Summary
Aquí se describe un rendimiento de alta eficiencia
Abstract
Desarrollo del tracto urogenital inferior (LUT) es un proceso complejo. Esta complejidad se pone de manifiesto durante la formación de la próstata desde la uretra masculina fetal, que se basa en las señales de andrógenos y epitelio-mesenquimal 1,2 interacciones. Comprender los mecanismos moleculares responsables del desarrollo de la próstata pueden revelar los mecanismos de crecimiento que están inadecuadamente despertado tarde en la vida para dar lugar a enfermedades de la próstata como la hiperplasia prostática benigna y cáncer de próstata.
La LUT en desarrollo es anatómicamente compleja. Por el momento incipiente de próstata comienza en 16,5 días después de la concepción (DPC), numerosos tipos de células están presentes. Vasos, nervios y el músculo liso de residencia en el estroma mesenquimal 3. Este estroma rodea un epitelio de varias capas y da lugar a la próstata del feto a través del receptor de andrógenos dependientes de las señales paracrinas 4. La identidad de la estroma del receptor de andrógenos que responden a los genes necesarios para el desarrollo de la próstata y el mecanismo por el cual la próstata formas epitelio ductal en respuesta a estos genes no se entiende completamente. La capacidad de identificar con precisión los tipos de células y localizar la expresión de factores específicos dentro de ellos es imprescindible para comprender mejor el desarrollo de la próstata. La hibridación in situ (ISH), permite la localización de los ARNm dentro de un tejido. Por lo tanto, este método puede ser utilizado para identificar patrón y el momento de la expresión de moléculas de señalización y sus receptores, con lo que los reguladores de dilucidar el potencial de desarrollo de próstata.
Aquí se describe una técnica de alto rendimiento ISH para identificar los patrones de expresión de ARNm en el LUT ratón fetal con vibración micrótomo secciones de corte. Este método ofrece varias ventajas sobre otros protocolos de ISH. Realización de ISH en secciones delgadas adherido a una diapositiva es técnicamente difícil, con frecuencia tienen cryosections calidad estructural de los pobres, mientras tanto cryosections y secciones de parafina a menudo resultan en la resolución de la señal es débil. Realización de ISH sobre todo tejidos de montaje puede resultar en la captura de la sonda. Por el contrario, nuestra técnica de alto rendimiento utiliza corte grueso secciones que muestran la arquitectura del tejido detallada. Modificado tubos de microcentrífuga permiten un fácil manejo de las secciones durante el procedimiento de ISH. Un máximo de 4 transcripciones de ARNm pueden ser examinados a partir de una sola LUT 17.5dpc con un máximo de 24 transcripciones de ARNm detectados en un solo plazo, reduciendo así costes y maximizar la eficiencia. Este método permite que varios grupos de tratamiento para ser procesado de forma idéntica y como una sola unidad, eliminando así cualquier sesgo de interpretación de los datos. Más pertinente para los investigadores de la próstata, este método proporciona una ubicación espacial y temporal de las transcripciones de ARNm de alta y baja abundancia en la uretra del ratón fetal que da lugar a la red de próstata ductal.
Protocol
1. Síntesis de un riboprobe digoxigenina-11-UTP-etiqueta de una plantilla de PCR generados por
- Para sintetizar un riboprobe de genes específicos, el uso de Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) para obtener la secuencia del gen de referencia cDNA (RefSeq). Utilice el programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 para el diseño de genes específicos de PCR en contra de la región 3 'de la secuencia de cDNA. Parámetros recomendados para la selección de cebadores de PCR se describen en otra parte (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
- Utilice el programa de Megablast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6 para evaluar la especificidad de la secuencia de ADN seleccionada. La secuencia de ADN se considera específica cuando, con un umbral de espera de 0,01, que no se alinea con otras secuencias en la base de datos RefSeq.
- Amplificar por PCR la plantilla riboprobe. Componentes de la reacción de PCR y las condiciones de ciclos térmicos deben ser optimizados para cada conjunto de cebadores. Una típica reacción de 50 l contiene: buffer 1X, 2 mM MgCl 2, dNTPs 0,2 mm, solución 1X Q, 1 g de la polimerasa cDNA, 2.5U Taq ADN, primers 0.25μm, y libre de nucleasa H 2 O. Un protocolo de termociclado típico incluye una desnaturalización inicial a 94 ° C durante 2 minutos seguido por 40 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 57 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 1 min y una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. El cDNA utilizado en la reacción de PCR se sintetiza a partir del ARNm del ratón urogenital.
