Summary
Burada, biz verimli bir yüksek kapasiteli tarif
Abstract
Alt üriner sistem (LUT) geliştirilmesi, karmaşık bir süreçtir. Bu karmaşıklık, androjenik sinyalleri ve etkileşimleri 1,2 epitelyal-mezenkimal dayanmaktadır fetal erkek üretra, prostat oluşumu sırasında kanıtlanmıştır . Prostat gelişiminde sorumlu olan moleküler mekanizmaların anlaşılması uygunsuz prostat, benign prostat hiperplazisi ve prostat kanseri gibi hastalıklara yol açmaları daha sonra yaşamın yeniden canlanmasına sebep oldu büyüme mekanizmalarının ortaya çıkarabilir.
Gelişmekte olan LUT anatomik olarak karmaşık. Tomurcuklanma zaman prostat 16.5 gün anlayışı (DPC) başlar, çok sayıda hücre tipleri mevcuttur. Damarları, sinirleri ve düz kas mezenkimal stroma 3 içinde bulunur. Bu çok katmanlı bir epitel stroma çevreleyen ve fetal androjen reseptör bağımlı parakrin sinyaller 4 ile prostata yol açmaktadır. Stromal androjen kimlik reseptör duyarlı prostat gelişiminde ve bu genlerin yanıt prostat duktal epitel formları tam olarak anlaşılmış değildir hangi mekanizma için gerekli olan genler. Yeteneği tam hücre tiplerinin tanımlanması ve bunların içindeki belirli faktörlerin ifade lokalize prostat gelişiminde daha fazla anlamak için şarttır. Situ hibridizasyon (ISH) bir doku içindeki mRNA'ların lokalizasyonu için izin verir . Böylece, bu yöntem ve böylece potansiyel prostat gelişim düzenleyiciler nedenlerine açıklık, desen ve sinyal molekülleri ve bunların reseptörleri ifade zamanlaması tanımlamak için kullanılır.
Burada, titreşimli mikrotom kesilmiş bölümler kullanarak fetal fare LUT mRNA desenleri tanımlamak için bir yüksek verim ISH tekniği açıklar. Bu yöntem diğer ISH protokolleri üzerinden birçok avantaj sunar. Bir slayt yapıştırılır ince bölümlerde ISH Sahne teknik olarak zor, hem cryosections ve parafin bölümleri genellikle zayıf sinyal çözünürlüğü neden cryosections sık sık kötü yapısal kalite var. Bütün montaj dokular üzerinde ISH Sahne prob yakalama neden olabilir. Buna karşın, yüksek kapasiteli tekniği ayrıntılı mimari dokusu ortaya kalın kesilmiş bölümler kullanır. Modifiye mikrofuge'de tüpler ISH prosedürü sırasında bölümleri kolay kullanım sağlar. Ve böylece maliyet, maksimum verimlilik azaltarak, maksimum 4 mRNA transkript kadar tek bir çalışma tespit edilen 24 mRNA transkript ile tek bir 17.5dpc LUT gösterildi. Bu yöntem, birden fazla tedavi gruplarında böylece verileri yorumlamak için herhangi bir önyargı çıkarırken, aynı ve tek bir birim olarak işlenen sağlar. En pertinently prostat araştırmacılar için, bu yöntem, düşük ve yüksek bolluk mRNA transkript prostat duktal ağ sebebiyet veren fetal fare üretra mekansal ve zamansal bir konum sağlar.
Protocol
1. PCR oluşturuldu Şablon digoxigenin-11-UTP Etiketli Spastine Özgü Riboprop Sentezi
- Gen-spesifik bir Spastine Özgü Riboprop sentezlemek için, cDNA referans gen sekansı (RefSeq) elde etmek için Entrez Gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) kullanın . CDNA dizisinin 3'-bölge karşı gen-spesifik PCR primerleri tasarım Primer3 programı (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 kullanın. PCR primer seçimi için önerilen parametreler (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html) başka bir yerde tanımlanmıştır.
