Summary
כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה ויעילה
Abstract
פיתוח בדרכי השתן ואברי המין התחתון (LUT) הוא תהליך מורכב. מורכבות זו לידי ביטוי במהלך היווצרות של הערמונית של השופכה בעובר זכר, אשר מסתמכת על אותות androgenic ו אפיתל-mesenchymal 1,2 אינטראקציות. הבנת המנגנונים המולקולריים האחראים להתפתחות סרטן הערמונית עשוי לחשוף את מנגנוני צמיחה, כי הם לא הולם המתעורר בשלב מאוחר יותר בחיים לעורר מחלות הערמונית כגון היפרפלזיה שפירה של הערמונית וסרטן הערמונית.
LUT פיתוח מורכב מבחינה אנטומית. על ידי הערמונית זמן ניצני מתחיל על התפיסה ימים 16.5 פוסט (DPC), סוגי תאים רבים נוכחים. בכלי הדם, העצבים שריר חלק מתגוררים בתוך stroma mesenchymal 3. Stroma זה המקיף אפיתל רב שכבתי ואת מוליד הערמונית העובר דרך קולטן האנדרוגן תלויים אותות אוטוקריני 4. זהותם של קולטן האנדרוגן סטרומה תגובה הגנים הדרושים לפיתוח הערמונית את המנגנון שבאמצעותו הערמונית צורות ductal אפיתל בתגובה הגנים האלה לא מובנת לחלוטין. היכולת לזהות במדויק סוגי תאים בתרגום הביטוי של גורמים ספציפיים בתוך אותם הוא הכרחי כדי להבין את התפתחות נוספת הערמונית. הכלאה In situ (שאני עורך) מאפשר איתור של mRNAs בתוך הרקמה. לכן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לזהות דפוס והעיתוי של ביטוי של מולקולות איתות הקולטנים שלהם, ובכך הבהרת הרגולטורים הערמונית הפוטנציאל ההתפתחותי.
כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה שאני עורך טכניקה לזהות דפוסי ביטוי mRNA ב LUT העכבר העובר באמצעות רטט microtome לחתוך חלקים. שיטה זו מציעה מספר יתרונות על פני פרוטוקולים אחרים שאני עורך. ביצוע שאני עורך על סעיפים דק דבק שקופית קשה מבחינה טכנית, cryosections לעתים קרובות יש איכות מבנית העניים בעוד הן cryosections וחתכים פרפין לעיתים לגרום ברזולוציה אות חלש. ביצוע שאני עורך על כל רקמות הר יכול לגרום השמנה בדיקה. לעומת זאת, הטכניקה תפוקה גבוהה שלנו מנצל עבה לחתוך קטעים החושפים ארכיטקטורת רקמה מפורט. צינורות microfuge השתנה לאפשר טיפול קל סעיפים במהלך ההליך איש. מקסימום של 4 תעתיקי mRNA יכול להיות מוקרן מן LUT 17.5dpc יחיד עם עד 24 תעתיקי mRNA זוהה בטווח יחיד, ובכך להפחית את עלות ויעילות למקסם. שיטה זו מאפשרת לקבוצות טיפול מרובים כדי להיות מעובד ובשפה כיחידה אחת, ובכך להסיר כל הטיה של הנתונים לפרש. רוב לענייננו לחוקרים הערמונית, שיטה זו מספקת מיקום במרחב ובזמן של תעתיקי mRNA נמוך וגבוה בשפע השופכה עוברי עכבר אשר מעורר ברשת הערמונית ductal.
Protocol
1. סינתזה של Riboprobe Digoxigenin-11-UTP שכותרתו מתבנית PCR שנוצר
- כדי לסנתז riboprobe גן ספציפי, השתמש Entrez ג'ין (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) כדי לקבל את התייחסות cDNA רצף הגן (RefSeq). השתמש בתוכנית Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 לעיצוב הגן הספציפי primers PCR נגד אזור 3', את רצף cDNA. פרמטרים מומלץ מבחר פריימר PCR מתוארים במקום אחר (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
- השתמש בתוכנית MegaBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6 להעריך הספציפיות של רצף ה-DNA שנבחר. רצף הדנ"א נחשבת ספציפיים, כאשר באמצעות הסף מצפים 0.01, זה לא להתיישר עם רצפים אחרים במסד הנתונים RefSeq.