- Separar el producto de PCR por electroforesis en gel de agarosa y purificar con el kit de extracción de gel, y cuantificar los productos purificados por espectrofotometría. El rendimiento esperado es de 1,2 - 3.6μg.
- Transcribe el producto de PCR en un riboprobe etiquetados. La reacción de transcripción (40 ml) contiene: 400ng producto de PCR purificado, 1X mezcla de etiquetado de nucleótidos que contienen digoxigenina-UTP 11, 1X tampón de transcripción, de 5U inhibidor de RNasa, 80U ARN polimerasa T7, y libre de nucleasa H 2 O. Incubar 3-4h a 37 ° C y agitar las muestras cada 30 minutos.
- Utilice el Qiagen RNeasy Mini Kit para purificar riboprobes basándose en las instrucciones para la limpieza de ARN en la columna de la digestión con DNasa. Riboprobes cuantificar por espectrofotometría. El rendimiento esperado es de 4-20 mg. Evaluar la calidad de la sonda por la separación de una parte alícuota por electroforesis en un 1,5% no desnaturalizante en gel de agarosa. Sondas de alta calidad de migrar como distintas bandas con manchas mínimo.
- Para garantizar la riboprobe reconoce específicamente su objetivo, son un tejido de control positivo para el experimento de ISH en primer lugar. El patrón de la riboprobe de ARNm objetivo debe ser conocido en este tejido de control positivo.
2. Preparación de la vibración de la hoja microtomo (basado en el protocolo descrito anteriormente) 7
- Preparar un 4% de baja fusión solución de agarosa en tampón fosfato salino (PBS). Microondas solución para disolver agarosa y mantener la solución a 62 ° C.
- Preparar un molde de anillo de poliestireno mediante la eliminación de la membrana de una placa de cultivo de 12 mm de diámetro Millicell así insertar y mantener el anillo de poliestireno para uso como un molde de agarosa. Remoje los anillos durante la noche en una solución de inhibidor de RNasa antes de cada uso.
- Para asegurar una superficie de corte suave, retire inhibidor de la corrosión y otros aditivos de la superficie de la hoja de Wilkinson aclarando con los siguientes disolventes, a una concentración de 100%: éter de petróleo, xileno, cloroformo, metanol y agua MilliQ. Separar la hoja de doble a lo largo en dos hojas individuales.
- Se adhieren a las hojas de una hoja de Wilkinson microtomo con adhesivo Loctite. La hoja microtomo no se utiliza para el corte, sino que añade rigidez a la hoja de Wilkinson. La hoja microtomo se debe cortar a la longitud de la hoja de Wilkinson con tijeras de metal y, una vez adherido, se compensará con 3 - 4 mm del borde de corte de la cuchilla Wilkinson.
3. Disección, almacenamiento y preparación de tejidos urogenitales de seccionamiento
- Preparar la solución PBSTw (PBS que contenía 0,1% de Tween 20 y 0,2 mm ™ azida de sodio, se filtra a través de la 0.22μm Stericup ® unidad de filtro). Solución puede prepararse de antemano y se almacena a 25 ° C.
- Incubar una LUT ratón recién disecados (vejiga, uretra pélvica, y Wolff y las estructuras asociadas Mϋllerian conducto de origen) durante la noche a 4 ° C en PBS que contenía 4% de paraformaldehído fijador.
- Deshidratar los tejidos mediante el lavado de 10 minutos a 25 ° C en una serie de metanol clasificado / PBSTw (1:3, 1:1, 3:1 v / v). Almacene las muestras a -20 ° C en el 100% de metanol por lo menos durante la noche. Tejidos archivados pueden ser mantenidos por lo menos por 2 años.
- Preparar los tejidos para el corte de rehidratación tejidos archivados. Lávese las manos por 10 minutos a 25 ° C en una serie de metanol clasificado / PBSTw (3:1, 1:1, 1:3 v / v).
- Diseccionar y desechar aproximadamente dos tercios de la vejiga, dejando la mayor parte de la región del trígono adjunta a la uretra.
- Coloque el anillo de poliestireno molde, la superficie plana hacia abajo, en un 25 ° C llanura portaobjetos de vidrio.
