Summary
Här beskriver vi en effektiv hög genomströmning
Abstract
Utveckling av den lägre urogenitalsystemet (LUT) är en invecklad process. Denna komplexitet styrks vid bildandet av prostata från fostrets manliga urinröret, som bygger på androgena signaler och epitelceller-mesenkymala interaktioner 1,2. Att förstå de molekylära mekanismer som ansvarar för prostata utveckling kan avslöja tillväxt mekanismer som olämpligt är återuppväckt senare i livet att ge upphov till prostata sjukdomar såsom godartad prostataförstoring och prostatacancer.
Utvecklingsländerna LUT är anatomiskt komplex. Vid tiden prostatahyperplasi spirande börjar på 16,5 dagar efter befruktningen (DPC), många celltyper är närvarande. Kärlsystemet, nerver och glatt muskulatur finns inom de mesenkymala stroma 3. Detta glatta omger en mångbottnad epitel och ger upphov till fostrets prostatan genom androgenreceptorn-beroende parakrina signaler 4. Identiteten på den stromaceller androgen receptor-lyhörd gener som behövs för prostata utveckling och den mekanism genom vilken prostata duktal epitel former som svar på dessa gener är inte helt klarlagd. Förmågan att exakt identifiera celltyper och lokalisera uttrycket av specifika faktorer inom dem är absolut nödvändigt att ytterligare förstå prostata utveckling. In situ hybridisering (ISH) möjliggör lokalisering av mRNA i en vävnad. Därför kan denna metod användas för att identifiera mönster och tidpunkten för uttryck av signalering molekyler och deras receptorer, och därigenom belysa potentiella prostata utvecklande tillsynsmyndigheter.
Här beskriver vi en hög teknik genomströmning ISH att identifiera mönster mRNA uttryck i fostrets musen LUT med vibrerande mikrotom-cut sektioner. Denna metod har flera fördelar jämfört med andra ISH protokoll. Utföra ISH på tunna delar iakttas en bild är tekniskt svårt, kryosnitt ofta har dålig strukturell kvalitet medan både kryosnitt och sektioner paraffin resulterar ofta i svag signal upplösning. Utföra ISH på hela berget vävnader kan resultera i sond svällning. Däremot använder vi hög genomströmning teknik tjockt skurna avsnitt som avslöjar detaljerad vävnad arkitektur. Ändrad mikrofugrör rör möjliggör enkel hantering av avsnitten under ISH förfarandet. Högst 4 mRNA transkript kan vara avskärmade från en enda 17.5dpc LUT med upp till 24 mRNA transkript detekteras i en enda körning, och därigenom minska kostnader och maximera effektiviteten. Denna metod gör att flera behandlingsgrupperna skall behandlas på samma sätt och som en enhet, och därmed undanröja någon bias för att tolka data. De flesta fog för prostata forskare, ger denna metod en tid och plats för låga och höga utskrifter överflöd mRNA i fostrets mus urinröret som ger upphov till prostatan duktal nätverk.
Protocol
1. Syntes av en Digoxigenin-11-UTP-märkta Riboprobe från en PCR-genererade Mall
- Att syntetisera en genspecifika riboprobe använder Entrez gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) för att erhålla den gen cDNA referens sekvens (RefSeq). Använd Primer3 programmet (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 att utforma genspecifika PCR mot 3'-regionen av cDNA sekvensen. Rekommenderade parametrar för PCR primer urval beskrivs på annan plats (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
- Använd Megablast Program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6 för att utvärdera särdragen hos den utvalda DNA-sekvens. Den DNA-sekvens anses vara specifik när du använder en FÖRVÄNTA tröskeln till 0,01 justeras inte det inte med andra sekvenser i RefSeq databasen.
- PCR förstärka riboprobe mall. PCR-reaktion komponenter och termocykling villkor bör optimeras för varje primer set. En typisk 50 l reaktion innehåller: 1X buffert, 2mm MgCl 2, 0,2 mm dNTPs, 1X Q-lösning, 1μg cDNA, 2.5U Taq DNA-polymeras, 0.25μm grundfärger och nukleasfritt H 2 O. En typisk termocykling Protokollet innehåller en initial denaturering vid 94 ° C för 2min följt av 40 cykler på 94 ° C i 30 sek, 57 ° C i 30 sek, 72 ° C under 1 min och en slutlig utbyggnad vid 72 ° C i 10min. Den cDNA används i PCR-reaktionerna som syntetiseras från mus urogenitala mRNA.