- PCR להגביר את התבנית riboprobe. רכיבי ה-PCR התגובה ותנאי thermocycling צריך להיות מותאם עבור כל קבוצה פריימר. תגובה אופיינית 50 μl מכיל: מאגר 1X, 2mm MgCl 2, 0.2mM dNTPs, הפתרון ש 1X, 1μg cDNA, 2.5U תקי פולימראז ה-DNA, primers 0.25μm ו nuclease ללא H 2 O. פרוטוקול thermocycling טיפוסית כוללת denaturation הראשונית ב 94 מעלות 2min ואחריו 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 30sec, 57 מעלות צלזיוס במשך 30sec, 72 מעלות ו 1min הרחבה סופית ב 72 ° C עבור 10min. CDNA השתמשו בתגובות PCR הוא מסונתז מ mRNA עכבר ואברי המין.
- הפרד את מוצר ה-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose, לטהר באמצעות ערכת חילוץ ג'ל, ולכמת את המוצרים מטוהרים על ידי לספקטרופוטומטריה. התשואה הצפויה היא 1.2 - 3.6μg.
- לתמלל את מוצר ה-PCR לתוך riboprobe שכותרתו. התגובה שעתוק (40 μl) מכילה: 400ng מטוהרים PCR המוצר, 1X לערבב תיוג נוקלאוטיד המכיל digoxigenin 11-UTP, 1X חיץ שעתוק, 5U RNase המעכב, 80U פולימראז T7-RNA, ו nuclease ללא H 2 O. דגירה 3-4hr ב 37 ° C ו להתסיס דגימות כל 30 דקות.
- השתמש ערכת RNEASY Qiagen מיני לטהר riboprobes בהתבסס על הוראות הניקוי RNA עם העיכול DNase על עמודות. לכמת riboprobes ידי לספקטרופוטומטריה. התשואה הצפויה 40-20 מיקרוגרם. העריכו את איכות הבדיקה על ידי הפרדת aliquot ידי אלקטרופורזה על ג'ל 1.5% agarose הלא denaturing. בדיקות איכות גבוהה נודדים כמו להקות שונות עם מריחה מינימלית.
- כדי להבטיח riboprobe דווקא מכיר היעד שלה, כולל רקמות בקרה חיובית עבור הניסוי החזון איש הראשונה. MRNA היעד של riboprobe דפוס צריך להיות ידוע ברקמות שליטה זו חיובית.
2. הכנת Blade Microtome רטט (בהתבסס על פרוטוקול שתואר לעיל) 7
- הכינו 4% נמוך להמיס פתרון agarose ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). מיקרוגל פתרון לפזר agarose ולשמור על פתרון על 62 ° C.
- להכין תבנית טבעת קלקר על ידי הסרת קרום מ צלחת בקוטר 12 מ"מ Millicell תרבות היטב להוסיף ולשמר טבעת פוליסטירן להשתמש בו עובש agarose. משרים את טבעות לילה פתרון מעכב RNase לפני כל שימוש.
- כדי להבטיח משטח חיתוך חלק, להסיר מעכב חלודה תוספים אחרים מפני השטח של הלהב וילקינסון על ידי שטיפה עם ממסים הבאים, בריכוז של 100%: אתר נפט, קסילן, כלורופורם, מתנול, מים MilliQ. הפרד את הלהב הכפול לאורכו לשני להבים אחת.
- ציית להבי וילקינסון כדי להב microtome עם דבק Loctite. הלהב microtome אינו משמש לחיתוך, הוא מוסיף קשיחות הלהב וילקינסון. להב microtome יש לחתוך לאורך הלהב וילקינסון באמצעות המזמרה מתכת, דבק פעם אחת, צריך להיות מקוזז על ידי 3 - 4 מ"מ מ חוד החנית של להב וילקינסון.
3. , אחסון Dissection, והכנה של רקמות ואברי המין עבור חתך
- הכן פתרון PBSTw (PBS המכיל 0.1% Tween ™ 20 ו 0.2mM אזיד הנתרן, הסתנן מבעד Stericup 0.22μm ® יחידת מסנן). הפתרון יכול להיות מוכן מראש ומאוחסנים במהירות של 25 ° C.
