A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

Summary

Qui, descriviamo un throughput efficiente alto

Abstract

Lo sviluppo del basso tratto urogenitale (LUT) è un processo complesso. Questa complessità è evidenziato durante la formazione della prostata dall'uretra del feto maschio, che si basa sui segnali androgeni ed epiteliali-mesenchimali ^1,2 interazioni. Comprensione dei meccanismi molecolari responsabili dello sviluppo della prostata può rivelare i meccanismi di crescita che sono impropriamente risvegliato più tardi nella vita per dare origine a malattie della prostata, come l'iperplasia prostatica benigna e cancro alla prostata.

La LUT via di sviluppo è anatomicamente complessa. Con il tempo prostatica in erba inizia a 16,5 dopo il concepimento giorni (DPC), numerosi tipi di cellule sono presenti. Vasi, nervi e muscolatura liscia soggiornare nel mesenchimali stroma ^3. Questo stroma circonda un epitelio stratificato e dà luogo alla prostata del feto attraverso segnali paracrini recettore androgeno-dipendente ^4. L'identità del stromali recettore androgeno-responsive geni necessari per lo sviluppo della prostata e il meccanismo con cui le forme della prostata dell'epitelio duttale in risposta a questi geni non è del tutto chiaro. La capacità di identificare con precisione i tipi di cellule e localizzare l'espressione di fattori specifici al loro interno è fondamentale per capire meglio lo sviluppo della prostata. Ibridazione in situ (ISH) consente per la localizzazione degli mRNA all'interno di un tessuto. Così, questo metodo può essere utilizzato per identificare modello e tempi di espressione di molecole di segnalazione e dei loro recettori, in modo da chiarire i regolatori della prostata potenziale di sviluppo.

Qui, descriviamo un elevato tecnica ISH throughput per individuare i pattern di espressione di mRNA nella LUT topo fetale mediante vibrazione microtomo taglio sezioni. Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto ad altri protocolli ISH. L'esecuzione di ISH su sezioni sottili aderito a una diapositiva è tecnicamente difficile; criosezioni hanno spesso scarsa qualità strutturali, mentre sia criosezioni e sezioni di paraffina spesso sfociano nella risoluzione del segnale debole. L'esecuzione di ISH su tutta tessuti monte può causare intrappolamento sonda. Al contrario, la nostra tecnica utilizza un throughput elevato spessore taglio sezioni che rivelano l'architettura dettagliata dei tessuti. Tubi microcentrifuga modificato consentire un'agevole manipolazione delle sezioni durante la procedura ISH. Un massimo di 4 trascritti di mRNA può essere schermato da una LUT singolo 17.5dpc fino a 24 trascritti mRNA rilevato in un unico passaggio, riducendo così i costi e massimizzare l'efficienza. Questo metodo permette di gruppi di trattamento più da lavorare in modo identico e come una singola unità, eliminando ogni pregiudizio per l'interpretazione dei dati. La maggior parte pertinente per i ricercatori della prostata, questo metodo fornisce una posizione spaziale e temporale delle trascrizioni abbondanza bassa e alta mRNA nell'uretra topo fetale che dà origine alla rete prostata duttale.