- Llenar el molde de corona con 62 ° C una solución de agarosa y frío durante 2 minutos.
- Eliminar el tejido LUT de PBSTw y secar en un absorbente limpie.
- La transferencia de los tejidos en la solución de agarosa.
- El uso de fórceps para orientar el tejido LUT de agarosa de modo que se ha suspendido a mitad de camino entre la parte superior e inferior del molde de anillo y se incuba el tejido a 4 ° C hasta que la agarosa se ha solidificado.
- Si el tejido se hunde por completo durante el proceso de solidificación de agarosa, que puede ser eliminado de la agarosa y re-incorporado. Ajustar el tiempo de enfriamiento de la agarosa, según sea necesario durante el proceso de re-inclusión.
5. Seccionar los tejidos urogenitales con un micrótomo vibrador (basado en el protocolo descrito anteriormente) 7
- Montar la cuchilla Wilkinson reforzado en el microtomo vibración y establecer el ángulo de la hoja a 35 °. Rellene la cubeta de hielo muestra de lujo con PBS y el paquete mojado alrededor de la bañera de la muestra.
- Retire el tapón de agarosa solidificada del molde de anillo y seque la superficie del fondo con un absorbente limpie. Verificar que el tejido está orientada correctamente. Orientación de los tejidos se puede ajustar mediante el uso de una hoja de afeitar para biselar el borde plano de la clavija de agarosa.
- Adherir el plug agarosa en una muestra de microtomo vibración de montaje de disco con el pegamento Loctite, como se muestra en la figura. 1A.
- Inserte el disco de muestra de montaje en la vibratome.
- Ajustar el espesor de la sección microtomo a 50 micras, la velocidad a 2, y la amplitud de la lámina de 4 y empezar a cortar las secciones de tejido.
- El uso de fórceps romos para la transferencia de cada sección de tejido (Fig. 1B) a una placa de cultivo de 24 pocillos y que contiene helada PBSTw 0,5 ml.
- Para preparar las muestras de hibridación in situ sobre el consumo, la mayor parte de la agarosa en torno a cada sección de tejido (el resto de agarosa se derrite durante el procedimiento de ISH) y eliminar todos los restos asociados. Secciones de almacenar hasta 48 horas de grabación a 4 ° C en PBSTw.
6. Preparación de la muestra Basket para hibridación in situ
- Corte la parte inferior de un tubo de microcentrífuga en la marca de 100μL.
- Calentar el borde del corte del tubo en la llama hasta que el plástico se ablande, y luego presione el tubo de microcentrífuga con firmeza en el centro de un cuadrado de malla de poliéster 0.5in.
- Recorte el exceso de malla y el uso de una piscina climatizada de 18 aguja de calibre para perforar dos agujeros en cada tapa del tubo para completar la preparación de la cesta (Fig. 1C).
- Retire la tapa de una placa de 24 pocillos y perfore un agujero de 12 mm centrada sobre cada bien. Use la tapa para la transferencia de las cestas de la muestra entre los lavados del protocolo de ISH (Fig. 1D).
7. Embrión de preparación en polvo para hibridación in situ (basado en el protocolo descrito anteriormente) 8
- Recoger tejido de embrión de ratón de los ratones que son el mismo escenario que los cortes de tejido que se están evaluando y almacenar a -80 ° C. Coloque el tejido congelado en un pañuelo sumergir mortero de cerámica, en nitrógeno líquido, y el uso de un mortero para moler el tejido en un polvo fino.
- Combinan el polvo de embriones con 4 volúmenes de acetona y homogeneizar con varios golpes de un homogeneizador Dounce.
- Transferencia homogeneizado en un vaso de 15 ml con tapa de rosca vial y el extracto de la noche a 4 ° C.
- Polvo de pellets de embriones por centrifugación a 5000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Retire y deseche el sobrenadante que contienen lípidos. Resuspender el precipitado de tejido en 4vol de acetona fresca y extraer durante 2h a 4 º C.
- Pellet el polvo de embriones por centrifugación a 5000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Retire y deseche el sobrenadante.
- Deje secar al aire el precipitado sobre un papel filtro Whatman # 2. Aplastar pellet para obtener un polvo fino y guardar en un frasco de vidrio cerrado herméticamente a 4 ° C. El rendimiento aproximado es de 50 mg de polvo por 1 peso embrión g húmedo.