- דגירה LUT עכבר גזור טרי (שלפוחית השתן, השופכה האגן, הקשורים Wolffian ו Mϋllerian צינור הנגזרות מבנים) לילה ב 4 מעלות צלזיוס PBS המכיל מקבע paraformaldehyde 4%.
- מייבשים על ידי רקמות כביסה עבור 10min במהירות של 25 ° C בסדרה של מתנול ציון / PBSTw (01:03, 01:01, 03:01 v / v) פתרונות. חנות דגימות ב -20 מעלות צלזיוס מתנול 100% לפחות לילה. רקמות בארכיון עשוי להישמר לפחות 2yr.
- הכינו רקמות על ידי חתך rehydrating רקמות בארכיון. שטפי עבור 10min במהירות של 25 ° C בסדרה של מתנול מדורגים / PBSTw (03:01, 01:01, 01:03 v / v) פתרונות.
- לנתח ולסלק כשני שלישים של שלפוחית השתן, עוזב את רוב האזור trigone המצורפת השופכה.
- מניחים את הטבעת פוליסטירן עובש, משטח שטוח למטה, על 25 מעלות צלזיוס שקופיות זכוכית מיקרוסקופ רגיל.
- ממלאים את התבנית עם טבעת 62 פתרון ° C ו-agarose מגניב על 2min.
- הסרה של רקמה LUT מ PBSTw ואת כתם יבש סופג לנגב.
- העברת רקמה לתוך פתרון agarose.
- שימוש במלקחיים כדי לכוון את הרקמה LUT ב agarose כך שהוא מושעה באמצע הדרך בין החלק העליון והתחתון של עובש את הטבעת דגירה הרקמה על 4 מעלות צלזיוס עד agarose יש הקרושה.
- אם הרקמה כיורים לחלוטין במהלך תהליך של מיצוק agarose, זה יכול להיות נכרת מן agarose מחדש מוטבע. התאם את זמן הקירור של agarose הצורך בתהליך מחדש את הטבעת.
5. חתך רקמות ואברי המין עם Microtome רטט (בהתבסס על פרוטוקול שתואר לעיל) 7
- הר להב חיזק וילקינסון ב microtome הרוטט ולקבוע את זווית הלהב ° 35. מלאו אמבטיה הדגימה דלוקס עם קרח PBS ו לארוז רטוב סביב האמבטיה הדגימה.
- הסר את תקע הקרושה agarose מהתבנית את הטבעת למחוק את המשטח התחתון עם סופג לנגב. ודא כי הרקמה מכוונת כראוי. אוריינטציה רקמות יכול להיות מותאם באמצעות סכין גילוח כדי שפוע הקצה השטוח של התקע agarose.
- ציית את התקע agarose על דגימה microtome רוטט הרכבה דיסק עם דבק Loctite כפי שמוצג באיור. 1A.
- הכנס את דיסק הדגימה הרכבה לתוך vibratome.
- התאם את עובי סעיף microtome כדי 50μm, את המהירות ל 2, ואת משרעת להב 4 ולהתחיל לחתוך קטעים רקמות.
- שימוש במלקחיים בוטה להעביר כל קטע רקמה (איור 1B) לצלחת 24 גם תרבות היטב המכיל קר כקרח PBSTw 0.5mL.
- כדי להכין דוגמאות של הבלו באתרו הכלאה, רוב agarose סביב כל קטע רקמה (agarose הנותרים ימסו במהלך ההליך החזון איש) ולהסיר את כל שברים. חנות חלקים עד 48hr על 4 מעלות צלזיוס PBSTw.
6. סל לדוגמא כהכנה ב הכלאה באתרו
- חותכים את החלק התחתון של צינור microcentrifuge ב סימן 100μL.
- מחממים את קצה של הצינור לחתוך בלהבה עד הפלסטיק היא מרוככת, ולאחר מכן לחץ על צינור microcentrifuge בחוזקה על במרכזה של כיכר פוליאסטר 0.5in רשת.