Protocol

1. Sintesi di un Riboprobe digossigenina-11-UTP-etichetta da una PCR-Generated Template

1. Di sintetizzare un gene specifico riboprobe, utilizzare Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) per ottenere il cDNA sequenza di riferimento gene (RefSeq). Utilizzare il programma Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) ⁵ per progettare gene-specifici primers PCR contro il 3'-regione della sequenza cDNA. Parametri raccomandati per la selezione di PCR sono descritte altrove (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
2. Utilizzare il Programma MegaBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) ⁶ per valutare la specificità della sequenza di DNA selezionati. La sequenza di DNA è considerata specifica quando, con un ASPETTATEVI soglia di 0,01, che non si allinea con altre sequenze nel database RefSeq.
3. PCR amplifica il modello riboprobe. Componenti della reazione di PCR e le condizioni di ciclo termico deve essere ottimizzata per ogni set di primer. Una tipica reazione di 50 microlitri contiene: tampone 1X, 2mM MgCl _2, 0.2mm dNTPs, 1X soluzione Q, 1μg cDNA, 2,5 U di Taq DNA polimerasi, primers 0.25μm e nucleasi-free H ₂ O. Un protocollo ciclo termico tipico include una denaturazione iniziale a 94 ° C per 2 minuti seguita da 40 cicli di 94 ° C per 30sec, 57 ° C per 30sec, 72 ° C per 1 min e una estensione finale a 72 ° C per 10 minuti. Il cDNA utilizzati nelle reazioni PCR è sintetizzato da mRNA del mouse urogenitale.
4. Separare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio, purificare utilizzando il kit di estrazione Gel, e quantificare i prodotti purificati mediante spettrofotometria. Il rendimento atteso è di 1,2 - 3.6μg.
5. Trascrivere il prodotto di PCR in un riboprobe etichettati. La reazione di trascrizione (40 microlitri) contiene: 400ng PCR purificato prodotto, 1X gamma di marchi nucleotide contenente digossigenina 11-UTP, 1X buffer di trascrizione, 5U RNasi inibitore, 80U T7 RNA polimerasi, e nucleasi-free H ₂ O. Incubare 3-4 ore a 37 ° C e agitare i campioni ogni 30 minuti.
6. Utilizzare il kit Qiagen RNeasy Mini per purificare riboprobes in base alle istruzioni per la pulizia di RNA con in colonna digestione DNasi. Quantificare riboprobes mediante spettrofotometria. Il rendimento atteso è 4-20 mg. Valutare la qualità della sonda, separando una aliquota mediante elettroforesi su un 1,5% non denaturante su gel di agarosio. Sonde di alta qualità migrare come bande distinte con sbavature minime.
7. Per garantire la riboprobe riconosce specificamente il suo obiettivo, comprende un tessuto di controllo positivo per il primo esperimento ISH. Il modello è riboprobe mRNA bersaglio dovrebbero essere conosciuti in questo tessuto di controllo positivo.

2. Preparazione di vibrante lama microtomo (Basato sul protocollo precedentemente descritto) ⁷

1. Preparare un 4% bassa temperatura di fusione soluzione di agarosio in tampone fosfato (PBS). Microonde soluzione per sciogliere e mantenere una soluzione di agarosio a 62 ° C.
2. Preparare uno stampo ad anello in polistirolo, eliminando la membrana dal diametro di 12 mm piatto cultura Millicell bene inserire e conservare anello di polistirolo da utilizzare come uno stampo agarosio. Immergere gli anelli durante la notte in soluzione inibitore della RNAsi prima di ogni utilizzo.
3. Per garantire una superficie liscia di taglio, rimuovere antiruggine e altri additivi dalla superficie della lama Wilkinson lavando con i seguenti solventi, al 100% di concentrazione: etere di petrolio, xilene, cloroformio, metanolo e acqua MilliQ. Separare la doppia lama della lunghezza in due lame singole.
4. Rispettare le lame Wilkinson a una lama microtomo con adesivo Loctite. La lama microtomo non viene utilizzato per il taglio, ma aggiunge la rigidità alla lama Wilkinson. La lama microtomo deve essere tagliato alla lunghezza della lama Wilkinson usando cesoie metalliche e, una volta aderito, deve essere compensato da 3 - 4 mm dal bordo di taglio della lama Wilkinson.

3. Dissezione, conservazione e preparazione dei tessuti urogenitale per sezionamento

1. Preparare la soluzione PBSTw (PBS contenente 0,1% Tween ™ 20 e 0,2 mm azide di sodio, filtrata attraverso la 0.22μm Stericup ® unità filtro). Soluzione può essere preparata in anticipo e conservato a 25 ° C.
2. Incubare una LUT topo appena sezionato (vescica, uretra pelvica, e associati Wolff e Mϋllerian condotto derivati ​​strutture) notte a 4 ° C in PBS contenente fissativo paraformaldeide 4%.
3. Disidratazione dei tessuti da lavare per 10 minuti a 25 ° C in una serie di metanolo graduata / PBSTw (1:3, 1:1, 3:1 v / v) soluzioni. Conservare i campioni a -20 ° C in 100% di metanolo almeno una notte. Tessuti archiviati possono essere conservati per almeno 2 anni di.
4. Preparare i tessuti per il sezionamento da reidratare i tessuti archiviati. Lavare per 10 minuti a 25 ° C in una serie di metanolo graduata / PBSTw (3:1, 1:1, 1:3 v / v) soluzioni.
5. Analizzare ed eliminare circa due terzi della vescica, lasciando la maggior parte della regione trigono attaccato al uretra.

