النووي المحدد. يعتبر تسلسل الحمض النووي محددة ، عندما تستخدم عتبة نتوقع من 0.01 ، فإنه لا تتلاءم مع تسلسلات الأخرى في قاعدة البيانات RefSeq.
- PCR تضخيم قالب riboprobe. وينبغي أن يكون الأمثل PCR تفاعل المكونات والظروف thermocycling لكل مجموعة التمهيدي. نموذجي يحتوي على 50 ميكرولتر رد فعل : 1X العازلة ، 2mm وMgCl 2 ، dNTPs 0.2mM ، 1X حل Q ، 1μg [كدنا] ، الحمض النووي بوليميريز طق 2.5U والشعائل 0.25μm وnuclease خالية H 2 O. بروتوكول نموذجي يتضمن thermocycling تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 40 2min تليها دورات درجة مئوية ل30sec 94 و 57 درجة مئوية لمدة 30sec ، و 72 درجة مئوية لمدة 1min والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية ل10min. يتم تصنيعه في [كدنا] المستخدمة في تفاعلات PCR مرنا من الماوس البولي التناسلي.
- فصل منتج PCR بواسطة agarose هلام إستشراد ، تنقية باستخدام أدوات استخراج جل ، وتحديد المنتجات يطهر القياس الطيفي. العائد المتوقع هو 1.2 -- 3.6μg.
- تدوين المنتج PCR في riboprobe المسمى. رد الفعل النسخ (40 ميكرولتر) يحتوي على : 400ng المنقى PCR المنتج ، 1X مزيج العلامات التي تحتوي على النوكليوتيدات digoxigenin 11 - UTP ، 1X العازلة النسخ ، 5U المانع ريبونوكلياز ، 80U بوليميريز RNA T7 ، وnuclease خالية H 2 O. احتضان 3 4hr في 37 درجة مئوية ، وتستنهض الهمم عينات كل 30min.
- استخدام عدة Qiagen RNEASY البسيطة لتنقية riboprobes بناء على تعليمات من أجل تنظيف RNA مع الهضم الدناز على العمود. Quantitate riboprobes بواسطة القياس الطيفي. العائد المتوقع هو 40-20 ميكروغرام. تقييم الجودة التحقيق من خلال فصل an قسامة الكهربائي بواسطة الجل على 1.5 ٪ agarose غير تغيير طبيعة. تحقيقات ذات جودة عالية كما تهاجر نطاقات متميزة مع الحد الأدنى من تلطيخ.
- لضمان riboprobe يسلم على وجه التحديد المستهدف ، وتشمل الأنسجة مراقبة إيجابية لتجربة ISH الأولى. ينبغي أن يكون معروفا للنمط riboprobe مرنا المستهدفة في هذا النسيج مراقبة إيجابية.
2. إعداد مشراح بالاهتزاز بليد (استنادا إلى البروتوكول هو موضح سابقا) 7
- إعداد 4 ٪ حل agarose المنخفضة تذوب في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). الميكروويف الحل بحل agarose والحفاظ على الحل عند 62 درجة مئوية.
- إعداد قالب حلقة البوليسترين عن طريق إزالة غشاء من صفيحة قطرها 12mm الثقافة Millicell إدراج جيدا والاحتفاظ بها خاتم البوليسترين لاستخدامها كعامل agarose العفن. نقع الحلقات بين عشية وضحاها في حل المانع ريبونوكلياز قبل كل استعمال.
- لضمان سلاسة سطح القطع ، وإزالة الصدأ المانع والمضافات الأخرى من سطح النصل ويلكنسون من قبل الشطف مع المذيبات التالية ، عند تركيز 100 ٪ : أثير البترول والزيلين ، والكلوروفورم ، والميثانول ، والمياه MilliQ. فصل شفرة مزدوجة طوليا الى قسمين واحد ريش.