- חתוך רשת עודף להשתמש במחט מחוממת 18 מד לנקב שני חורים לתוך המכסה כל הצינור כדי להשלים הכנה סל (איור 1C).
- הסר את מכסה צלחת 24 באר לקדוח חור 12mm מרוכז היטב מעל לכל. השתמש במכסה להעביר סלי מדגם בין שוטף של פרוטוקול החזון איש (1D איור).
7. אבקת העובר כהכנה ב הכלאה באתרם (בהתבסס על פרוטוקול שתואר קודם לכן) 8
- איסוף העובר רקמות העכבר מעכברים כי הם את הבמה כמו בסעיפים רקמות כי הם המוערך ולאחסן ב -80 ° C. מקום הרקמה הקפואה אל תוך רקמת לצלול קרמיקה, מרגמה בחנקן נוזלי, ולהשתמש העלי לטחון רקמות לאבקה דקה.
- מערבבים אבקת העובר עם 4 כרכים של אצטון homogenize במשיכות כמה homogenizer dounce.
- העברת homogenate לכוס 15 מ"ל פקק הברגה בקבוקון ולחלץ לילה בשעה 4 ° C.
- אבקת גלולה העובר על ידי צנטריפוגה ב 5000rpm עבור 10min ב 4 ° C. הסר להתעלמות supernatant השומנים המכילים. Resuspend רקמת גלולה ב 4vol של אצטון טרי לחלץ עבור 2hr ב 4 ° C.
- גלולה את אבקת העובר על ידי צנטריפוגה ב 5000rpm עבור 10min ב 4 ° C. הסר להתעלמות supernatant.
- האוויר היבש גלולה על נייר Whatman # 2 הסינון. קראש גלולה להניב אבקת חנות בסדר בבקבוקון זכוכית סגורה היטב ב 4 ° C. התשואה המשוער הוא 50 מ"ג לכל אבקה במשקל 1 גרם העובר רטוב.
8. ביום הכלאה באתרו 1
- פתרון מחממים prehybridization (לפוראמיד 50%, SSC 5x, 1% חסימת מגיב, 10μg/mL שמרים tRNA, חנות 10μg/mL הפרין ב -20 ° C) על 60.5 ° C. פתרון זה אפשר להכין מראש ולאחסן ב -20 ° C.
- הכינו תא הכלאה humidified באמצעות מילוי מיכל קטן אחסון מפלסטיק עם כ 0.5 ב של מי ברז. כיסוי מיכל מחממים על 60.5 ° C.
- הוסף 2ml PBSTw אל הבארות של צלחת 24 גם תרבות. מדגם מקמי סלים החורים של המכסה 24 היטב את הצלחת רקמות סעיפים להעביר לתוך סלי (עד 10 סעיפים לכל סל היה בשימוש).
- דגירה סעיפים רקמה 30 דקות במהירות של 25 ° C ב 6% H 2 O 2. זה כל incubations הבאים צריכים להתבצע עם תסיסה עדינה על שייקר מסלולית, אלא אם צוין אחרת. כל incubationsרוחץ ד נערכים 24 גם צלחות להשתמש נפח פתרון כולל של 2mL/well.
- לשטוף חלקים רקמות 4 x 5min של 25 מעלות צלזיוס PBSTw.
- דגירה סעיפים רקמה 12min של 25 מעלות צלזיוס PBSTw המכיל 5μg/mL proteinase ק
- לשטוף חלקים רקמות 1 x 5min של 25 מעלות צלזיוס PBSTw.
- פוסט לתקן רקמות חלקים עבור 20min של 25 מעלות צלזיוס PBS paraformaldehyde המכיל 4% ו glutaraldehyde 0.2%.
- לשטוף חלקים רקמת 2 x 5min של 25 מעלות צלזיוס PBSTw.
- הוסף 2mL/well של למאגר prehybridization prewarmed ו דגירה סעיפים רקמות בתוך חדר הכלאה humidified לפחות 1 שעות על 60.5 ° C.
- הוסף riboprobe שכותרתו 0.65μg למאגר prehybridization בכל הסעיפים רקמות היטב דגירה לילה בחדר הכלאה humidified על 60.5 ° C.