<p class = "jove_title"> 4. Incorporare tessuto urogenitale in agarosio

1. Posizionare l'anello dello stampo in polistirolo, superficie piana verso il basso, su un vetrino ° 25 C pianura microscopio.
2. Riempire lo stampo ad anello con 62 ° C la soluzione di agarosio e raffreddare per circa 2 minuti.
3. Rimuovere il tessuto LUT da PBSTw e asciugare su un assorbente pulire.
4. Trasferire il tessuto in soluzione agarosio.
5. Usare pinze per orientare il tessuto LUT agarosio in modo che sia sospeso a metà strada tra la parte superiore e inferiore dello stampo ad anello e incubare il tessuto a 4 ° C fino a quando l'agarosio si è solidificato.
6. Se il tessuto affonda completamente durante il processo di solidificazione agarosio, può essere asportato dal agarosio e ri-embedded. Regolare il tempo di raffreddamento del agarosio come necessario durante il processo di riaggregazione.

5. Sezionamento del tessuto urogenitale Con un microtomo vibrante (Basato sul protocollo precedentemente descritto) ⁷

1. Montare la lama rinforzata Wilkinson nel microtomo vibrante e impostare l'angolo della lama a 35 °. Compila bagno deluxe campione di ghiaccio PBS e pacco bagnato intorno alla vasca campione.
2. Togliere il tappo solidificato agarosio dallo stampo ad anello e asciugare la superficie inferiore con un assorbente pulire. Verificare che il tessuto sia orientata correttamente. Orientamento tessuti possono essere regolati utilizzando una lametta per smussare il bordo piatto della spina agarosio.
3. Rispettare la spina agarosio su un campione microtomo vibrante di montaggio del disco con adesivo Loctite come mostrato in fig. 1A.
4. Inserire il disco campione di montaggio nella vibratome.
5. Regolare lo spessore microtomo sezione di 50 micron, la velocità a 2, e l'ampiezza della lama a 4 e iniziare a tagliare sezioni di tessuto.
6. Utilizzare pinze smussato per trasferire ogni sezione di tessuto (Fig. 1B) a un 24-e piastra di coltura che contiene ben ghiacciata PBSTw 0,5 ml.
7. Per preparare i campioni per ibridazione in situ, la maggior parte delle accise agarosio attorno ad ogni sezione di tessuto (il restante agarosio si scioglierà durante la procedura ISH) e rimuovere tutti i detriti associati. Sezioni di memorizzare fino a 48 ore a 4 ° C in PBSTw.

6. Preparazione del campione Basket per l'ibridazione in situ

1. Tagliare il fondo di una provetta in boa 100μL.
2. Riscaldare il bordo di taglio del tubo in una fiamma fino a quando la plastica si ammorbidisce, quindi premere il provetta saldamente al centro di una piazza 0.5in rete di poliestere.
3. Tagliare a rete in eccesso e usare una riscaldata di 18 gauge a trafiggere due fori in ogni coperchio tubo per completare la preparazione basket (Fig. 1C).
4. Togliere il coperchio di una piastra ben 24 e praticare un foro di 12 mm centrato su ogni bene. Utilizzare il coperchio per trasferire cestini campione tra un lavaggio del protocollo ISH (Fig. 1D).