- تلتزم ريش ويلكنسون لنصل مشراح وكتايت بمادة لاصقة. لم يتم استخدام شفرة لقطع مشراح ، بل يضيف إلى جمود النصل ويلكنسون. وينبغي قطع النصل مشراح لطول النصل ويلكنسون باستخدام المقصات المعدنية ، وانضمت مرة واحدة ، يجب أن يقابله 3 -- 4mm من على حافة قطع النصل ويلكنسون.
3. تشريح ، التخزين ، والتحضير للمناديل البولي التناسلي للSectioning
- إعداد PBSTw حل (PBS تحتوي على 0.1 ٪ توين ™ 20 و 0.2mM أزيد الصوديوم وتصفيتها من خلال Stericup 0.22μm ® حدة التصفية). يمكن إعداد الحل مقدما وتخزينها على 25 درجة مئوية.
- احتضان طرفية الماوس تشريح طازجة (المثانة والإحليل الحوض ، وما يرتبط بها من هياكل وولفية Mϋllerian القناة المستمدة) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 4 ٪ تثبيتي بارافورمالدهيد.
- يذوى الأنسجة لغسيل 10min عند 25 درجة مئوية في سلسلة متدرجة من الميثانول / PBSTw (1:3 ، 1:1 ، 3:01 V / V) الحلول. عينات في مخزن -20 درجة مئوية في الميثانول بنسبة 100 ٪ على الاقل خلال الليل. يجوز إبقاء الأنسجة المحفوظة على الأقل 2yr.
- تحضير للأنسجة التي sectioning المضادة للجفاف الأنسجة المحفوظة. ليغسل 10min عند 25 درجة مئوية في سلسلة متدرجة من الميثانول / PBSTw (3:1 ، 1:1 ، 1:03 V / V) الحلول.
- تشريح وتجاهل ما يقرب من ثلثي المثانة ، وترك معظم منطقة المثلث التي تعلق على مجرى البول.
- مكان القالب الدائري البوليسترين ، أسفل سطح مستو ، على 25 درجة مئوية الزجاج العادي شريحة المجهر.
- ملء القالب الدائري مع 62 ° C حل agarose وباردة لمدة 2min.
- إزالة الأنسجة طرفية من وصمة عار PBSTw جافة ماصة على مسح.
- نقل الأنسجة في حل agarose.
- استخدام ملقط لتوجيه الأنسجة طرفية في agarose بحيث علق العمل به في منتصف الطريق بين الجزء العلوي والسفلي من العفن الدائري والنسيج في احتضان 4 درجات مئوية حتى agarose وطدت.
- إذا كان النسيج المصارف تماما أثناء عملية التصلب agarose ، يمكن رفعه فإنه من agarose وإعادة المضمنة. ضبط الوقت تبريد agarose حسب الحاجة أثناء عملية إعادة التضمين.
5. Sectioning نسيج البولي التناسلي مع وجود مشراح بالاهتزاز (استنادا إلى البروتوكول هو موضح سابقا) 7
- جبل النصل ويلكنسون تعزيزه في مشراح تهتز وتعيين زاوية النصل إلى 35 درجة. ملء حوض الاستحمام الفاخرة عينة الجليد مع حزمة برنامج تلفزيوني والرطب حول حمام العينة.
- إزالة المكونات agarose طدت من العفن الدائري وصمة عار على السطح السفلي مع ماصة القضاء. تحقق من أن الأنسجة توجه بشكل صحيح. ويمكن تعديل اتجاه الأنسجة باستخدام شفرة حلاقة لشطبة حافة المسطح من المكونات agarose.
- تلتزم قابس agarose على عينة مشراح تهتز تصاعد القرص بمادة لاصقة وكتايت كما هو مبين في الشكل. 1A.
- إدراج القرص عينة المتصاعدة في vibratome.
- ضبط سمك مقطع لمشراح 50μm ، والسرعة إلى 2 ، والسعة نصل إلى 4 أقسام وتبدأ خفض الأنسجة.