9. ביום הכלאה באתרו 2
- הכן את הפתרונות הבאים עבור שלאחר הכלאה צעדים כביסה: פתרון 1 (לפוראמיד 50%, SSC 5x, SDS 1%), פתרון 2 (10mm-HCL טריס pH 7.5, NaCl 0.5m, 0.1% Tween ™ 20, 0.2mM אזיד הנתרן , 0.22μm מסונן), וכן פתרון 3 (2x SSC, 50% לפוראמיד). פתרונות אלו יכולים להיות מוכנים מראש. פתרונות 1 ו -3 מאוחסנים ב -20 ° C ו פתרון 2 מאוחסן במהירות של 25 ° C. החיים של פתרונות אחסון הוא לפחות 3 חודשים.
- לשטוף חלקים רקמת 3 X 30 דקות ב 60.5 ° C עם פתרון מראש חימם 1. השתמש קאמרית humidified במהלך שוטף.
- לשטוף חלקים רקמות 1 X 10min ב 60.5 ° C עם 1/Solution מראש חימם פתרון 2 (01:01 v / v) פתרון. השתמש קאמרית humidified במהלך הכביסה.
- לשטוף חלקים רקמות 4 X 10min במהירות של 25 ° C עם פתרון 2.
- דגירה רקמות חלקים עבור 15min על 37 מעלות צלזיוס פתרון 2 המכיל 0.25μg/mL RNase.
- לשטוף חלקים רקמות 1 X 10min במהירות של 25 ° C עם פתרון 2 (ללא RNase).
- לשטוף חלקים רקמות 1 X 10min במהירות של 25 ° C עם פתרון 3, ואחריו X1hr 2 שוטף על 60.5 ° C עם פתרון 3. השתמש קאמרית humidified במהלך שוטף 60.5 מעלות צלזיוס.
- הכן את הפתרונות הבאים לגילוי immunohistochemical של DIG שכותרתו riboprobes: מאגר רקמות חסימת (TB, 1X TBS, כבשים בסרום של 10%, מגיב חסימת 1%, BSA 1%, 0.1% Tween ™ 20, 0.22μm מסונן), דילול נוגדן הצפת (AD, 1xTBS, כבשים 5% נסיוב, מגיב חסימת 1%, BSA 1%, 0.1% Tween ™ 20, 0.2mM אזיד הנתרן, 0.22 מ '™ מסונן) לקליטת הצפת נוגדן (AA, 1xTBS, כבשים בסרום 5%, 1 מגיב% חסימה, 1% ארגון ה-BSA, אבקת העובר 6mg/mL), ו TBSTw (1xTBS, 0.1% Tween ™ 20, 0.2mM אזיד הנתרן, 0.22μm מסונן). פתרונות אלו יכולים להיות מוכנים מראש. TBSTw מאוחסן על 25 מעלות צלזיוס, כל פתרונות אחרים המאוחסנים ב -20 ° C.
- לשטוף 3 X 10 דק 'במהירות של 25 ° C עם TBSTw.
- דגירה בסעיפים רקמות לפחות 2hr במהירות של 25 ° C במאגר שחפת.
- בעוד הרקמות הם דוגרים במאגר שחפת, להוסיף נוגדן 1.1μL אנטי DIG לכל חיץ AA 200μL עבור כל טוב. חיץ דגירה AA + נוגדן לפחות 2hr ב 4 ° C, אז צנטריפוגות בסל"ד 10,000 עבור 1min. הסר את supernatant חיץ AA ולהוסיף אותו 2ml של חיץ לספירה.
- הסר קטעי רקמה חוצץ שחפת דגירה אותם בן לילה בתא humidified ב 4 ° C במאגר לספירה המכיל נוגדנים.
10. ביום הכלאה באתרו 3
- הכן התפתחות צבע פתרון NTMT (100mm-HCL טריס pH 9.5, NaCl 100mm, 50mm MgCl 2, 0.2mM אזיד הנתרן, 0.22μm מסונן). פתרון זה אפשר להכין מראש ולאחסן במהירות של 25 ° C. מיד לפני השימוש, מוסיפים levamisole 2 מ"מ ו 0.1% Tween ™ 20.