- Separat PCR-produkten med agarosgelelektrofores, rena med Kit Gel Extraction, och kvantifiera det renade produkter med spektrofotometri. Den förväntade avkastningen är 1,2 - 3.6μg.
- Transkribera PCR-produkten i ett märkt riboprobe. Transkriptionen reaktionen (40 l) innehåller: 400ng renade PCR-produkten, 1X nukleotid märkning blandning som innehåller digoxigenin 11-UTP, 1X transkription buffert, 5U RNas hämmare, 80U T7 RNA-polymeras, och nukleasfritt H 2 O. Inkubera 3-4 timmar vid 37 ° C och skaka prover varje 30min.
- Använd Qiagen RNEASY Mini Kit för att rena riboprobes baserat på instruktioner för RNA rensningen med i kolonnen DNas matsmältningen. Kvantifiera riboprobes med spektrofotometri. Den förväntade avkastningen är 40-20 mikrogram. Utvärdera sond kvalitet genom att separera en alikvot genom elektrofores på en 1,5% icke-denaturering agarosgel. Hög kvalitet sonder migrera till skillnad band med minimal smetas ut.
- För att säkerställa riboprobe specifikt känner igen sitt mål, inkluderar en positiv kontroll vävnad för första ISH experiment. Den riboprobe mål mRNA mönstret ska vara kända i denna positiva kontroll vävnad.
2. Beredning av Vibrerande mikrotom Blade (Baserat på tidigare beskrivna protokollet) 7
- Förbered en 4% låg smälta agaroslösningen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Mikrovågsugn för att lösa upp agaros och bibehålla lösning vid 62 ° C.
- Förbered en form polystyren ring genom att ta bort membranet från en 12 mm diameter Millicell odlingsplatta väl in och behålla polystyren ringen att använda som en agaros mögel. Blötlägg ringarna över natten i RNas hämmare lösning före varje användning.
- Att säkerställa en smidig skärande yta, ta bort rostskyddsmedel och andra tillsatser från ytan av Wilkinson bladet genom att skölja med följande lösningsmedel, 100% koncentration: petroleumeter, xylen, kloroform, metanol och MilliQ vatten. Separera dubbla bladet på längden i två enkla blad.
- Fäst Wilkinson bladen till en mikrotom blad med Loctite lim. Den mikrotom blad används inte för att skära, det tillför stabilitet till Wilkinson bladet. Den mikrotom Bladet borde sänkas till längden på Wilkinson kniven med järnsaxar och när följs, bör kompenseras med 3 - 4 mm från framkant av Wilkinson bladet.
3. Dissektion, lagring och förberedelse av Urogenitala vävnader för sektionering
- Förbered PBSTw lösning (PBS innehållande 0,1% Tween ™ 20 och 0,2 mm natriumazid, filtreras genom 0.22μm Stericup ® filter). Lösningen kan förberedas i förväg och förvaras vid 25 ° C.
- Inkubera en nyligen dissekeras mus LUT (urinblåsa, bäcken urinröret och tillhörande wolffska och Mϋllerian kanal som härrör strukturer) över natten vid 4 ° C i PBS som innehåller 4% paraformaldehyd fixativ.
- Torka vävnader genom att tvätta i 10 min vid 25 ° C i en serie av graderad metanol / PBSTw (1:3, 1:1, 3:01 v / v) lösningar. Förvara proverna vid -20 ° C i 100% metanol åtminstone över natten. Arkiverade vävnader kan förvaras minst 2 års.
- Förbered vävnader för sektionering av återfuktande arkiveras vävnader. Tvätta för 10min vid 25 ° C i en serie av graderad metanol / PBSTw (3:1, 1:1, 1:03 v / v) lösningar.