7. Embrione preparazione in polvere per l'ibridazione in situ (Basato sul protocollo precedentemente descritto) ⁸

1. Raccogliere embrione tessuto mouse da topi che sono allo stesso stadio come sezioni di tessuto che vengono valutate e conservare a -80 ° C. Luogo tessuti congelati in un mortaio in ceramica, tessuto immergere in azoto liquido, e utilizzare un pestello per macinare il tessuto in una polvere finissima.
2. Combina polvere embrione con 4 volumi di acetone e omogeneizzare con diversi colpi di un omogeneizzatore dounce.
3. Trasferimento omogenato in un bicchiere 15 ml con tappo a vite fiala ed estrarre la notte a 4 ° C.
4. Embrione polvere pellet mediante centrifugazione a 5000rpm per 10 minuti a 4 ° C. Rimuovere ed eliminare i lipidi contenenti supernatante. Risospendere il precipitato di tessuto in 4vol di acetone fresca ed estrarre per 2 ore a 4 ° C.
5. Pellet la polvere embrione mediante centrifugazione a 5000rpm per 10 minuti a 4 ° C. Rimuovere e scartare il surnatante.
6. Aria secca il pellet in un # 2 carta Whatman filtro. Crush pellet per ottenere una polvere fine e conservare in un flacone di vetro chiuso ermeticamente in 4 ° C. La resa è di circa 50 mg polvere per 1 g di peso embrione bagnato.

8. Day In Situ Hybridization 1

1. Soluzione prehybridization preriscaldamento (50% formammide, 5x SSC, 1% del reagente di blocco, 10μg/mL lievito tRNA, conservare 10μg/mL eparina a -20 ° C) a 60,5 ° C. Questa soluzione può essere preparata in anticipo e conservati a -20 ° C.
2. Preparare una camera umidificata ibridazione compilando un piccolo contenitore di plastica con circa 0,5 di di acqua del rubinetto. Coperchio del contenitore e preriscaldare a 60,5 ° C.
3. Aggiungere 2 ml PBSTw ai pozzetti di una 24-e piastra di coltura. Campione cesti posto nei fori del 24 e coperchio piatto e sezioni di tessuto trasferimento nei cesti (fino a 10 sezioni per cestello sono stati utilizzati).
4. Incubare sezioni di tessuto per 30 min a 25 ° C nel 6% H ₂ O _2. Questa e tutte le successive incubazioni dovrebbero essere effettuate con agitazione su un agitatore orbitale, salvo diversa indicazione. Tutte le incubazioni unod lavaggi sono condotte in 24 pozzetti e utilizzare un volume totale di soluzione 2mL/well.
5. Lavare sezioni di tessuto 4 x 5 minuti a 25 ° C in PBSTw.
6. Incubare sezioni di tessuto per 12min a 25 ° C in PBSTw contenente 5μg/mL proteinasi K.
7. Lavare le sezioni di tessuto 1 x 5 minuti a 25 ° C in PBSTw.
8. Post-fix sezioni di tessuto per 20 minuti a 25 ° C in PBS contenente paraformaldeide 4% e 0,2% glutaraldeide.
9. Lavare sezioni di tessuto 2 x 5 min a 25 ° C in PBSTw.
10. Aggiungere 2mL/well del buffer prehybridization preriscaldata e incubare sezioni di tessuto all'interno della camera di ibridazione umidificato per almeno 1 ora a 60,5 ° C.
11. Aggiungi 0.65μg riboprobe etichettati per il buffer prehybridization in sezioni di tessuto ogni bene e incubare una notte nella camera di ibridazione umidificata a 60,5 ° C.