- MegaBLAST Programı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6 seçilen DNA dizisi özgüllüğü değerlendirmek için kullanın. 0.01 BEKLEYEBILIRIM eşik kullanarak, DNA sekans spesifik olarak kabul edilir, diğer dizileri RefSeq veritabanı ile uyumlu değildir.
- PCR Spastine Özgü Riboprop şablonu yükseltmek. PCR reaksiyonu bileşenleri ve thermocycling koşulları her astar kümesi için optimize edilmelidir. Tipik bir 50 ul reaksiyon içerir: 1X tampon, 2mm MgCl 2, 0.2mm dNTP, 1X Q çözümü, 1μg cDNA, 2.5U Taq DNA polimeraz, 0.25μm primerler ve nükleaz içermeyen H 2 O. Tipik bir thermocycling protokolü bir ilk denatürasyon 94 ° 2dk 30sn 40 çevrimleri ile 94 ° C için C, 57 ° C, 30 saniye için 72 ° C 1dk ve 10 dakika süreyle 72 ° C'de son bir uzantısı içerir. CDNA PCR reaksiyonlarında kullanılan fare ürogenital mRNA sentezlenir.
- PCR ürünü agaroz jel elektroforezi ile ayırın, Jel Ekstraksiyon kiti kullanılarak arındırmak ve saflaştırılmış ürünler spektrofotometri ile ölçmek. Beklenen verimi 1.2 - 3.6μg.
- Etiketli Spastine Özgü Riboprop içine PCR ürünü Transcribe. Transkripsiyon reaksiyonu (40 ul) içerir: 400ng saflaştırılmış PCR ürünü, 1X digoxigenin 11-UTP, 1X transkripsiyon tampon, 5U RNaz inhibitörü, 80U T7 RNA polimeraz ve nükleaz içermeyen H 2 O. içeren nükleotid etiketleme karışımı Inkübe 3-4saat, 37 ° C ve ajitasyon örnekleri her 30 dk.
- Sütun DNaz sindirim RNA temizleme talimatları dayalı riboprobes arındırmak için Qiagen RNEASY Mini kiti kullanın. Spektrofotometri riboprobes Asitli. Beklenen verimi 4-20 mg. % 1.5 sigara denatüre agaroz jel elektroforezi ile bir kısım ayırarak prob kalitesini değerlendirmek. Yüksek kaliteli probları minimal bulaşması ile ayrı bantları olarak göç ederler.
- Spastine Özgü Riboprop özellikle hedef tanır sağlamak için, ilk ISH deney için bir pozitif kontrol doku içerir. Bu pozitif kontrol dokusu Spastine Özgü Riboprop hedef mRNA desen bilinmesi gerekmektedir.
2. Titreşimli Mikrotom Blade Hazırlama (Önceden tanımlanan Protokolü dayanarak) 7
- % 4 düşük erime agaroz çözüm hazırlayın fosfat tamponlu salin (PBS). Agaroz çözülür ve 62 çözüm korumak için Mikrodalga çözüm ° C
- 12mm çapı Millicell kültür plakasına yerleştirin ve bir agaroz kalıp olarak kullanmak için polistiren halka korumak zarı çıkarmadan polistiren halka kalıp hazırlayın. Her kullanımdan önce RNaz inhibitörü çözümü geceleme halkaları bekletin.
- Düzgün bir kesim yüzeyi sağlamak için,% 100 konsantrasyonda, aşağıdaki çözücüler ile durulama Wilkinson bıçak yüzeyi pas önleyici ve diğer katkı maddeleri kaldırın: petrol eteri, ksilen, kloroform, metanol ve MilliQ su. Iki tek bıçak içine uzunlamasına çift bıçak ayırın.
- Wilkinson bıçakları Loctite yapıştırıcı ile bir mikrotom bıçak uyun. Mikrotom bıçak kesim için değil, Wilkinson bıçak sertliği ekleyen. Wilkinson, bıçağın kesme kenarından 4mm - mikrotom bıçağı, metal makas ve bir kez yapıştırılır kullanarak Wilkinson bıçak uzunluğu kesilmelidir, 3 mahsup edilmelidir.