- Dissekera och kasta omkring två tredjedelar av urinblåsan, vilket de flesta av de trigone regionen knutna till urinröret.
- Placera polystyren ringen mögel, plan yta ner, på en 25 ° C vanligt glas objektglas.
- Fyll ringen form med 62 ° C agaroslösningen och svalt i ca 2min.
- Ta bort LUT vävnad från PBSTw och torka på ett absorberande torka.
- Överför vävnaden i agaroslösningen.
- Använd pincett för att orientera LUT vävnaden i agaros så att den är upphängd halvvägs mellan toppen och botten av ringen mögel och inkubera vävnaden vid 4 ° C tills agarosen stelnat.
- Om vävnaden sjunker helt under processen med agaros stelning, kan det vara utskurna ur agarosen och åter inbäddad. Justera kylning tiden för agarosen som behövs under re-inbäddning process.
5. Sektionering Urogenitala vävnad med en vibrerande mikrotom (Baserat på tidigare beskrivna Protocol) 7
- Montera förstärkta Wilkinson bladet i den vibrerande mikrotomen och ställ in bladvinkeln till 35 °. Fyll deluxe provet bad med PBS och pack is runt provet bad.
- Ta bort den stelnade agarosen kontakten ur ringen mögel och blot botten ytan med ett absorberande torka. Kontrollera att vävnaden är rättvänt. Vävnader orientering kan justeras genom att använda ett rakblad för att fasa den platta kanten av agarosen kontakten.
- Fäst agarosen kontakten på en vibrerande mikrotom exemplar monteringsskivan med Loctite lim enligt figur. 1A.
- Sätt provet monteringsskivan i vibratome.
- Justera mikrotomen snittjocklek till 50μm, hastigheten till 2, och bladet amplitud till 4 och börja skära vävnadssnitt.
- Använd trubbig pincett för att överföra varje vävnad sektion (Fig. 1B) till en 24-väl odlingsplatta väl som innehåller iskall 0,5 mL PBSTw.
- För att förbereda prover för in situ hybridisering, punktskatter flesta agarosen runt varje vävnad avsnitt (resterande agarosen smälter under ISH förfarandet) och ta bort alla tillhörande skräp. Förvara sektioner upp till 48hr vid 4 ° C i PBSTw.
6. Exempel Basket Förberedelse för in situ hybridisering
- Skär av botten av en mikrocentrifugrör på 100μL märket.
- Värm den skurna kanten av röret i en låga tills plasten är mjuk och tryck sedan på mikrocentrifugrör ordentligt på mitten av en 0.5in polyesternät torget.
- Trimma överskott mesh och använda en uppvärmd 18 gauge nål för att tränga igenom två hål i varje rör locket för att fylla korgen förberedelse (bild 1C).
- Ta av locket på en 24 brunnar och borra ett 12mm hål centrerat över varje brunn. Använd locket för att överföra prov korgar mellan tvättar av ISH-protokollet (fig. 1D).
7. Embryo Pulver Förberedelse för in situ hybridisering (Baserat på tidigare beskrivna Protocol) 8
- Samla vävnad mus embryo från möss som är samma scen som de vävnadssnitt som håller på att utvärderas och förvara vid -80 ° C. Placera fryst vävnad in i ett keramiskt murbruk, sänk vävnad i flytande kväve, och använd en mortelstöt för att slipa vävnad till ett fint pulver.
- Kombinera embryo pulver med 4 volymer aceton och homogenisera med flera slag av en dounce homogeniseringsapparat.
- Överför homogenatet till en 15ml glas skruvlock flaska och extrahera över natten vid 4 ° C.
- Pellets embryo pulver genom centrifugering vid 5000rpm för 10min vid 4 ° C. Ta bort och kasta lipid-innehållande supernatant. Resuspendera vävnaden pelleten i 4vol av färska aceton och extrahera 2hr vid 4 ° C.
- Pellets embryot pulvret genom centrifugering vid 5000rpm för 10min vid 4 ° C. Avlägsna och kassera supernatanten.
- Lufttorka pelleten på en # 2 Whatman filterpapper. Krossa pellets för att ge ett fint pulver och förvara i en tättslutande glasflaska vid 4 ° C. Den ungefärliga avkastning är 50 mg pulver per 1 g embryo våtvikt.