- استخدام الملقط حادة لنقل كل قسم الأنسجة (الشكل 1B) إلى لوحة الثقافة 24 - جيدا جيدا أن يحتوي على الجليد الباردة PBSTw 0.5mL.
- لإعداد العينات للفي الموقع المكوس ، تهجين معظم agarose حول كل قسم الأنسجة (في agarose المتبقية سوف تذوب أثناء إجراء ISH) ، وإزالة جميع الأنقاض المرتبطة بها. أقسام تخزين ما يصل إلى 48hr عند 4 درجة مئوية في PBSTw.
6. تحضير العينة للحصول على سلة في الموقع التهجين
- قطع الجزء السفلي من أنبوب في علامة microcentrifuge 100μL.
- الحرارة على حافة قطع من الأنبوب في لهب حتى خففت من البلاستيك ، ثم اضغط على أنبوب microcentrifuge بقوة على مركز مربع البوليستر شبكة 0.5in.
- تقليم شبكة الزائدة واستخدام إبرة ساخنة قياس 18 إلى اثنين من الثقوب في كل ثقب غطاء أنبوب لاستكمال إعداد سلة (الشكل 1C).
- إزالة غطاء لوحة 24 وكذلك حفر حفرة 12mm طيرانها فوق كل بئر. تستخدم غطاء لنقل عينة سلال بين يغسل البروتوكول ISH (شكل 1D).
7. تحضير الجنين للحصول على مسحوق في الموقع التهجين (استنادا إلى البروتوكول هو موضح سابقا) 8
- جمع الماوس أنسجة أجنة الفئران التي هي من نفس المرحلة كما المقاطع الأنسجة التي يجري تقييمها وتخزينها في -80 درجة مئوية. مكان الأنسجة المجمدة في منديل السيراميك هاون يغرق في النيتروجين السائل ، واستخدام مدقة لطحن الأنسجة الى مسحوق ناعم.
- الجمع بين مسحوق الجنين مع 4 مجلدات من الأسيتون والتجانس مع ضربات عدة من الخالط dounce.
- نقل جناسة لولبية من الزجاج 15mL أعلى القارورة وبين عشية وضحاها في استخراج 4 درجات مئوية.
- بيليه مسحوق الجنين بواسطة الطرد المركزي في 5000rpm ل10min في 4 درجات مئوية. إزالة والتخلص من الدهون التي تحتوي على طاف. Resuspend بيليه في الأنسجة في 4vol من الاسيتون الطازجة واستخراج ل2hr في 4 درجات مئوية.
- بيليه مسحوق الجنين بواسطة الطرد المركزي في 5000rpm ل10min في 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل طاف.
- الهواء الجاف وبيليه على ورقة Whatman # 2 التصفية. سحق بيليه لانتاج مسحوق ناعم وتخزينها في قارورة زجاجية محكمة الغلق في 4 درجات مئوية. العائد التقريبي هو 50 ملغ لكل 1 مسحوق وزن الجنين ز الرطب.
8. وفي اليوم الموقع التهجين 1
- سخن حل prehybridization (formamide 50 ٪ ، SSC 5X ، 1 ٪ كاشف الحظر ، 10μg/mL الخميرة الحمض الريبي النووي النقال ، 10μg/mL الهيبارين في مخزن -20 درجة مئوية) إلى 60.5 درجة مئوية. يمكن تحضير هذا الحل مسبقا وحفظها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- إعداد غرفة ترطيب التهجين عن طريق ملء حاوية تخزين صغيرة من البلاستيك مع حوالي 0.5 في مياه الحنفية. تغطية الحاويات وسخن إلى 60.5 درجة مئوية.
- إضافة 2mL PBSTw إلى آبار لوحة الثقافة 24 أيضا. سلال عينة مكان في ثقوب الغطاء 24 لوحة وكذلك المقاطع نقل الأنسجة في سلال (واستخدمت ما يصل إلى 10 في سلة المقاطع).