3. Kesit Ürogenital Dokular Diseksiyon, Depolama ve Hazırlık
- PBSTw çözüm hazırlayın (PBS% 0.1 içeren Tween ™ 20 ve 0.2mm sodyum azid 0.22μm Stericup süzgecinden ® filtre ünitesi). Çözüm önceden hazırlanmış ve 25 ° C'de saklanabilir
- 4 geceleme taze disseke fare LUT (mesane, pelvik üretra ve ilişkili Wolf ve Mϋllerian kanalı kökenli yapılar) ° C PBS içinde% 4 paraformaldehid fiksatif içeren inkübe edin.
- 25 10 dakika süreyle yıkanması ° C kademeli metanol / PBSTw (1:3, 1:1, 03:01 v / v) çözümleri bir dizi dokular dehydrate. Gecede en az% 100 metanol içinde -20 ° C saklayınız örnekleri. Arşivlenmiş dokulara en az 2yr tutulabilir.
- Arşivlenen dokuların rehidrate kesit için dokular hazırlayın. 25 ° C, kademeli metanol / PBSTw bir dizi (3:1, 1:1, 01:03 v / v) çözümleri 10 dakika süreyle yıkayın.
- Inceleyin ve üretra bağlı trigon bölgenin en bırakarak, mesane yaklaşık üçte ikisi iptal.
- 25 ° C düz cam mikroskop lamı, aşağı polistiren halka kalıp, düz bir yüzeye yerleştirin.
- 62 ° C agaroz çözeltisi ve 2 dakikada bir yaklaşık serin halka kalıp doldurun.
- PBSTw LUT doku çıkarın ve silin emici bir kuru kurulayın.
- Agaroz çözüm doku aktarın.
- Yönlendirmek agaroz katılaşmış ° C kadar halka kalıp alt ve üst arasında yarım asma ve 4 doku inkübe böylece agaroz LUT doku forseps kullanın.
- Doku agaroz katılaşma sürecinde tamamen lavabolar, agaroz ve yeniden gömülü eksize edilebilir. Yeniden gömme işlemi sırasında gerekli agaroz soğutma saati ayarlayın.
5. Titreşimli Mikrotom (Önceden tanımlanan Protokolü dayanarak) 7 ile Ürogenital Doku Kesit
- Titreşimli mikrotom Mount takviyeli Wilkinson bıçak ve bıçak açısı 35 ° 'ye ayarlayın. Deluxe örnek banyo PBS ve paket numune banyo etrafında ıslak buz ile doldurun.
- Halka kalıp katılaşmış agaroz fişini çıkartın ve emici bir malzeme ile silin alt yüzeyi kurulayın. Doku doğru yönde olduğundan emin olun. Dokular oryantasyon agaroz fişi düz kenarı konik bir jilet kullanarak ayarlanabilir.
- Şekil Loctite yapıştırıcı ile disk montaj titreşimli mikrotom numune üzerine agaroz fiş uyun. 1A.
- Vibratome içine numune montaj disk yerleştirin.
- 4 mikrotom kesit kalınlığı 50μm, 2 hız ve bıçak genlik ayarlayın ve doku kesitlerinde kesme başlar.
- Künt forseps buz 0.5mL PBSTw içeren 24-iyi bir kültür plakasına her doku kesiti (Şekil 1B) aktarmak için kullanın.
- In situ hibridizasyon, tüketim için her doku bölümü (kalan agaroz ISH prosedürü sırasında eriyecek) etrafında agaroz örnekleri hazırlamak ve ilgili tüm pislikleri temizleyin. 4 48hr Mağaza bölümleri ° C PBSTw içinde.
6. Situ Hibridizasyon için Örnek Sepeti Hazırlama
- 100μL işareti mikrosantrifüj tüp alt kesin.