8. In Situ Hybridization dag 1
- Värm prehybridization lösning (50% formamid, 5x SSC, 1% Blockering av reagens, 10μg/mL jäst tRNA, 10μg/mL heparin förvaras vid -20 ° C) till 60,5 ° C. Denna lösning kan beredas i förväg och förvaras vid -20 ° C.
- Förbered en fuktig hybridisering kammare genom att fylla en liten Plastförpackning med ca 0,5 i kranvatten. Täck behållaren och värm till 60,5 ° C.
- Lägg 2ml PBSTw till brunnarna på en 24-bra kultur plattan. Placera prov korgar i hålen av 24-brunnar lock och överföra delar vävnad i korgarna (upp till 10 sektioner per korg har använts).
- Inkubera vävnadssnitt för 30min vid 25 ° C i 6% H 2 O 2. Detta och alla efterföljande inkubationer bör genomföras under försiktig omrörning på en skakapparat, om inte annat anges. Alla inkubationer end tvättar bedrivs i 24-brunnars plattor och använda en totallösning volym 2mL/well.
- Tvätta vävnadssnitt 4 x 5min vid 25 ° C i PBSTw.
- Inkubera vävnadssnitt för 12min vid 25 ° C i PBSTw innehåller 5μg/mL proteinas K.
- Tvätta vävnadssnitt 1 x 5 min vid 25 ° C i PBSTw.
- Post-fix vävnadssnitt för 20min vid 25 ° C i PBS som innehåller 4% paraformaldehyd och 0,2% glutaraldehyd.
- Tvätta vävnadssnitt 2 x 5 min vid 25 ° C i PBSTw.
- Tillsätt 2mL/well av uppvärmd prehybridization buffert och inkubera vävnadssnitt insidan fuktas hybridisering kammare under minst 1 timme vid 60,5 ° C.
- Lägg 0.65μg märkt riboprobe till prehybridization buffert i varje brunn och inkubera vävnadssnitt över natten i fuktad hybridisering kammaren vid 60,5 ° C.
9. In Situ Hybridization Dag 2
- Förbered följande lösningar för post-hybridisering tvätt steg: Lösning 1 (50% formamid, 5x SSC, 1% SDS), Lösning 2 (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 m NaCl, 0,1% Tween ™ 20, 0.2mm natriumazid , 0.22μm filtrerad) och Lösning 3 (2x SSC, 50% formamid). Dessa lösningar kan förberedas i förväg. Lösningar 1 och 3 lagras vid -20 ° C och Lösning 2 förvaras vid 25 ° C. Hållbarheten i de lösningar som är minst 3 månader.
- Tvätta vävnadssnitt 3 X 30 min på 60,5 ° C med förvärmda Lösning 1. Använd fuktig kammare under tvättar.
- Tvätta vävnadssnitt 1 X 10 min vid 60,5 ° C med förvärmda Lösning 1/Solution 2 (1:01 v / v) lösning. Använd fuktig kammare under tvätten.
- Tvätta vävnadssnitt 4 X 10 min vid 25 ° C med lösning 2.
- Inkubera vävnader sektioner för 15min vid 37 ° C i Lösning 2 innehåller 0.25μg/mL RNas.
- Tvätta vävnadssnitt 1 X 10 min vid 25 ° C med lösning 2 (utan RNas).
- Tvätta vävnadssnitt 1 X 10 min vid 25 ° C med Lösning 3, följt av 2 X1hr tvättar i 60,5 ° C med Lösning 3. Använd fuktig kammare under 60,5 ° C tvättar.