- הסר את הפתרון נוגדן (AD חיץ נוגדן +) מבארות פתרון חנות ב 4 ° C. זה ניתן לעשות שימוש חוזר עד שתי פעמים נוספות.
- שוטפים את הרקמות 8 X 10 דק 'במהירות של 25 ° C עם TBSTw המכיל levamisole 2mm.
- בזהירות העברת רקמות מן הסלים כדי בצלחת פטרי המכילות TBSTw. שימוש במלקחיים כדי להסיר שאריות גלוי. העברת הרקמות לתוך צינורות microcentrifuge נקי.
- לשטוף רקמות 1 X 10 דק 'במהירות של 25 ° C עם NTMT 1mL.
- הסר את NTMT ולהוסיף 1mL/tube של תערובת המכילה 50% NTMT (המכיל levamisole 2 מ"מ) ו -50% BM סגול, צינורות מקום בתיבה דגירה מוגן אור במהירות של 25 ° C. התפתחות זמן צבע נע בין מספר שעות עד מספר ימים. אם הצבע הוא איטי לפתח, 100% בע"מ סגול יכול לשמש.
- פיתוח צג צבע לשנות NTMT / פתרון סגול BM אם זה מצטבר גבישים זירז או אם הוא עובר שינוי צבע מצהוב לסגול. לאחר פיתוח מלא צבע (4-250 שעות), רקמות לשטוף 2 X 5min במהירות של 25 ° C עם 1mL/tube של NTMT המכיל levamisole 2mm.
- דגירה רקמות לילה ב 4 מעלות צלזיוס 1mL/tube של PBS paraformaldehyde המכיל 4% לאחר מקבע.
- כדי להלבין את רקמות, רקמות דגירה של 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס 1mL/tube של PBSTw המכיל 3% H 2 O 2
- סעיפים רקמות הם רכובים על שקופיות הזכוכית, coverslipped, הדמיה בעזרת מיקרוסקופ המתחם.
11. נציג תוצאות:
האוריינטציה המרחבית של רקמות LUT ב agarose קובע את המטוס סעיפים רקמות. עבור חלקים sagittal, לפחות שני שלישים של שלפוחית השתן הוא נכרת ואת רקמת LUT הנותרים מוטבע אגר כזה קו האמצע השופכה מקביל משטח שטוח של התקע agarose (איור 1A). שינויים קלים במישור רקמות יכול להתבצע על ידי beveling הקצה השטוח של התקע agarose. קטע sagittal נציג מרקמות LUT 17.5dpc זכר כי מכוונת במישור זה מוצג באיור 1 ב.
סלי לדוגמא להגן על חלקים רקמה עדינה של אובדן מצבירת חומר חלקיקי אבק במהלך ההליך רב היום איש. סלי לדוגמה מוכנים ידי התכה רשת פוליאסטר לסוף לחתוך צינור microfuge 1.5mL (תרשים 1C). חור קטן פירסינג לתוך המכסה של סל כל מדגם כדי להקל על תזרים פתרון פנימה והחוצה הסלים. סלי לדוגמה מושעים בפתרונות שאני עורך ידי הצבתם בתוך חורים שנקדחו לתוך 12mm 24-היטב מכסים בצלחת (1D איור). מכסים בצלחת שונה תמיכה הסלים כאשר הם מועברים בין 24 גם הצלחות במהלך שינויים פתרון.
זה מאתגר להגביל הלא ספציפית מכתים רקע בתקופות הדגירה הארוכה דרושים כדי לאתר את mRNAs שפע נמוך. תוספת של אזיד הנתרן 0.2mM כדי מאגרים מדגם סינון הבאים שלהם דרך מסננים 0.22μm הופיע להגביל מכתים רקע (איור 2). באמצעות השיטה המתוארת כאן, לא נראה שיש הבדלים גלוי מכתים רקע כאשר דגימות מודגרת בפתרון הפיתוח צבע עבור תקופות זמן ממושכות (איור 3).