- أقسام الأنسجة لاحتضان 30min عند 25 درجة مئوية في 6 ٪ H 2 O 2. وينبغي القيام بذلك وبجميع حضانات اللاحقة بها مع التحريض على طيف شاكر المداري ، ما لم يرد خلاف ذلك. جميع حضانات anوتجرى في 24 د يغسل جيدا ، لوحات واستخدام وحدة تخزين ما مجموعه حل 2mL/well.
- غسل أقسام الأنسجة 4 × 5min عند 25 درجة مئوية في PBSTw.
- أقسام الأنسجة لاحتضان 12min عند 25 مئوية في PBSTw تحتوي على بروتين كاف 5μg/mL °
- غسل أقسام الأنسجة 1 × 5min عند 25 درجة مئوية في PBSTw.
- أقسام الأنسجة بعد إصلاح 20min عند 25 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني يتضمن بارافورمالدهيد 4 ٪ و 0.2 ٪ غلوتارالدهيد.
- غسل أقسام الأنسجة 2 × 5min عند 25 درجة مئوية في PBSTw.
- إضافة 2mL/well المخزن المؤقت prehybridization prewarmed واحتضان أقسام الأنسجة داخل غرفة التهجين مرطب على الأقل في 1hr 60.5 درجة مئوية.
- إضافة 0.65μg riboprobe المسمى إلى المخزن المؤقت prehybridization في كل أقسام الأنسجة بشكل جيد واحتضان بين عشية وضحاها ، في قاعة التهجين في ترطيب 60.5 درجة مئوية.
9. وفي اليوم الموقع التهجين 2
- إعداد الحلول التالية للحصول على خطوات الغسيل بعد التهجين : حل 1 (formamide 50 ٪ ، SSC 5X ، SDS 1 ٪) ، حلول 2 (تريس 10MM - HCL الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 0.5M كلوريد الصوديوم ، 0.1 ٪ توين ™ 20 ، أزيد الصوديوم 0.2mM ، 0.22μm المصفاة) ، والحل 3 (2X محكمة أمن الدولة ، 50 ٪ formamide). يمكن إعداد هذه الحلول مقدما. يتم تخزين حلول 1 و 3 في -20 درجة مئوية ، ويتم تخزين الحل 2 عند 25 درجة مئوية. الحياة تخزين الحلول 3 أشهر على الأقل.
- غسل أقسام الأنسجة 3 X 60.5 في 30min درجة مئوية مع درجة حرارة ما قبل الحل 1. استخدام الغرفة خلال ترطيب يغسل.
- غسل أقسام الأنسجة 1 X 60.5 في 10min درجة مئوية مع حلول 1/Solution قبل تحسنت 2 (1:1 V / V) حل. استخدام غرفة ترطيب أثناء الغسيل.
- غسل أقسام الأنسجة 4 X 10min عند درجة 25 مع الحل 2.
- احتضان الأنسجة أقسام لل15min عند 37 درجة مئوية في محلول يحتوي على 2 0.25μg/mL ريبونوكلياز.
- غسل أقسام الأنسجة 1 X 10min عند 25 درجة مئوية مع حلول 2 (دون ريبونوكلياز).
- غسل أقسام الأنسجة 1 X 10min عند 25 درجة مئوية مع حلول 3 ، 2 تليها X1hr يغسل عند درجة 60.5 مع محلول 3. استخدام مرطب الغرفة خلال يغسل 60.5 درجة مئوية.