8. En el día de hibridación in situ una
- Precaliente solución de prehibridación (50% formamida, 5 x SSC, 1% reactivo de bloqueo, 10μg/mL tRNA de levadura, almacenar 10μg/mL heparina a -20 ° C) a 60,5 ° C. Esta solución se puede preparar con antelación y almacenadas a -20 ° C.
- Preparar una cámara de hibridación humidificado llenando un recipiente pequeño de plástico con alrededor de 0,5 en la del agua del grifo. Tapa del recipiente y precalentar a 60,5 ° C.
- Añadir 2 ml PBSTw a los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos. Cestas Ponga la muestra en los agujeros de la tapa de la placa de 24 pozos y las secciones de transferencia de tejido en los cestos (hasta 10 secciones por cada canasta se han utilizado).
- Incubar las secciones de tejido durante 30 minutos a 25 ° C en el 6% H 2 O 2. Esta y todas las incubaciones posteriores deben realizarse con una suave agitación en un agitador orbital, a menos que se indique lo contrario. Todas las incubaciones und lava se llevan a cabo en placas de 24 pozos y el uso de un volumen de solución total de 2mL/well.
- Lávese las secciones de tejido de 4 x 5 min a 25 ° C en PBSTw.
- Incubar las secciones de tejido de 12 minutos a 25 ° C en PBSTw contiene 5μg/mL proteinasa K.
- Lávese las secciones de tejido 1 x 5 min a 25 ° C en PBSTw.
- Después de fijar las secciones de tejido de 20 minutos a 25 ° C en PBS que contenía 4% de paraformaldehído y 0,2% de glutaraldehído.
- Lávese las secciones de tejido de 2 x 5 min a 25 ° C en PBSTw.
- Añadir 2mL/well del buffer de prehibridación precalentado y se incuban las secciones de tejido dentro de la cámara de hibridación humidificado por lo menos durante 1 hora a 60,5 ° C.
- Añadir riboprobe 0.65μg etiquetados en el búfer de prehibridación en cada uno de los cortes de tejido bien e incubar durante la noche en la cámara de hibridación humidificado a 60,5 ° C.
9. En el Día hibridación in situ 2
- Prepare las siguientes soluciones para el lavado de medidas post-hibridación: Solución 1 (50% formamida, 5 x SSC, SDS al 1%), Solución 2 (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1% de Tween ™ 20, 0,2 mm de azida de sodio , 0.22μm filtrado), y la solución de 3 (2x SSC, formamida al 50%). Estas soluciones pueden ser preparados de antemano. Soluciones de 1 y 3 se almacenan a -20 ° C y la solución 2 se almacena a 25 ° C. La vida de almacenamiento de las soluciones es por lo menos 3 meses.
- Lávese las secciones de tejido 3 X 30 minutos a 60,5 ° C, con pre-calentado Solución 1. Utilice la cámara húmeda durante el lavado.
- Lávese las secciones de tejido 1 X 10 minutos a 60,5 ° C con 1/Solution solución pre-calentado 2 (1:1 v / v). Utilice la cámara húmeda durante el lavado.
- Lávese las secciones de tejido de 4 x 10 min a 25 ° C con la solución 2.
- Incubar las secciones de tejidos para 15 minutos a 37 ° C en la solución 2 contiene 0.25μg/mL RNasa.
- Lávese las secciones de tejido 1 X 10 min a 25 ° C con la solución 2 (sin RNasa).
- Lávese las secciones de tejido 1 X 10 min a 25 ° C con una solución de 3, seguido por dos lavados a X1hr 60,5 ° C con una solución de 3. Utilice la cámara húmeda durante los 60,5 ° C se lava.
- Prepare las siguientes soluciones para la detección inmunohistoquímica de la riboprobes marcada con DIG: Buffer de tejido de bloqueo (TB, TBS 1X, 10% suero de oveja, el 1% reactivo de bloqueo, BSA al 1%, 0,1% de Tween 20 ™, 0.22μm filtrado), dilución del anticuerpo Buffer (AD, 1xTBS, 5% suero de oveja, el 1% reactivo de bloqueo, BSA al 1%, 0,1% de Tween ™ 20, azida de sodio 0,2 mm, 0,22 m ™ filtra) Anticuerpo Buffer de absorción (AA, 1xTBS, 5% suero de oveja, una reactivo% de bloqueo, BSA al 1%, el polvo de embriones 6mg/mL), y TBSTw (1xTBS, 0,1% de Tween ™ 20, 0,2 mm de azida de sodio, filtrada 0.22μm). Estas soluciones pueden ser preparados de antemano. TBSTw se almacena a 25 ° C, todas las demás soluciones se almacenan a -20 ° C.