- Kadar plastik yumuşatılmış bir alev tüp kesme kenarı Isı mikrosantrifüj tüp, daha sonra merkezi bir 0.5in polyester mesh kare üzerine sıkıca basın.
- Trim ve aşırı örgü sepet hazırlama (Şekil 1C) tamamlamak için her tüp kapağının içine delmek iki delik ısıtmalı 18 iğne kullanın.
- 24 plaka kapağını çıkarın ve her aşkın merkezli bir 12mm delik. ISH protokol yıkar (Şekil 1D) arasında örnek sepetler aktarmak için kapağı kullanın.
7. Situ Hibridizasyon için Embriyo Toz Hazırlama (Önceden tanımlanan Protokolü) 8
- Aynı doku bölümleri olarak değerlendirilmekte olup, sahne ve mağaza -80 ° C fareler fare embriyo doku toplamak Dondurulmuş doku, sıvı nitrojen içinde seramik harcı, batığın doku içine yerleştirin ve doku ince bir toz haline öğütmek için bir havaneli kullanabilirsiniz.
- Aseton 4 cilt embriyo tozu birleştirin ve Dounce Homojenizatör birkaç vuruş ile homojenize.
- 15 mL cam vida top flakon Homojenat transferi ve gece ekstresi, 4 ° C
- 4 10 dakika süreyle santrifüj 5000rpm Pelet embriyo tozu ° C Lipit içeren süpernatant çıkarın ve atın. Taze aseton 4vol içinde doku pelletini tekrar ve 4 2saat için ayıklamak ° C
- Pelet 4 5000rpm 10 dakika süreyle santrifüj embriyo toz ° C Süpernatantı çıkarın ve atın.
- Hava # 2 Whatman filtre kağıdı pelet kurulayın. 4 sıkıca kapalı cam şişe içinde ince bir toz ve mağaza verim pelet Crush ° C Yaklaşık verimi 1 g embriyo ıslak ağırlık başına 50 mg toz.
8. Gün 1 Situ Hibridizasyon
- 60.5 için ısıtın prehybridization solüsyonu (% 50 formamid, 5x SSC,% 1 Engelleme reaktif, 10μg/mL maya tRNA, 10μg/mL heparin mağaza -20 ° C) ° C Bu çözüm, önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de saklanabilir
- Musluk suyunun yaklaşık 0,5 ile küçük bir plastik saklama kabı doldurarak nemlendirilmiş bir melezleşme odası hazırlayın. 60.5 ° C'ye kadar konteyner ve ön ısıtma Kapak
- 24-iyi bir kültür plaka kuyulardan 2mL PBSTw ekleyin. Örnek sepet sepet (sepet başına 10 bölüm kullanılmıştır) içine 24 plaka kapağı ve transfer doku kesitlerinde deliklere yerleştirin.
- 25 saat 30 dakika için doku bölümleri inkübe ° C% 6 H 2 O 2. Bu ve sonraki tüm inkubasyon aksi belirtilmedikçe, bir yörünge çalkalayıcı üzerinde yavaşça sallanarak ile yürütülen olmalıdır. Tüm inkubasyon bird yıkar 24-kuyucuğu yapılan ve 2mL/well toplam bir çözüm hacmi kullanın.
- 25 ° C PBSTw doku kesitlerinde 4 x 5min yıkayın.
- 25 12min için doku bölümleri inkübe ° C PBSTw içinde 5μg/mL proteinaz K içeren
- 25 ° C PBSTw doku kesitlerinde 1 x 5min yıkayın.
- 25 Post-fix 20dk için doku kesitlerinde ° C PBS içinde% 4 ve% 0.2 paraformaldehid glutaraldehid içeren.
- Doku kesitlerinde 2 x 5min 25 ° C PBSTw içinde yıkayın.