- إعداد الحلول التالية للكشف المناعى للriboprobes DIG المسمى : حظر مؤقت الأنسجة (السل ، 1X TBS ، و 10 ٪ مصل الأغنام ، 1 ٪ كاشف حظر ، BSA 1 ٪ ، 0.1 ٪ توين ™ 20 ، 0.22μm المصفاة) ، التخفيف جسم العازلة (AD ، 1xTBS ، 5 ٪ مصل الأغنام ، 1 ٪ كاشف حظر ، BSA 1 ٪ ، 0.1 ٪ توين ™ 20 ، أزيد الصوديوم 0.2mM ، 0.22 م ™ تصفيتها) العازلة امتصاص جسم (AA ، 1xTBS ، 5 ٪ مصل الأغنام ، 1 كاشف حظر ٪ ، 1 ٪ BSA ، 6mg/mL مسحوق الجنين) ، وTBSTw (1xTBS ، 0.1 ٪ توين ™ 20 ، 0.2mM أزيد الصوديوم ، 0.22μm المصفاة). يمكن إعداد هذه الحلول مقدما. يتم تخزين TBSTw في 25 درجة مئوية ، يتم تخزين كل الحلول الأخرى في -20 درجة مئوية.
- تغسل 3 X 10 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية مع TBSTw.
- احتضان المقاطع الأنسجة 2hr على الأقل عند 25 درجة مئوية في المخزن السل.
- بينما تحتضن في الأنسجة العازلة السل ، إضافة 1.1μL المضادة للأجسام المضادة في DIG العازلة AA 200μL لكل بئر. احتضان AA + العازلة الأضداد على الأقل 2hr عند 4 درجة مئوية ، ثم الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة ل1min. إزالة طاف AA العازلة وإضافته إلى المخزن المؤقت 2mL ميلادي.
- إزالة أجزاء من الأنسجة العازلة السل واحتضان لهم ليلة في غرفة ترطيب عند 4 درجة مئوية في ميلادي العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة.
10. وفي يوم 3 الموقع التهجين
- يعد اللون التنمية NTMT الحل (100mM تريس - HCL الرقم الهيدروجيني 9.5 ، كلوريد الصوديوم 100mM ، MgCl 50mM 2 ، 0.2mM أزيد الصوديوم ، 0.22μm المصفاة). يمكن تحضير هذا الحل مسبقا وتخزينها في 25 درجة مئوية. مباشرة قبل استخدامها ، إضافة 2mm وlevamisole و 0.1 ٪ توين 20 ™.
- الحل إزالة الأجسام المضادة (AD الضد + عازلة) من الآبار وتخزين الحل في 4 درجات مئوية. ويمكن إعادة استخدامها ما يصل الى اثنين مرات إضافية.
- غسل الأنسجة 8 X 10 دقيقة عند 25 مئوية مع TBSTw تحتوي 2mm وlevamisole درجة.
- نقل الأنسجة بعناية من سلال للطبق بتري تحتوي TBSTw. استخدام ملقط لازالة الحطام وضوحا. نقل الأنسجة في أنابيب microcentrifuge نظيفة.
- غسل الأنسجة 1 X 10 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية مع NTMT 1mL.
- إزالة وإضافة NTMT 1mL/tube من خليط يحتوي على 50 ٪ NTMT (التي تحتوي على 2mm وlevamisole) ، و 50 ٪ بيربل BM ، وأنابيب مكان في ضوء مربع المحمية واحتضان عند 25 درجة مئوية. لون الوقت اللازم لتطوير تتراوح بين عدة ساعات إلى عدة أيام. إذا كان اللون هو البطء في التطور ، ويمكن استخدام 100 ٪ BM الأرجواني.
- رصد التنمية وتغير لون NTMT / حل بيربل BM اذا تتراكم بلورات عجل أو إذا كان يخضع لتغيير اللون من الأصفر إلى الأرجواني بعد تطوير بالألوان الكاملة (4-250 ساعة) ، والأنسجة يغسل 2 X 5min عند 25 درجة مئوية مع 1mL/tube من NTMT تحتوي 2mm وlevamisole.
- احتضان الأنسجة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في 1mL/tube من برنامج تلفزيوني يتضمن بارافورمالدهيد 4 ٪ بعد تثبيتي درجة.