9. Day In Situ Hybridization 2

1. Preparare le seguenti soluzioni per la post-ibridazione fasi di lavaggio: Soluzione 1 (50% formammide, 5x SSC, 1% SDS), Soluzione 2 (10mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween ™ 20, 0.2mm sodio azide , 0.22μm filtrata), e la soluzione 3 (2x SSC, 50% formammide). Queste soluzioni possono essere preparati in anticipo. Le soluzioni 1 e 3 sono conservati a -20 ° C e Soluzione 2 è conservato a 25 ° C. La durata di conservazione delle soluzioni è di almeno 3 mesi.
2. Lavare sezioni di tessuto 3 X 30 minuti a 60,5 ° C con pre-riscaldato Soluzione 1. Utilizzare la camera umidificata durante i lavaggi.
3. Lavare le sezioni di tessuto 1 x 10 minuti a 60,5 ° C con pre-riscaldato 1/Solution Soluzione 2 (1:1 v / v). Utilizzare la camera umidificata durante il lavaggio.
4. Lavare sezioni di tessuto 4 X 10 minuti a 25 ° C con la soluzione 2.
5. Incubare sezioni di tessuti per 15 minuti a 37 ° C in Soluzione 2 contenente 0.25μg/mL RNAsi.
6. Lavare le sezioni di tessuto 1 x 10 minuti a 25 ° C con la soluzione 2 (senza RNasi).
7. Lavare le sezioni di tessuto 1 x 10 minuti a 25 ° C con la soluzione 3, seguito da 2 X1hr lavaggi a 60,5 ° C con Soluzione 3. Utilizzare la camera umidificata durante i pulsanti ° C 60,5 lavaggi.
8. Preparare le seguenti soluzioni per la rilevazione immunoistochimica del DIG marcato riboprobes: Buffer tessuto di blocco (TB, TBS 1X, 10% di siero di pecora, 1% reagente di blocco, BSA 1%, 0,1% Tween ™ 20, 0.22μm filtrata), diluizione dell'anticorpo Buffer (AD, 1xTBS, 5% di siero di pecora, 1% reagente di blocco, BSA 1%, 0,1% Tween ™ 20, sodio azide 0,2 mm, 0,22 m ™ filtrata) Assorbimento Buffer anticorpi (AA, 1xTBS, 5% di siero di pecora, 1 reagente% blocco, 1% di BSA, polvere embrione 6mg/mL), e TBSTw (1xTBS, 0,1% Tween ™ 20, 0.2mm sodio azide, 0.22μm filtrata). Queste soluzioni possono essere preparati in anticipo. TBSTw è conservato a 25 ° C, tutte le altre soluzioni sono conservati a -20 ° C.
9. Lavare 3 X 10 min a 25 ° C con TBSTw.
10. Incubare le sezioni di tessuto di almeno 2 ore a 25 ° C in tampone TB.
11. Mentre i tessuti sono incubazione in tampone TB, aggiungere 1.1μL anti-DIG anticorpi per buffer 200μL AA per ogni bene. Incubare tampone AA + anticorpi di almeno 2 ore a 4 ° C, quindi centrifugare a 10.000 rpm per 1 min. Rimuovere il surnatante buffer di AA e aggiungerlo a 2 ml di tampone dC.
12. Rimuovere sezioni di tessuto dal buffer TB e incubare per una notte in una camera umidificata a 4 ° C in tampone dC contenenti anticorpi.

10. Day In Situ Hybridization 3

1. Preparare il colore sviluppo di soluzioni NTMT (100mM Tris-HCl pH 9,5, 100mM NaCl, 50mM MgCl _2, 0.2mm azide di sodio, filtrata 0.22μm). Questa soluzione può essere preparata in anticipo e conservato a 25 ° C. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere levamisolo 2mM e lo 0,1% Tween ™ 20.
2. Rimuovere la soluzione di anticorpi (AD anticorpi tampone +) dai pozzetti e la soluzione di conservare a 4 ° C. Può essere riutilizzato fino a due volte.
3. Lavare i tessuti 8 X 10 min a 25 ° C con TBSTw contenenti levamisolo 2mm.
4. Cura il trasferimento tessuti dai cesti di una piastra di Petri contenente TBSTw. Usare pinze per rimuovere i detriti visibili. Trasferire i tessuti in provette da microcentrifuga pulita.
5. Lavare i tessuti 1 X 10 min a 25 ° C con 1 mL NTMT.
6. Rimuovere il NTMT e aggiungere 1mL/tube di una miscela contenente il 50% NTMT (contenente levamisolo 2 mm) e il 50% BM viola, tubi posto in una scatola luminosa protetta e incubare a 25 ° C. I tempi di sviluppo del colore varia da alcune ore a diversi giorni. Se il colore è lenta a svilupparsi, 100% BM Viola può essere utilizzato.
7. Sviluppo monitor a colori e il cambiamento NTMT / BM soluzione Viola se si accumula cristalli precipitati o se subisce cambiamento di colore dal giallo al viola. Dopo lo sviluppo del colore pieno (4-250 ore), i tessuti lavare 2 X 5 minuti a 25 ° C con 1mL/tube di NTMT contenenti levamisolo 2mm.
8. Incubare tessuti notte a 4 ° C in 1mL/tube di PBS contenente 4% paraformaldeide post-fissativo.
9. Candeggina per i tessuti, tessuti incubare per 30 min a 25 ° C in 1mL/tube di PBSTw contenente il 3% H ₂ O ₂
10. Sezioni di tessuto sono montati su vetrini coprioggetto, e ripreso con un microscopio composto.