- Prewarmed prehybridization tampon 2mL/well ekleyin ve içindeki doku bölümleri 60.5 1hr en az nemlendirilmiş hibridizasyon odası ° C inkübe
- 60.5 nemlendirilmiş hibridizasyon odasında bir gecede her iyi ve inkübe doku kesitlerinde prehybridization tampon 0.65μg etiketli Spastine Özgü Riboprop ekle ° C
9. 2 Situ Hibridizasyon Gün
- Post-hibridizasyon yıkama adımları için aşağıdaki çözümleri hazırlayın Çözüm 1 (% 50 formamid, 5x SSC,% 1 SDS), Çözüm 2 (10mM Tris-HCL pH 7.5, 0,5 M NaCl,% 0.1 Tween ™ 20, 0.2mm sodyum azid: ,) süzülmüş 0.22μm ve Çözüm 3 (2x SSC,% 50 formamid). Bu çözümler, önceden hazırlanmış olabilir. Çözüm 1 ve 3 -20 ° C ve Çözüm 2 saklanır 25 saklanır ° C Çözümleri depolama ömrü en az 3 ay.
- 60.5 doku kesitlerinde 3 X 30 dakika yıkayın ° C önceden ısıtılmış Çözüm 1. Yıkama sırasında nemlendirilmiş odasına kullanın.
- 60.5 doku bölümleri 1 X 10dk yıkayın ° C önceden ısıtılmış Çözüm 1/Solution 2 (1:1 v / v) solüsyonu ile. Yıkama sırasında nemlendirilmiş kamara kullanın.
- Çözüm 2 ile 25 ° C sıcaklıkta doku kesitlerinde 4 X 10dk yıkayın.
- 37 15dk için doku bölümleri inkübe ° C Çözüm 2 içeren 0.25μg/mL RNaz.
- 25 doku bölümleri 1 X 10dk yıkayın ° C Çözüm 2 (RNaz olmadan).
- 25 doku bölümleri 1 X 10dk yıkayın ° C, 3 Çözüm 2 X1hr Çözüm 3 ile 60.5 ° C 'de yıkar. 60.5 ° C yıkama sırasında nemlendirilmiş odasına kullanın.
- DIG etiketli riboprobes immünohistokimyasal tespiti için aşağıdaki çözümleri hazırlayın: Doku Engelleme Tampon (TB 1X TBS,% 10 koyun serum,% 1 engelleme reaktif,% 1 BSA,% 0.1 Tween ™ 20, 0.22μm süzülmüş), Antikor Seyreltme Tampon (AD, 1xTBS,% 5 koyun serumu,% 1 engelleme reaktif,% 1 BSA,% 0.1 Tween ™ 20, 0.2mm sodyum azid, 0.22 ™ m süzülmüş) Antikor Absorbsiyon Buffer (AA 1xTBS,% 5 koyun serum, 1 % engelleme reaktif,% 1 BSA, 6mg/mL embriyo tozu) ve TBSTw (1xTBS,% 0.1 Tween ™ 20, 0.2mm sodyum azid, 0.22μm süzülmüş). Bu çözümler, önceden hazırlanmış olabilir. TBSTw 25 ° C'de saklanır, diğer tüm çözümler -20 ° C'de saklanır
- 25 3 X 10 dak ° C TBSTw ile yıkayın.
- En az 25 2saat ° C TB tampon doku bölümleri inkübe edin.
- Dokularda TB tampon kuluçka iken, her bir kuyu için 200μL AA tampon başına 1.1μL anti-DIG antikor ekleyin. Inkübe AA tamponu + antikor en az 4 2saat ° C, daha sonra 1dk için 10.000 rpm'de santrifüj. AA tampon süpernatantı ve AD tampon 2mL ekleyin.
- TB tampon doku bölümleri çıkarın ve nemlendirilmiş bir odasında 4 gecede inkübe ° C antikor içeren AD tampon.
10 Situ Hibridizasyon Gün 3
- Renk geliştirme çözümü NTMT (100 mM Tris-HCL pH 9.5, 100 mM NaCl, 50mm MgCl 2, 0.2mm sodyum azid, 0.22μm süzülmüş) hazırlayın. Bu çözüm, önceden hazırlanmış ve 25 ° C'de saklanabilir Hemen önce, 2mm levamizol eklemek ve% 0.1 Tween ™ 20.