- Förbered följande lösningar för immunhistokemisk detektion av DIG-märkt riboprobes: Tissue blockerande buffert (TB, 1X TBS, 10% får serum, 1% blockering reagens, 1% BSA, 0,1% Tween ™ 20, 0.22μm filtrerad) Antikropp Spädning Buffer (AD, 1xTBS, 5% får serum, 1% blockering reagens, 1% BSA, 0,1% Tween ™ 20, 0,2 mm natriumazid, 0,22 ™ m filtrerad) Antikropp Absorption Buffer (AA, 1xTBS, 5% får serum, 1 % blockering av reagens, 1% BSA, 6mg/mL embryo pulver) och TBSTw (1xTBS, 0,1% Tween ™ 20, 0,2 mm natriumazid, 0.22μm filtrerad). Dessa lösningar kan förberedas i förväg. TBSTw lagras vid 25 ° C, är alla andra lösningar förvaras vid -20 ° C.
- Tvätta 3 x 10 min vid 25 ° C med TBSTw.
- Inkubera vävnadssnitt minst 2hr vid 25 ° C i TB buffert.
- Medan vävnader inkubera i TB buffert, lägg 1.1μL anti-DIG antikropp per 200μL AA-buffert för varje brunn. Inkubera AA buffert + antikroppar minst 2hr vid 4 ° C, därefter centrifugera vid 10.000 rpm under 1 min. Avlägsna AA buffert supernatanten och lägga till 2ml av AD buffert.
- Ta bort vävnadssnitt från TB buffert och inkubera dem över natten i en fuktig kammare vid 4 ° C i AD buffert innehållande antikroppar.
10. In Situ Hybridization Dag 3
- Förbered färg NTMT utveckling lösning (100mm Tris-HCl pH 9,5, 100mm NaCl, 50 mM MgCl 2, 0,2 mm natriumazid, 0.22μm filtrerad). Denna lösning kan beredas i förväg och förvaras vid 25 ° C. Omedelbart före användning, lägg till 2mm levamisol och 0,1% Tween ™ 20.
- Ta bort antikroppar lösningen (AD buffert + antikropp) från brunnarna och butikslösning vid 4 ° C. Det kan återanvändas upp till ytterligare två gånger.
- Tvätta vävnader 8 x 10 min vid 25 ° C med TBSTw innehåller 2mm levamisol.
- Försiktigt överföra vävnad från korgar till en petriskål med TBSTw. Använd pincett för att avlägsna synlig smuts. Överför vävnaderna till rena mikrocentrifugrör.
- Tvätta vävnader 1 x 10 min vid 25 ° C med 1 mL NTMT.
- Ta bort NTMT och lägga 1mL/tube av en blandning som innehåller 50% NTMT (innehållande 2mm levamisol) och 50% BM Lila, Placera rören i en skyddad ljuslåda och inkubera vid 25 ° C. Färg utvecklingstiden varierar från några timmar till flera dagar. Om färgen är långsamt att utveckla, kan 100% BM Lila användas.
- Övervaka färg utveckling och förändring NTMT / BM Lila lösning om det ackumuleras utfällda kristaller eller om det genomgår färgförändring från gult till lila. Efter fullfärg utveckling (4-250 timmar), tvätta vävnader 2 X 5min vid 25 ° C med 1mL/tube av NTMT innehåller 2mm levamisol.
- Inkubera vävnader över natten vid 4 ° C i 1mL/tube av PBS som innehåller 4% paraformaldehyd post-fixativ.
- Att bleka vävnader, inkubera vävnader för 30min vid 25 ° C i 1mL/tube av PBSTw innehåller 3% H 2 O 2
- Vävnadssnitt monterade på objektglas, coverslipped och avbildade med ett sammansatt mikroskop.
11. Representativa resultat:
Den rumsliga orienteringen för LUT vävnad i agarosen bestämmer plan vävnadssnitt. För sagittal avsnitten är minst två tredjedelar av urinblåsan exciderad och resterande LUT vävnaden är inbäddade i agar så att urinrörets mittlinjen är parallell med den plana ytan av agarosen kontakten (Figur 1A). Mindre justeringar i vävnaden planet kan göras av avfasning den platta kanten av agarosen kontakten. En representant sagittal avsnitt från en 17.5dpc manlig LUT vävnad som är orienterad i detta plan visas i figur 1B.