- Lavar 3 x 10 min a 25 ° C con TBSTw.
- Incubar las secciones de tejido por lo menos 2h a 25 ° C en tampón TB.
- Mientras que los tejidos están incubando en tampón TB, añade 1.1μL anti-DIG anticuerpos por 200μL buffer AA para cada pozo. Incubar buffer AA + anticuerpos al menos 2h a 4 º C y centrifugar a 10.000 rpm durante 1 min. Eliminar el sobrenadante buffer AA y agregarlo a 2 ml de buffer de AD.
- Quitar secciones de tejido de la memoria intermedia TB e incubar durante la noche en una cámara húmeda a 4 ° C en un tampón que contiene anticuerpos AD.
10. En el Día hibridación in situ 3
- Prepare color el desarrollo de soluciones NTMT (Tris-HCl 100 mM pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2, 0,2 mm de azida de sodio, filtrada 0.22μm). Esta solución se puede preparar con antelación y se almacena a 25 ° C. Inmediatamente antes de su uso, añadir levamisol 2 mM y 0,1% de Tween 20 ™.
- Retire la solución de anticuerpos (AD buffer de anticuerpos +) de los pozos y la solución de almacenamiento a 4 ° C. Puede ser reutilizado hasta dos veces más.
- Lavar los tejidos 8 X 10 min a 25 ° C con TBSTw que contiene 2 mM levamisol.
- Con cuidado, la transferencia de los tejidos de las canastas a una placa de Petri que contiene TBSTw. El uso de fórceps para eliminar los residuos visibles. La transferencia de los tejidos en tubos de microcentrífuga limpio.
- Lavar los tejidos 1 X 10 min a 25 ° C con NTMT 1 ml.
- Retire la NTMT y añadir 1mL/tube de una mezcla que contiene 50% NTMT (con levamisol 2 mm) y un 50% BM púrpura, las trompas de lugar en una caja de luz protegidos y se incuba a 25 ° C. De color en tiempo de desarrollo varía desde varias horas hasta varios días. Si el color se desarrolla lentamente, el 100% BM púrpura puede ser utilizado.
- El desarrollo de monitor en color y el cambio NTMT / solución Purple BM si se acumula cristales precipitados o si sufre un cambio de color del amarillo al morado. Después del desarrollo de color (4-250 horas), los tejidos lavado de 2 x 5 min a 25 ° C con 1mL/tube de NTMT que contiene 2 mM levamisol.
- Incubar los tejidos durante la noche a 4 ° C en 1mL/tube de PBS que contenía 4% de paraformaldehído post-fijador.
- Para blanquear los tejidos, los tejidos se incuba durante 30 minutos a 25 ° C en 1mL/tube de PBSTw contiene 3% de H 2 O 2
- Las secciones de tejido se montan en portaobjetos de vidrio, cubreobjetos, y la imagen con un microscopio compuesto.
11. Los resultados representativos:
La orientación espacial de los tejidos del TUI en agarosa determina el plano de secciones de tejido. Para las secciones sagital, por lo menos las dos terceras partes de la vejiga se extirpa el tejido y LUT restante está integrado en agar de tal manera que la línea media uretral es paralela a la superficie plana del enchufe de agarosa (Figura 1). Pequeños ajustes en el plano de tejido puede ser hecha por el borde biselado plana del enchufe de agarosa. Una sección representativa sagital de un tejido LUT hombres 17.5dpc que se orienta en este plano se muestra en la Figura 1B.
Canastas muestra proteger a los cortes de tejido delicado de la pérdida y la acumulación de polvo y partículas de la materia durante el procedimiento de ISH de varios días. Cestas de la muestra son preparados por fusión de malla de poliéster para el extremo del corte de un tubo de microcentrífuga 1,5 ml (fig. 1C). Un pequeño orificio perforado en la tapa de cada cesta de la muestra para facilitar la solución de flujo de entrada y salida de las cestas. Cestas de la muestra se suspenden en soluciones ISH por su inclusión en los agujeros perforados de 12 mm en los párpados 24 y placa (Figura 1D). Las tapas de la placa de apoyo cestas modificado cuando se transfieren entre el 24 y placas durante los cambios de solución.