- 4 kuyu ve mağaza çözüm ° C antikor çözeltisi (AD tampon + antikor) çıkarın Iki kez tekrar edilebilir.
- Dokuların 8 X 10 dakika 25 ° C TBSTw ile 2mm levamizol içeren yıkayın.
- TBSTw bulunduğu Petri kabı dikkatlice sepet dokuların aktarmak. Forseps görünür enkaz kaldırmak için kullanın. Dokuların temiz mikrosantrifüj tüpler içine aktarın.
- Dokular 25 1 X 10 dak ° C 1mL NTMT ile yıkayın.
- NTMT çıkarın ve hafif bir koruma kutusu ve inkübe 25% 50 NTMT (2mm levamizol içeren) ve% 50 BM Mor yer tüpleri içeren bir karışımı 1mL/tube ° C ekleyin Renk geliştirme süresini birkaç saat ile birkaç gün arasında değişmektedir. Renk geliştirmek için yavaş ise,% 100 BM Mor kullanılabilir.
- Monitör renk gelişim ve değişim NTMT / BM Mor çözüm çöktürülmüş kristalleri birikir eğer veya sarı ve mor renk değişikliğine uğrar. Tam renkli kalkınma sonra (4-250 saat), yıkama dokuların 25 2 X 5min ° C ile 1mL/tube 2mm levamizol içeren NTMT.
- 4 geceleme dokuların inkübe ° C PBS 1mL/tube% 4 paraformaldehid sonrası fiksatif içeren.
- Çamaşır suyu için dokular, 30 dakika boyunca inkübe dokuların 25 ° C 1mL/tube PBSTw,% 3 H 2 O 2 içeren
- Doku bölümleri, cam slaytlar monte dakika muamele ve bir bileşik mikroskobu ile görüntülenmiş.
11. Temsilcisi Sonuçlar:
Uzamsal yönlendirme agaroz LUT doku doku kesitlerinde uçağın belirler. Sagital bölümler için, mesane en az üçte ikisinin eksize edilir ve kalan LUT doku üretral orta hat agaroz fişi (Şekil 1A) düz bir yüzeye paralel olduğunu agar gömülü. Agaroz fişi düz kenarına pah doku düzlemde küçük ayarlamalar yapılabilir. Bu düzlemde odaklı bir 17.5dpc erkek LUT doku bir temsilci sagital kesiti Şekil 1B gösterilmiştir.
Örnek sepet kaybı ve çok günlük ISH işlemi sırasında biriken toz ve partiküler madde hassas doku bölümleri korur. Örnek sepet 1.5mL mikrofuge'de tüp (Şekil 1C) kesim sonuna kadar polyester mesh eriterek hazırlanmıştır. Küçük bir delik, içine ve dışarı sepetler çözüm akışını kolaylaştırmak için her bir numune sepeti kapağının içine deldi. Örnek sepetleri 24 plaka kapakları (Şekil 1D) 12mm delik delinmiş koyarak ISH çözümler askıya alınır. Modifiye plaka kapakları çözüm değişiklikleri sırasında 24-kuyucuğu arasında transfer sepet destekler.
Bu uzun inkübasyon dönemlerinde düşük bolluk mRNA'ların tespiti için gerekli olan non-spesifik bir arka plan boyama sınırlamak zordur. 0.22μm filtreler aracılığıyla örnek tamponlar 0.2mm ve sodyum azid sonraki filtrasyon yanı sıra, arka plan boyama (Şekil 2) sınırlamak için ortaya çıktı. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, örnekleri uzun bir süre bir süre için (Şekil 3), renk geliştirme çözümü inkübe zaman arka plan boyama görünür farklılıklar görünmüyor.