באיור 1. הכנת עכבר נמוך רקמות ואברי המין (LUT) סעיף בדרכי צינור microcentrifuge סל עבור איש. LUT המכיל חלק השופכה לשלפוחית השתן, האגן הקשורים Wolffian ומבנה Mϋllerian צינור הנגזרות) מוטבע תקע גלילי של 4% נמוך להמיס agarose. (א) תקע מודבק לדיסק הדגימה הרכבה (ב) לחתוך למקטעים 50μm עם microtome רוטט. (ג) בסעיף LUT מועבר לתוך סל microcentrifuge צינור כי הוא הוכן על ידי פירסינג חור המכסה את הצינור פוליאסטר רשת פיוזינג לסיים את החיתוך התחתון של הצינור. (ד) צינור microcentrifuge מוכנס לתוך חורים שנקדחו 12mm לתוך המכסה 24 גם צלחת כך בסעיפים רקמות מושעים בפתרון חיץ במהלך הפרוטוקול איש. ראשי חץ מציינים את רקמת LUT בתקע agarose.
איור 2. התאגדות של אזיד הנתרן 0.2mM לתוך 0.22μm פתרונות סינון משפר את איכות הרקמה ומפחית מכתים רקע. 17.5dpc קטעי עכבר ואברי המין הגברי נמוך (luts) נותחו במטוס sagittal בעובי של 50μm. סעיפים רקמות הוכתמו על ידי שאני עורך באמצעות בדיקה מכוונת נגד homolog טוויסט 1. Buffers המשמש שאני עורך היו או (A) 0.22μm מסוננים שיושלם עם אזיד הנתרן 0.2mM (NaAz) או (ב) בתוספת מסוננת ולא עם NaAz. ראשי חץ עולה מכתים רקע. תמונות שנתפסו בהגדלה זהה. תוצאות דפוסים מכתים נציג עבור n = 3 גורים עצמאית עכברים.
איור 3. מכתים רקע העוצמה אינו מופיע להגדיל עם התפתחות צבע ממושכת. 17.5dpc קטעי עכבר ואברי המין הגברי נמוך (luts) נותחו במטוס sagittal בעובי של 50μm. מדורים הוכתמו על ידי שאני עורך ידי דוגרים להם פתרון מכתים כרומגן עבור (A) 9.5h באמצעות בדיקה המזהה את התמליל שפע גבוהה הקשורים לאסטרוגן גמא קולטן (Esrrg), (ב) עבור 43.5h באמצעות בדיקה המכירה שפע בינוני bromodomain תמליל הסמוכים תחום אצבע אבץ, 2A (Baz2a) או (ג) עבור 236h באמצעות בדיקה המכירה שפע נמוך תמליל כנפיים מסוג שילוב MMTV באתר משפחה, חבר 10a (Wnt10a). תמונות שנתפסו בהגדלה זהה. תוצאות דפוסים מכתים נציג עבור n = 3 גורים עצמאית עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות השיטה המתוארת כאן, אפשר לזהות mRNAs בכל סוגי התאים העיקריים תאים ורקמות של LUTs עוברי עכבר זכר ונקבה כולל רפידות mesenchymal, urothelium, שרירים חלקים, בלוטות הערמונית, צינור השופכה, והנרתיק. הסעיפים 50μm להשתמש בפרוטוקול זה יש את היתרון של להיות עבה מספיק כדי לפתור ארכיטקטורה רקמות (כמו כלי הדם), אך הם דקים מספיק כדי למנוע השמנה בדיקה, המהווה בעיה מתודולוגית בדרך נתקל בזמן שאני עורך כל הר. Riboprobe כל חדש נבחנת על רקמת שליטה חיובית, שם מכתים כבר העריכו במחקר שפורסם קודם לכן. אנו מבטיחים כי דפוסי מכתים הן ספציפיות ברקמות אלה. יתרון נוסף של השיטה שלנו היא כי דפוסי mRNAs מרובות ניתן להעריך בסעיפים הרקמות הסמוכות מרקמת LUT אותו. יתר על כן, בשיטה זו ניתן בשילוב עם טכניקות immunohistochemical לדמיין תא סמנים ספציפיים לחלבון לזהות סוגי תאים מוכתם ידי פרוטוקול איש. שיטה זו אינה עולה בקנה אחד עם שיטות counterstaining מסורתיים, כגון counterstaining גרעיני עם אדום מהיר או hematoxylin. עם זאת, יש לנו דוגמאות counterstained בהצלחה עם כתמים גרעיני פלורסנט, כולל 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ו יודיד propidium.