- لتبييض الأنسجة ، والأنسجة لاحتضان 30min عند 25 درجة مئوية في 1mL/tube من PBSTw تحتوي على 3 ٪ H 2 O 2
- هي التي شنت على شرائح الأنسجة المقاطع الزجاج ، coverslipped ، والتقط باستخدام المجهر المركب.
11. ممثل النتائج :
التوجه المكاني للنسيج في طرفية agarose يحدد الطائرة أقسام الأنسجة. لأبواب السهمي ، ورفعه على الأقل ثلثي المثانة وجزءا لا يتجزأ من النسيج LUT المتبقية في آغار بحيث خط الوسط الإحليل موازية للسطح مستو من المكونات agarose (الشكل 1A). ويمكن إجراء تعديلات طفيفة في الطائرة التي الأنسجة تجليف حافة المسطح من المكونات agarose. ويبين القسم ممثل السهمي من الأنسجة LUT الذكور 17.5dpc التي توجه في هذه الطائرة في الشكل 1B.
سلال عينة حماية الأجزاء الحساسة من النسيج من الخسارة وتراكم الغبار والجسيمات أثناء إجراء عدة أيام ISH. وتعد السلال عينة من ذوبان شبكة البوليستر إلى نهاية خفض أنبوب microfuge 1.5mL (الشكل 1C). غير مثقوب ثقب صغير في غطاء كل سلة عينة لتسهيل تدفق الى حل والخروج من السلال. يتم تعليق سلال عينة في حلول ISH عن طريق وضعها في ثقوب 12mm ثقبه أغطية لوحة 24 كذلك (1D الشكل). أغطية لوحة تعديل سلال الدعم عندما يتم نقل ما بين 24 لوحات جيدة خلال التغييرات الحل.
فإنه يمثل تحديا للحد غير محددة تلوين الخلفية أثناء فترات الحضانة الطويلة اللازمة للكشف عن وفرة mRNAs منخفضة. ويبدو إضافة إلى أزيد الصوديوم 0.2mM مخازن العينة والترشيح في وقت لاحق من خلال مرشحات للحد من 0.22μm تلوين الخلفية (الشكل 2). باستخدام الطريقة الموصوفة هنا وهناك ، لا يبدو أن هناك اختلافات واضحة في تلوين الخلفية عندما يتم تحضين العينات في حل تنمية اللون لفترات زمنية طويلة (الشكل 3).
الشكل 1. التحضير للماوس أقل المسالك البولية التناسلية الأنسجة (طرفية) الباب وأنبوب microcentrifuge ISH للسلة. مضمن ألف طرفية تحتوي على جزء من مجرى البول والمثانة والحوض ويرتبط ولفية Mϋllerian هيكل القناة المشتقة) في قابس اسطوانية من agarose المنخفضة تذوب 4 ٪. (أ) هي لاصق والمكونات إلى قرص العينة المتزايدة و (ب) مقطعة إلى أجزاء 50μm مع مشراح تهتز. (ج) يتم نقل القسم طرفية في سلة microcentrifuge الأنبوب الذي يعده ثقب ثقبا في غطاء الأنابيب والصمامات شبكة البوليستر لخفض نهاية الجزء السفلي من الأنبوب. (د) يتم إدخال أنبوب إلى ثقوب microcentrifuge 12mm ثقبه غطاء لوحة 24 - جيدا بحيث يتم تعليق أقسام النسيج في محلول العازلة خلال بروتوكول ISH. السهام تشير إلى الأنسجة طرفية في المكونات agarose.