Es un reto para limitar la tinción inespecífica de fondo durante los períodos de incubación largos requeridos para la detección de ARNm de baja abundancia. La adición de azida de sodio 0,2 mm a las reservas de la muestra y su posterior filtración a través de filtros de 0.22μm parece limitar la tinción de fondo (Figura 2). Utilizando el método descrito aquí, no parece haber diferencias visibles en la tinción de fondo cuando las muestras se incuban en una solución de color de desarrollo para un período de tiempo prolongado (Figura 3).
Figura 1. Preparación de un ratón urogenital inferior (TUI) y la sección de tejido del tracto tubo de microcentrífuga de una canasta de ISH. Una LUT contiene parte de la vejiga, la uretra pélvica y Wolff asociados y la estructura Mϋllerian conducto de origen) se inserta en un tapón cilíndrico de bajo punto de fusión de agarosa al 4%. (A) El tapón está pegado a un disco muestra el montaje y (B) cortada en secciones 50 micras con un micrótomo de vibración. (C) Una sección de TUS se transfiere a un tubo de microcentrífuga de cesta que se prepara por la perforación de un agujero en la tapa del tubo y malla de poliéster de fusión en el extremo inferior de corte del tubo. (D) El tubo de microcentrífuga se inserta en los agujeros perforados de 12 mm en una tapa de placa de 24 pozos a fin de que las secciones de tejido se suspendió en solución tampón durante el protocolo de ISH. Puntas de flecha indican el tejido LUT en el tapón de agarosa.
Figura 2. Incorporación de azida de sodio 0,2 mm en 0.22μm soluciones filtradas mejora la calidad de los tejidos y reduce la tinción de fondo. 17.5dpc extensiones ratón macho urogenital inferior (LUT) fueron seccionadas en un plano sagital con un espesor de 50 micras. Muestras de tejido fueron teñidos por ISH con una sonda contra un homólogo de giro. Tampones utilizados para la ISH fueron (A) 0.22μm filtra y se complementa con azida de sodio 0,2 mm (Naaz) o (B), complementado sin filtrar, y no con Naaz. Puntas de flecha indican la tinción de fondo. Las imágenes fueron capturadas con la misma ampliación. Los resultados son representativos patrones de tinción para n = 3 independientes de basura ratones.
Figura 3. Intensidad de la tinción de fondo no parece aumentar con el desarrollo del color prolongado. 17.5dpc extensiones ratón macho urogenital inferior (LUT) fueron seccionadas en un plano sagital con un espesor de 50 micras. Las secciones fueron teñidas por ISH, mediante su incubación en la solución de tinción de cromógeno (A) 9.5h utilizando una sonda que reconoce la gran abundancia de transcripción relacionados con el estrógeno receptor gamma (Esrrg), (B) para 43.5h utilizando una sonda que reconoce la abundancia media bromodomain transcripción adyacente al dominio de dedos de zinc, 2A (Baz2a), o (C) para 236H utilizando una sonda que reconoce la transcripción de baja abundancia sin alas, de tipo MMTV integración familiar sitio, miembro de 10a (Wnt10a). Las imágenes fueron capturadas con la misma ampliación. Los resultados son representativos patrones de tinción para n = 3 independientes de basura ratones.