11. Rappresentante dei risultati:

L'orientamento spaziale del tessuto LUT in agarosio determina il piano delle sezioni di tessuto. Per le sezioni sagittali, almeno i due terzi della vescica viene asportato e il tessuto LUT rimanente è incorporato in agar in modo che la linea mediana uretrale è parallela alla superficie piana della spina agarosio (Figura 1A). Piccole modifiche nel piano tessuto può essere effettuato con smusso il bordo piatto della spina agarosio. Una sezione sagittale rappresentante da un tessuto 17.5dpc LUT maschile, che è orientata in questo piano è mostrata in Figura 1B.

Cestini campione proteggere le sezioni di tessuto delicato dalla perdita e l'accumulo di materia e particelle di polvere durante la più giorni procedura ISH. Cestini campione sono preparati dallo scioglimento rete di poliestere alla fine taglio di una provetta per microcentrifuga 1,5 ml (Figura 1C). Un piccolo foro è perforato nel coperchio di ogni campione di basket per facilitare il flusso soluzione dentro e fuori i cestelli. Cestini campione sono sospesi in soluzioni ISH mettendoli in fori praticati in 12 millimetri e 24-coperchi piastra (Figura 1D). I coperchi piastra modificato supporto cesti, quando sono trasferiti tra 24-pozzetti durante i cambi di soluzione.

E 'difficile da limitare colorazione aspecifica di fondo durante i periodi di incubazione lunghi necessari per il rilevamento di mRNA poco abbondanti. L'aggiunta di sodio azide 0,2 mm per i buffer dei campioni e la loro successiva filtrazione attraverso filtri 0.22μm apparso per limitare la colorazione di fondo (Figura 2). Utilizzando il metodo descritto qui, non sembra essere differenze visibili nella colorazione di fondo quando i campioni sono incubati in soluzione colore di sviluppo per un periodi di tempo prolungato (Figura 3).

Figura 1. Preparazione di un topo inferiore urogenitale (LUT) sezione di tessuto del tratto e provetta un cestino per ISH. Una LUT contenente parte della uretra vescica, pelvi e associati Wolff e Mϋllerian condotto derivati ​​struttura) è incorporato in una spina cilindrica del 4% bassa temperatura di fusione agarosio. (A) La spina è incollato su un disco campione di montaggio e (B), tagliato in sezioni 50 micron con un microtomo vibrante. (C) Una sezione LUT viene trasferito in un cesto provetta che viene preparato da penetrante un buco nel tappo e tubo in poliestere fusione alla fine taglio fondo della provetta. (D) La provetta viene inserita in fori praticati 12 millimetri in un 24-e coperchio piatto in modo che le sezioni di tessuto sono sospese in una soluzione tampone durante il protocollo ISH. Frecce indicano il tessuto LUT nella spina agarosio.

Figura 2. Incorporazione di sodio azide 0,2 mm in 0.22μm soluzioni filtrate migliora la qualità dei tessuti e riduce la colorazione di fondo. 17.5dpc tratti topo maschio inferiore urogenitale (LUT) sono stati sezionati in un piano sagittale ad uno spessore di 50 micron. Sezioni di tessuto sono state colorate da ISH utilizzando una sonda diretta contro omologo torsione 1. Buffer utilizzati per ISH erano o (A) 0.22μm filtrato e completato con sodio azide 0,2 mm (Naaz) o (B) integrato non filtrata e non con Naaz. Frecce indicano la colorazione di fondo. Le immagini sono state catturate allo stesso ingrandimento. I risultati sono rappresentativi modelli di marcatura per n = 3 cucciolata indipendente topi.