الشكل 2. إدماج أزيد الصوديوم في 0.2mM 0.22μm حلول تصفية يحسن نوعية الأنسجة ويقلل تلوين الخلفية. وكانت مساحات 17.5dpc الماوس الذكور البولي التناسلي السفلي (طرفيات المستعملين المحليين) مقطوع في طائرة السهمي لسمك 50μm. وكانت ملطخة أقسام الأنسجة التي ISH باستخدام المسبار الموجه ضد homolog تويست 1. وكانت مخازن تستخدم لISH إما (A) 0.22μm تصفيتها وتستكمل مع أزيد الصوديوم 0.2mM (نعاز) أو (ب) استكملت وليس مع حركة التحرير الوطني الفلسطيني نعاز. السهام تشير تلوين الخلفية. والتقاط الصور في نفس التكبير. النتائج هي ممثل لأنماط تلطيخ الفئران ن القمامة المستقلة = 3.
تلوين الخلفية الرقم 3. الكثافة لا يبدو أن تزيد مع تنمية اللون لفترة طويلة. وكانت مساحات 17.5dpc الماوس الذكور البولي التناسلي السفلي (طرفيات المستعملين المحليين) مقطوع في طائرة السهمي لسمك 50μm. وكانت ملطخة المقاطع التي ISH التي تفرخ لهم في حل لتلطيخ chromagen (A) 9.5h باستخدام المسبار الذي يعترف نص فرة عالية الاستروجين المتصلة مستقبلات غاما (Esrrg) ، (B) ل43.5h باستخدام المسبار الذي يعترف فرة المتوسط bromodomain نص المتاخمة لنطاق الاصبع الزنك ، 2A (Baz2a) ، أو (C) ل236h باستخدام المسبار الذي يعترف نص فرة منخفضة مجنح من نوع MMTV التكامل موقع الأسرة ، وعضو 10A (Wnt10a). والتقاط الصور في نفس التكبير. النتائج هي ممثل لأنماط تلطيخ الفئران ن القمامة المستقلة = 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام الطريقة الموصوفة هنا ، فإنه من الممكن الكشف عن mRNAs في جميع أنواع الخلايا الرئيسية ومقصورات أنسجة الجنين الماوس طرفيات المستعملين المحليين من الذكور والإناث بما في ذلك منصات الوسيطة ، الظهارة البولية ، العضلات الملساء ، براعم البروستاتا ، لاصق قذفي والمهبل. المقاطع 50μm المستخدمة في هذا البروتوكول لديها ميزة كونها سميكة بما فيه الكفاية لحل هندسة الأنسجة (مثل الأوعية الدموية) ، بل هي رقيقة بما فيه الكفاية لتجنب محاصرة التحقيق ، والتي هي مشكلة المنهجية التي تعترض عادة خلال كل جبل ISH. ويتم تقييم كل riboprobe جديدة على النسيج مراقبة إيجابية ، حيث تم تلوين المقررة في دراسة سابقة نشرت. علينا أن نضمن أن يتم تلطيخ أنماط محددة في هذه الأنسجة. ميزة أخرى لأسلوبنا هو أنه يمكن تقييم أنماط متعددة في mRNAs أقسام النسيج المجاور طرفية من النسيج نفسه. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن يقترن هذا الأسلوب مع تقنيات المناعى لتصور علامات الخلية البروتين محددة وتحديد أنواع الخلايا الملون بواسطة بروتوكول ISH. هذا الأسلوب لا يتفق مع الأساليب التقليدية counterstaining ، مثل counterstaining النووية مع الأحمر السريع أو الهيماتوكسيلين. ومع ذلك ، لدينا عينات counterstained بنجاح مع البقع الفلورسنت النووية ، بما في ذلك 4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي) ويوديد propidium.