Exempel korgar skydda den känsliga vävnadssnitt från förlust och samlas damm och partiklar under flera dagar ISH förfarande. Exempel korgar förbereds av smältande polyester mesh på den avskurna ändan av en 1,5 mL mikrofugrör (Figur 1C). Ett litet hål är hål i locket på varje prov korg för att underlätta lösningen flöda in och ut ur korgarna. Exempel korgar är suspenderade i ISH lösningar genom att placera dem i 12mm hål borras i 24-brunnar lock (figur 1D). Den modifierade plattan lock stöd korgar när de överförs mellan 24-brunnars plattor under lösning förändringar.
Det är utmanande att begränsa icke-specifik bakgrundsfärgning under den långa inkubationstid krävs för detektering av låg överflöd mRNA. Tillsats av 0,2 mm natriumazid att prova buffertar och deras efterföljande filtrering genom 0.22μm filter verkade begränsa bakgrundsfärgning (Figur 2). Använda den här beskrivna metoden, verkar det inte vara synliga skillnader i bakgrund färgning när prover inkuberas i färg utvecklingen lösning för en längre tidsperioder (figur 3).
Figur 1. Beredning av en mus lägre urogenitala (LUT) tarmkanalen vävnad avsnitt och mikrocentrifugrör en korg för ISH. En LUT innehåller en del av urinblåsan, bäcken urinröret och tillhörande wolffska och Mϋllerian kanal-derived struktur) är inbäddad i en cylindrisk kontakt med 4% låg smälta agaros. (A) Pluggen limmas på ett prov monteringsskivan och (B) skuren i 50μm sektioner med en vibrerande mikrotomen. (C) En LUT avsnitt överförs till ett mikrocentrifugrör korg som förbereds av piercing ett hål i röret locket och fusing polyester mesh till skära botten av röret. (D) mikrocentrifugrör sätts in 12mm hål borras i en 24-brunnar locket så att vävnadssnitt är upphängda i buffertlösning under ISH protokollet. Pilspetsar ange LUT vävnaden i agarosen kontakten.
Figur 2. Införande av 0,2 mm natriumazid i 0.22μm filtreras lösningar förbättrar vävnaders kvalitet och minskar bakgrundsfärgning. 17.5dpc hanmöss lägre urogenitala traktater (LUT) var uppställd i ett sagittalplanet till en tjocklek av 50μm. Vävnadssnitt färgades av ISH hjälp av en sond mot twist homolog 1. Buffertar används för ISH var antingen (A) 0.22μm filtreras och kompletteras med 0.2mm natriumazid (Naaz) eller (B) ofiltrerade och inte kompletteras med Naaz. Pilspetsar visar bakgrundsfärgning. Bilderna var tagna vid samma förstoring. Resultaten är representativa färgningsmönster för n = 3 kull-oberoende möss.
Figur 3. Bakgrund färgningsintensitet verkar inte öka med förlängd färgutvecklingen. 17.5dpc hanmöss lägre urogenitala traktater (LUT) var uppställd i ett sagittalplanet till en tjocklek av 50μm. Sektioner färgades av ISH genom inkubering dem i chromagen färglösningen för (A) 9.5h med hjälp av en sond som erkänner rikligt avskriften östrogen-relaterade gamma (Esrrg), (B) för 43.5h med hjälp av en sond som erkänner mediet överflöd avskrift bromodomain intill zink finger domän, 2A (Baz2a), eller (C) för 236h med hjälp av en sond som erkänner liten förekomst avskriften vinglösa-typ MMTV familjen integration webbplats medlem 10a (Wnt10a). Bilderna var tagna vid samma förstoring. Resultaten är representativa färgningsmönster för n = 3 kull-oberoende möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av metoden som beskrivs här, är det möjligt att upptäcka mRNA i alla de stora celltyper och fack vävnad av fostrets manliga och kvinnliga musen LUT inklusive mesenkymala kuddar, urotel, glatt muskulatur, prostata knoppar, ejaculatorius kanal, och vagina. Den 50μm avsnitten i detta protokoll har fördelen av att vara tjock nog för att lösa vävnad arkitektur (t.ex. blodkärl) men är tunna nog för att undvika sond fångst, vilket är ett metodologiskt problem som ofta uppstår under hela-fäste ISH. Varje ny riboprobe bedöms positiva kontrollen vävnad, där infärgning har utvärderats i en publicerad tidigare studie. Vi ser till att färgningsmönster är specifika i dessa vävnader. En annan fördel med vår metod är att olika mönster av flera mRNA kan bedömas i intilliggande vävnadssnitt från samma LUT vävnad. Dessutom kan denna metod kopplas till immunhistokemiska tekniker för att visualisera celler specifika proteiner markörer och identifiera celltyper färgad med ISH protokollet. Denna metod är inte kompatibelt med traditionella motfärgning metoder, såsom kärnkraft motfärgning med Fast Rött eller hematoxylin. Vi har dock lyckats counterstained prover med fluorescerande kärnvapen fläckar, inklusive 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) och propidiumjodid.