Figura 3. Intensità di colorazione di fondo non sembra aumentare con lo sviluppo del colore prolungato. 17.5dpc tratti topo maschio inferiore urogenitale (LUT) sono stati sezionati in un piano sagittale ad uno spessore di 50 micron. Le sezioni sono state colorate da ISH incubando nella soluzione colorante cromogeno per (A) 9.5h utilizzando una sonda che riconosce la trascrizione ad alta abbondanza estrogeno-correlati receptor gamma (Esrrg), (B) per 43.5h utilizzando una sonda che riconosce l'abbondanza media bromodomain trascrizione adiacente al dominio zinc finger, 2A (Baz2a), o (C) per 236h utilizza una sonda che riconosce il basso trascrizione abbondanza senza ali di tipo MMTV famiglia integrazione sito, membro 10 bis (Wnt10a). Le immagini sono state catturate allo stesso ingrandimento. I risultati sono rappresentativi modelli di marcatura per n = 3 cucciolata indipendente topi.

Discussion

Utilizzando il metodo descritto qui, è possibile rilevare mRNA in tutti i tipi di cellule importanti e compartimenti delle LUT fetale topo maschio e femmina anche le pastiglie mesenchimali, urotelio, muscolo liscio, germogli della prostata, del dotto eiaculatorio, e la vagina. Le sezioni di 50 micron utilizzati in questo protocollo hanno il vantaggio di essere abbastanza spessa per risolvere architettura dei tessuti (come i vasi sanguigni), ma sono abbastanza sottili per evitare di cattura della sonda, che è un problema metodologico comunemente incontrati durante tutto il montaggio ISH. Ogni riboprobe nuovo viene valutato in tessuto di controllo positivo, in cui colorazione è stata valutata in uno studio precedente pubblicato. Ci assicuriamo che i modelli di colorazione sono specifici in questi tessuti. Un altro vantaggio del nostro metodo è che i modelli di mRNA multipli può essere valutata in sezioni di tessuto adiacente dal tessuto LUT stesso. Inoltre, questo metodo può essere accoppiato con tecniche immunoistochimiche per visualizzare marcatori proteici specifici cellulare e identificare i tipi di cellula colorata dal protocollo ISH. Questo metodo non è compatibile con i metodi tradizionali di contrasto, come di contrasto nucleare con ematossilina o Fast Red. Tuttavia, abbiamo campioni successo di contrasto con macchie fluorescenti nucleare, di cui 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e ioduro di propidio.

Il metodo descritto qui include diversi miglioramenti rispetto quella che è stata descritta in precedenza ^7. Quasi tutti i tamponi e le soluzioni magazzino reagenti nel manoscritto corrente vengono preparati in anticipo e può essere conservato per lunghi periodi di tempo, che aumenta l'efficienza. L'aggiunta di sodio azide 0,2 mm per la maggior parte dei reagenti e la loro filtrazione attraverso membrane 0.22μm diminuisce notevolmente non specifica colorazione di fondo, aumenta reagente shelf-life, e minimizza l'accumulo di particolato sulle sezioni di tessuto durante la procedura ISH. Questo manoscritto descrive anche la produzione di cesti permeabile provetta che contengono sezioni di tessuto durante ISH e modificato a più coperchio e piastra di coltura che contiene i canestri durante i cambi di buffer. Abbiamo scoperto che questi dispositivi, che sono facilmente prodotte in laboratorio, ridurre la perdita di campione, minimizzare i danni ai tessuti sezione durante la lavorazione, e migliorare l'efficienza. Inoltre, l'uso di un contenitore richiudibile in plastica, come una camera umida aiuta a proteggere contro l'evaporazione. Questo è particolarmente importante per sezioni di tessuto in pozzi campione periferiche, dove il cosiddetto 'effetto bordo' possibile introdurre una variabile sperimentale. Durante l'utilizzo di camere di umidità, non abbiamo osservato differenze apprezzabili colorazione di qualità in pozzi campione periferici contro interiore.