השיטה המתוארת כאן כוללת מספר שיפורים על פני זו תוארה קודם לכן 7. כמעט כל חוצצי ומלאי פתרונות מגיב בכתב היד הנוכחי מוכנים מראש והוא יכול להיות מאוחסן במשך פרקי זמן ארוכים, דבר אשר מגביר את היעילות. תוספת של אזיד הנתרן 0.2mM לרוב ריאגנטים שלהם סינון דרך ממברנות 0.22μm מאוד פוחתת הלא ספציפית מכתים רקע, מגבירה הצטברות מגיב חיי המדף, וממזער של חומר חלקיקי על הסעיפים רקמות במהלך ההליך איש. כתב יד זה גם מתאר את ייצור הצינור חדיר סלי microcentrifuge המכילים קטעי הרקמה בעת שאני עורך וגם שונה רב גם צלחת תרבות המכסה שמכיל את הסלים במהלך שינויים חיץ. מצאנו כי התקנים אלה, אשר מיוצרים בקלות במעבדה, להפחית את אובדן מדגם, למזער סעיף נזק לרקמות במהלך עיבוד, ולשפר את היעילות. יתר על כן, השימוש במיכל פלסטיק סגר כמו חדר לחות מסייעת להגן מפני התאיידות. זה חשוב במיוחד עבור קטעי הרקמה בארות מדגם הפריפריה, שם שנקרא "אפקט הקצה" יכולים להציג את משתנה הניסוי. בעת השימוש בתאי לחות, אנחנו לא הבחינו ניכר באיכות מכתים הבדלים בארות מדגם הפריפריה לעומת הפנימי.
בעוד פרוטוקול זה הוא מנגנון יעיל ללמוד דפוסי ביטוי mRNA ברקמות עכבר LUT, ישנן כמה מגבלות בשיטה זו. יעילות של גילוי mRNA משתנה בין riboprobes ושפע המוחלט של mRNAs לא ניתן לקבוע. הגבלה נוספת היא כי דפוסי מכתים יכול להשתנות בהתאם המטוס סעיף. כדי למזער את המגבלות האלה, אנו בוחנים כל תבנית ה-mRNA בסעיפים מרובים פסולת עצמאית עוברים מרובים.
שיטה זו יכולה להיות מותאם ביטוי חזותי דפוסי mRNA אחרים רקמות סוגי עכבר או מינים אחרים. שינוי כזה מחייב את המשרעת להב מהירות microtome ולהיות מותאם במהלך חתך רקמות כי ריכוז K proteinase להיות מותאם במהלך ההליך איש. יתר על כן, יש צורך לאשר מראש לקלוט את הנוגדן אנטי digoxigenin עם אבקת העובר מן מאותו המין של הרקמה המוערך על ידי איש. אמנם שיטה זו אינה יעילה עבור חלקים רקמת יותר רזה 40 מיקרון, כי הסעיפים להתפורר במהלך מכתים איש, זה יכול להיות מותאם לשימוש מכתים כל הר תפוקה גבוהה איש. השתמשנו בשיטה זו בהצלחה לנהל את כל הר שאני עורך על הערמונית עכבר העובר בילוד וכן שחלה כליות העובר. עבור מכתים שאני עורך כל הר, יש צורך לייעל את העיכול proteinase K רקמות, כמו גם את כמות ומשך שוטף הבאים הדגירה נוגדן לילה להפחית מכתים רקע השמנה הנגרמת על ידי בדיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר לאן יי, מכון הסרטן של ניו ג'רזי, לקבלת סיוע טכני בהכנת סלי רקמות. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים DK083425 ו DK070219.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Group | 11214667001 | |
| Blocking reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Group | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 | |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Group | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Group | 11969064001 | |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model | |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp | 46551 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 | |
| Millicell culture plate insert | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 | |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 | |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase inhibitor | Roche Group | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza Inc. | 50101 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solution | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A | |
| Yeast tRNA | Roche Group | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