الأسلوب الموصوفة هنا يتضمن العديد من التحسينات أكثر من التي تم وصفها سابقا 7. تعد كلها تقريبا من مخازن والحلول الكاشف الأسهم الحالية في المخطوطة مقدما ويمكن تخزينها لفترات طويلة من الزمن ، مما يزيد من الكفاءة. إضافة إلى أزيد الصوديوم 0.2mM معظم الكواشف والترشيح من خلال أغشية 0.22μm يقلل إلى حد كبير غير محدد تلوين الخلفية ، ويزيد من تراكم كاشف الجرف الحياة ، ويقلل من الجسيمات على أقسام الأنسجة أثناء إجراء ISH. هذا المخطوط كما يصف صناعة السلال نفاذية الأنابيب التي تحتوي على أقسام microcentrifuge الأنسجة أثناء ISH وتعديل لوحة ثقافة متعددة كذلك الغطاء الذي يحمل سلال خلال التغييرات العازلة. وجدنا أن هذه الأجهزة ، التي يتم تصنيعها بسهولة في المختبر ، والحد من فقدان العينة ، والحد من تلف الأنسجة القسم خلال التجهيز ، وتحسين الكفاءة. وعلاوة على ذلك ، واستخدام وعاء من البلاستيك اغلاقها باحكام كغرفة الرطوبة يساعد على حماية ضد التبخر. هذا هو المهم وخاصة بالنسبة للقطاعات النسيج في الآبار عينة الطرفية ، حيث ما يسمى "تأثير الحافة' يمكن إدخال متغير التجريبي. أثناء استخدام غرف الرطوبة ، ونحن لم يلاحظ اختلاف ملموس في نوعية تلطيخ الآبار الهامشية مقابل عينة الداخلية.
في حين أن هذا البروتوكول هو آلية فعالة لدراسة أنماط التعبير مرنا في الأنسجة طرفية الماوس ، وهناك بعض القيود مع هذا الأسلوب. لا يمكن الكشف عن كفاءة مرنا يتراوح بين riboprobes والوفرة المطلقة mRNAs يتم تحديدها. آخر التقييد هو أن أنماط تلطيخ يمكن أن تختلف باختلاف الطائرة المقطع. للحد من هذه القيود ، نقيم كل نمط مرنا في مقاطع متعددة من أجنة القمامة مستقلة متعددة.
يمكن أن يكون هذا الأسلوب الأمثل لتصور أنماط التعبير مرنا في غيرها من أنواع الأنسجة الماوس أو الأنواع الأخرى. مثل هذا التعديل يتطلب أن يكون الأمثل السعة والسرعة شفرة مشراح خلال sectioning الأنسجة ويمكن أن أمثل تركيز بروتين كاف أثناء إجراء ISH. علاوة على ذلك ، فمن الضروري قبل امتصاص الأجسام المضادة لمكافحة digoxigenin مع مسحوق الجنين من نفس النوع من الأنسجة التي يجري تقييمها من قبل ISH. على الرغم من أن هذا الأسلوب ليس من المفيد للأقسام الأنسجة أرق من 40 ميكرون ، وذلك لأن المقاطع تتفكك خلال تلطيخ ISH ، ويمكن تكييفه لاستخدامها في تلوين عالية الإنتاجية ISH كله جبل. وقد استخدمنا هذا الأسلوب بنجاح لإجراء كله يشن ISH على البروستاتا الماوس الجنين وحديثي الولادة وكذلك الأجنة الغدد التناسلية والكلى. ISH للتلوين كامل جبل ، فمن الضروري لتحسين الهضم بروتين الأنسجة K فضلا عن كمية ومدة الحضانة بين عشية وضحاها يغسل التالية للحد من الأضداد تلوين الخلفية التي يسببها الاحتباس التحقيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لان يي ، معهد السرطان في نيو جيرسي ، للحصول على المساعدة الفنية في إعداد سلات الأنسجة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة DK083425 المنح وDK070219.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Group | 11214667001 | |
| Blocking reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Group | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 | |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Group | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Group | 11969064001 | |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model | |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp | 46551 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 | |
| Millicell culture plate insert | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 | |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 | |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase inhibitor | Roche Group | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza Inc. | 50101 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solution | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A | |
| Yeast tRNA | Roche Group | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