Şekil 1 bir fare, alt ürogenital (LUT) yolu doku bölümünde ve mikrosantrifüj tüp ISH için bir sepet hazırlanması . Mesane, pelvik üretra ve ilişkili Wolf ve Mϋllerian kanalı kökenli yapısı) bir parçası içeren bir LUT% 4 düşük erime agaroz silindirik bir fiş yerleştirilmiştir. (A) fişi bir örnek montaj diske yapıştırılmış ve (B) titreşimli mikrotom 50μm bölümleri oyulmuş. (C) bir LUT bölümünde tüp kapağı ve eritme polyester mesh tüp kesme alt ucunda bir delik delme tarafından hazırlanan bir mikrosantrifüj tüp sepet içine transfer edilir. (D) mikrosantrifüj tüp doku bölümleri ISH protokol sırasında tampon çözelti askıya alınır, böylece, bir 24-plaka kapağının içine delinmiş 12mm deliklere eklenir. Arrowheads agaroz fiş LUT doku göstermektedir.
Şekil 2 0.22μm süzülmüş çözümler 0.2mm sodyum azid Incorporation, doku kalitesini artırır ve arka plan boyama azaltır . 17.5dpc erkek fare, alt ürogenital yolları (LUT) sagital düzlemde 50μm kalınlığında kesitler alındı. Doku bölümler büküm homolog 1 yöneltilen bir prob kullanarak ISH tarafından boyandı. (A) ISH için kullanılan Tamponlar ya 0.22μm filtrelenmiş ve 0.2mm sodyum azid (Naaz) ile desteklenebilir veya (B) filtrelenmemiş ve Naaz ile desteklenebilir. Ok uçları arka plan boyama göstermektedir. Görüntüler de aynı büyütme düzeyinde ele geçirildi. Sonuçlar n = 3 çöp bağımsız fareler temsilcisi boyanma.
Şekil 3. Arka plan boyama yoğunluğu, uzun süreli bir renk gelişimi ile artış görünmüyor. 17.5dpc erkek fare, alt ürogenital yolları (LUT) sagital düzlemde 50μm kalınlığında kesitler alındı. Bölüm (A) 9.5h (B) 43.5h orta bolluk tanıdığı bir prob kullanarak, yüksek bolluk transkript östrojen-reseptör gama (Esrrg) tanıdığı bir prob kullanarak kromajen boyama çözüm onları kuluçka ISH boyandı transkript bromodomain çinko parmak etki alanına bitişik, 2A (Baz2a), veya (C) düşük bolluk transkript kanatsız-tipi MMTV entegrasyon sitesi aile, üye 10a (Wnt10a) tanıdığı bir prob kullanarak 236h. Görüntüler de aynı büyütme düzeyinde ele geçirildi. Sonuçlar n = 3 çöp bağımsız fareler temsilcisi boyanma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan yöntemi kullanarak, tüm önemli hücre tipleri ve mezenkimal pedleri, ürotelium'un, düz kas, prostat tomurcukları, ejakülasyon kanalı ve vajina da dahil olmak üzere fetal erkek ve dişi fare LUT doku bölmeleri mRNA'ların tespit etmek mümkündür. Bu protokolde kullanılan 50μm bölümler, mimari dokusu (kan damarları gibi) çözmek için yeterli kalınlığa olmanın avantajı var ama yaygın tüm montaj ISH sırasında karşılaşılan metodolojik bir sorundur prob yakalama önlemek için yeterince ince. Her yeni Spastine Özgü Riboprop, boyama yayımlanan bir önceki çalışmada olduğu değerlendirilmiştir pozitif kontrol dokusu değerlendirilir. Biz boyanma bu dokularda belirli olduğundan emin olun. Yöntemin diğer bir avantajı, birden fazla mRNA'ların desen aynı LUT doku komşu doku kesitlerinde değerlendirilir olabilir. Dahası, bu yöntem hücre spesifik protein damgalı görselleştirmek ve ISH protokol ile boyanan hücre tipleri tanımlamak için immünohistokimyasal teknikleri ile birleştiğinde olabilir. Bu yöntem, Hızlı Kırmızı veya hematoksilen ile nükleer counterstaining gibi geleneksel counterstaining yöntemleri ile uyumsuz. Ancak, biz 4 de dahil olmak üzere floresan nükleer lekeler, ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve propidium iyodür ile başarılı bir şekilde zıt örnekleri var.