Metoden som beskrivs här innehåller flera förbättringar jämfört med en som tidigare beskrivits 7. Nästan alla buffertar och reagens lösningar lager i den aktuella manuskript förbereds i förväg och kan lagras under lång tid, vilket ökar effektiviteten. Tillsats av 0,2 mm natriumazid till de flesta reagenser och deras filtrering genom 0.22μm membran minskar kraftigt icke-specifik bakgrundsfärgning ökar reagens hållbarhet, och minimerar ansamling av partiklar på vävnadssnitt under ISH förfarandet. Detta manuskript beskriver också tillverkning av genomsläppliga korgar mikrocentrifugrör som innehåller vävnadssnitt under ISH och en modifierad flera bra odlingsplatta lock som håller korgarna under bufferten förändringar. Vi fann att dessa enheter, som lätt tillverkas i labbet, minska provförlust, minimera skada vävnader avsnitt under bearbetning, och öka effektiviteten. Vidare bidrar användandet av en återförslutningsbar plastförpackning som en fuktkammare för att skydda mot avdunstning. Detta är särskilt viktigt för vävnadssnitt i perifert provbrunnar, där den så kallade edge effekt "kan införa en experimentell variabel. När du använder luftfuktighet kamrarna, vi har inte observerats väsentliga skillnader färgning kvalitet i perifera kontra inre provbrunnar.
Även om detta protokoll är en effektiv mekanism för att studera mönster mRNA uttryck i mus LUT vävnader, det finns vissa begränsningar med denna metod. Effektivitet av mRNA upptäckt varierar mellan riboprobes och absolut förekomst i mRNA inte kan fastställas. En annan begränsning är att färgningsmönster kan variera beroende på sträckan planet. För att minimera dessa begränsningar, bedömer vi varje mRNA mönster i flera avsnitt från flera kull oberoende av foster.
Denna metod kan optimeras för att visualisera mönster mRNA uttryck i andra typer mus vävnad eller andra arter. En sådan ändring kräver att mikrotomen bladet amplitud och hastighet kan optimeras under vävnad sektionering och att proteinas K koncentration optimeras under ISH förfarandet. Dessutom är det nödvändigt att i förväg absorbera anti-digoxigenin antikropp med embryo pulver från samma art av vävnad som håller på att utvärderas av ISH. Även om denna metod är inte användbart för vävnadssnitt tunnare än 40 mikrometer, eftersom de delar upplösas under ISH färgning, kan det vara anpassade för användning i hög genomströmning hela montering ISH färgning. Vi har använt den här metoden framgångsrikt för att genomföra hela montera ISH på foster och nyfödda mus prostata samt fostrets gonad och njure. För hela montering ISH färgning, är det nödvändigt att optimera proteinas K vävnad matsmältningen samt mängden och varaktigheten av tvättar följande natten antikropp inkubation att minska bakgrundsfärgning orsakade av sond svällning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka doktor Lan Yi, Cancer Institute i New Jersey, för tekniskt bistånd för att förbereda vävnad korgar. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag DK083425 och DK070219.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Group | 11214667001 | |
| Blocking reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Group | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 | |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Group | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Group | 11969064001 | |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model | |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp | 46551 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 | |
| Millicell culture plate insert | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 | |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 | |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase inhibitor | Roche Group | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza Inc. | 50101 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solution | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A | |
| Yeast tRNA | Roche Group | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