Anche se questo protocollo è un meccanismo efficiente per studiare gli schemi di espressione di mRNA nel topo tessuti LUT, ci sono alcune limitazioni con questo metodo. L'efficienza di rilevazione di mRNA varia tra riboprobes e abbondanza assoluta delle mRNA non può essere determinato. Un'altra limitazione è che i modelli di colorazione può variare a seconda del piano di sezione. Per ridurre al minimo queste limitazioni, valutiamo ogni modello mRNA in più sezioni da più cucciolata indipendente feti.

Questo metodo può essere ottimizzato per la visualizzazione di pattern di espressione di mRNA in altri tipi di tessuto del mouse o altre specie. Tale modifica richiede che l'ampiezza e la velocità della lama del microtomo essere ottimizzata durante il sezionamento dei tessuti, e la concentrazione proteinasi K essere ottimizzata durante la procedura ISH. Inoltre, è necessario pre-assorbire l'anticorpo anti-digossigenina con la polvere embrione della stessa specie di tessuto che è in corso di valutazione da ISH. Anche se questo metodo non è utile per le sezioni di tessuto più sottili di 40 micron, perché le sezioni si disintegrano durante la colorazione ISH, può essere adattato per l'uso in high-throughput intero montaggio colorazione ISH. Abbiamo usato questo metodo per condurre con successo tutto il montaggio ISH sulla prostata del mouse fetale e neonatale e gonade fetale e del rene. Per tutto il montaggio colorazione ISH, è necessario ottimizzare la digestione dei tessuti proteinasi K così come la quantità e la durata di lavaggi seguenti notte di incubazione degli anticorpi per ridurre la colorazione di fondo causato dalla cattura della sonda.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments	Roche Group	11214667001
Blocking reagent	Roche Group	11096176001
BM Purple AP substrate, precipitating	Roche Group	11442074001
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Cell culture plate, 24 well	Corning	3524
Digoxigenin 11-UTP	Roche Group	1277073910
dNTPs	Roche Group	11969064001
Double-edged razor blade	Wilkinson Sword	Classic Model
Eliminase RNase remover	Decon Laboratories	1102
Formamide	Sigma-Aldrich	F5786-1L
Gel extraction kit	Qiagen	28704
Glutaraldehyde, 25% solution in H2O	Sigma-Aldrich	G6257-100ML
Heparin, sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393
Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O	Fisher Scientific	BP2633-500
Levamisole	Sigma-Aldrich	L9756
Loctite 404 quick set instant adhesive	Henkel Corp	46551
Magnesium chloride	Fisher Scientific	M33-500
Maleic acid	Sigma-Aldrich	M0375-500G
Microcentrifuge tubes, 1.5mL	Biologix Research Company	BP337-100
Millicell culture plate insert	EMD Millipore	PICM01250
Molecular grinding resin	G-Biosciences	786-138PR
Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline	Affymetrix	19943
Phosphate buffered saline, without Ca & Mg	MP Biomedicals	ICN1760420
Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24"	Small Parts, Inc.	CMY-0033-D
Proteinase K solution, 20mg/ml	Amresco	E195-5ML
QIAshredder Columns	Qiagen	79654
Q solution	Qiagen	Provided with Taq DNA polymerase
RNase	Sigma-Aldrich	R6513
RNase inhibitor	Roche Group	03335399001
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
RNEASY mini kit	Qiagen	74104
RQ1 RNase-free DNase	Promega Corp.	M6101
SeaPlaque low-melt agarose	Lonza Inc.	50101
Sheep serum	Sigma-Aldrich	S2263-500mL
Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL	EMD Millipore	SCGPU05RE
Sodium azide, granular	Fisher Scientific	S227I-100
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	S529-500
SSC, 20X solution	Research Products International Corp.	S24022-4000.0
SuperScript III first-strand synthesis system	Invitrogen	18080-051
T7 RNA polymerase	Roche Group	10881767001
Taq DNA polymerase	Qiagen	201203
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Vibrating microtome with deluxe specimen bath	Leica Microsystems	VT1000A
Yeast tRNA	Roche Group	109495