Burada açıklanan yöntem, daha önce 7 açıklanan üzerinde çeşitli geliştirmeler içerir . Hemen hemen tüm el yazması tamponlar ve reaktif stok çözümleri önceden hazırlanmış ve verimliliğini artırır uzun süre saklanabilir. 0.22μm membranlar vasıtasıyla en reaktifler ve onların filtrasyon 0.2mm sodyum azid yanı sıra, büyük ölçüde, non-spesifik bir arka plan boyama azalır reaktif raf ömrü ve en aza indirir, ISH, prosedür sırasında doku kesitlerinde partiküler madde birikimi artar. Bu makale ayrıca, ISH ve tampon değişiklikleri sırasında sepetler tutan bir modifiye çok iyi kültür plaka kapağı sırasında doku kesitleri içeren geçirgen mikrosantrifüj tüp sepet üretimi açıklar. Biz kolayca laboratuarda üretilen bu cihazlar, örnek kaybını azaltmak, işlem sırasında, doku bölümünde hasarı en aza indirmek ve verimliliği artırmak bulundu. Ayrıca, bir nem odası olarak yapışmalı, plastik kap kullanılması, buharlaşma karşı korunmasına yardımcı olur. Bu sözde 'kenar etkisi' deneysel bir değişken tanıtmak periferik örnek kuyu, doku bölümleri için özellikle önemlidir. Nem odaları kullanırken, periferik karşı iç örnek kuyularda kayda değer boyama kalitesi farklılıklar gözlenmez.
Bu protokol, fare LUT dokularda mRNA desen çalışması için verimli bir mekanizma olmakla birlikte, bu yöntem ile bazı sınırlamalar vardır. MRNA tespiti Verimlilik riboprobes ve mRNA'ların mutlak bolluğu arasında değişir tespit edilemez. Başka bir sınırlama boyanma düzlemini bağlı olarak değişebilir. Bu sınırlamaların en aza indirmek için, birden fazla çöp bağımsız fetusların birden çok bölüm her mRNA desen değerlendirir.
Bu yöntem, diğer fare doku türleri veya diğer türler mRNA ekspresyonu görselleştirmek için optimize edilebilir. Böyle bir değişiklik, mikrotom bıçak genlik ve hız doku kesit sırasında optimize edilmesi ve bu proteinaz K konsantrasyonu ISH prosedürü sırasında optimize edilmesini gerektirir. Ayrıca, ISH tarafından değerlendirilmekte olan doku aynı türe ait embriyo tozu ile anti-digoxigenin antikor önceden emmek için gereklidir. Bölümleri ISH boyama sırasında parçalanır, çünkü bu yöntemi, 40 mikrondan daha ince doku bölümleri için kullanışlı değildir olmasına rağmen, tüm montaj ISH boyama yüksek verimli kullanmak için adapte edilebilir. Biz fetal ve neonatal fare prostat de fetal gonad ve böbrek gibi tüm montaj ISH yapmak için bu yöntem başarıyla kullanmıştır. Bütün montaj ISH boyama, proteinaz K doku sindirim yanı sıra gecede antikor inkübasyon prob yakalama neden arka plan boyama azaltmak için aşağıdaki yıkama miktarı ve süresi optimize etmek için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar doku sepet hazırlanmasında Dr Lan Yi, New Jersey Kanser Enstitüsü, teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeler DK083425 ve DK070219 Enstitüleri tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Group | 11214667001 | |
| Blocking reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Group | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 | |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Group | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Group | 11969064001 | |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model | |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp | 46551 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 | |
| Millicell culture plate insert | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 | |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 | |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase inhibitor | Roche Group | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza Inc. | 50101 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solution | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A | |
| Yeast tRNA | Roche Group | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