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Discussion
Utilizando el método descrito aquí, es posible detectar mRNAs en todos los principales tipos de células y los compartimentos de tejido de la LUT de ratón fetal hombres y mujeres incluyendo las pastillas de origen mesenquimal, urotelio, músculo liso, los brotes de próstata, conducto eyaculador y la vagina. Las secciones de 50 micras utilizado en este protocolo tiene la ventaja de ser lo suficientemente gruesa como para resolver la arquitectura del tejido (por ejemplo, los vasos sanguíneos), pero son lo suficientemente delgada como para evitar la captura de la sonda, que es un problema metodológico se encuentran comúnmente en todo el montaje ISH. Cada riboprobe nuevo se evalúa en el tejido de control positivo, donde tinción ha sido evaluada en un estudio previo publicado. Nos aseguramos de que los patrones de coloración son específicos de estos tejidos. Otra de las ventajas de nuestro método es que los patrones de los ARNm de múltiples pueden ser evaluados en las secciones de tejidos adyacentes del tejido LUT misma. Además, este método puede combinarse con técnicas de inmunohistoquímica para visualizar marcadores celulares específicos de proteínas e identificar los tipos de células teñidas por el protocolo de ISH. Este método no es compatible con los métodos tradicionales contratinción, como contratinción nuclear con Fast Red o hematoxilina. Sin embargo, tenemos muestras de éxito de contraste con las manchas fluorescentes nuclear, incluyendo 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y yoduro de propidio.
El método aquí descrito incluye varias mejoras sobre el que se ha descrito anteriormente 7. Casi todos los tampones y soluciones de reactivos de valores en el manuscrito actual se preparan con antelación y pueden ser almacenados por largos períodos de tiempo, lo que aumenta la eficiencia. La adición de azida de sodio 0,2 mm para la mayoría de los reactivos y su filtración a través de las membranas 0.22μm disminuye en gran medida la tinción inespecífica de fondo, aumenta la vida útil del reactivo, y minimiza la acumulación de partículas en las secciones de tejido durante el procedimiento de ISH. Este manuscrito también se describe la fabricación de cestas permeable tubo de microcentrífuga que contiene secciones de tejido durante la ISH y una modificación de múltiples y tapa la placa de la cultura que sostiene las canastas durante los cambios de buffer. Hemos encontrado que estos dispositivos, que son fáciles de fabricar en el laboratorio, reducir la pérdida de la muestra, minimizar los daños sección durante el procesamiento, y mejorar la eficiencia. Además, el uso de un recipiente hermético de plástico, como una cámara de humedad ayuda a proteger contra la evaporación. Esto es especialmente importante para las secciones de tejido en los pozos de muestras periféricas, donde el llamado "efecto borde" puede introducir una variable experimental. Durante el uso de cámaras de humedad, no hemos observado diferencias apreciables en la calidad de la tinción de la muestra periférica en comparación con los pozos de interior.
Aunque este protocolo es un mecanismo eficiente para estudiar los patrones de expresión de ARNm en los tejidos del ratón LUT, hay algunas limitaciones con este método. Eficacia de la detección de mRNA varía entre riboprobes y la abundancia absoluta de los ARNm no se puede determinar. Otra limitación es que los patrones de coloración puede variar dependiendo del plano de sección. Para minimizar estas limitaciones, podemos evaluar cada patrón de ARNm en varias secciones de múltiples independientes de basura fetos.
Este método puede ser optimizado para la visualización de patrones de expresión de ARNm en otros tipos de tejidos del ratón o de otras especies. Dicha modificación requiere que la amplitud de la hoja de microtomo y la velocidad pueden optimizar durante el corte de tejido y que la concentración de proteinasa K se optimiza durante el procedimiento de ISH. Además, es necesario pre-absorber los anticuerpos anti-digoxigenina con el polvo del embrión de la misma especie de tejido que está siendo evaluada por ISH. Aunque este método no es útil para las secciones de tejido más fino que 40 micras, ya que las secciones se desintegran durante la tinción ISH, que puede ser adaptado para su uso en el alto rendimiento de tinción ISH todo el montaje. Hemos utilizado este método con éxito para llevar a cabo todo el montaje en la ISH de próstata del ratón fetal y neonatal, así como las gónadas y los riñones del feto. Para todo el montaje tinción ISH, es necesario optimizar la digestión de proteinasa K tejidos, así como la cantidad y la duración de los lavados después de la incubación de anticuerpos durante la noche para reducir la tinción de fondo causado por la captura de la sonda.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Dra. Lan Yi, Instituto del Cáncer de Nueva Jersey, para la asistencia técnica en la preparación de cestas de tejido. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones DK083425 y DK070219.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Group | 11214667001 | |
| Blocking reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Group | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 | |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Group | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Group | 11969064001 | |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model | |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp | 46551 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 | |
| Millicell culture plate insert | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 | |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 | |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase inhibitor | Roche Group | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza Inc. | 50101 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solution | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A | |
| Yeast tRNA | Roche Group | 109495 |
References
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- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
