Summary
Den Morris Water Maze är en beteendemässig uppgift att testa hippocampus-beroende inlärning och minne. Det har i stor utsträckning används i studien för neurobiologi, neurofarmakologi och störningar neurokognitiva i gnagarmodeller.
Abstract
Den Morris Water Maze (MWM) först fastställts av neuroforskare Richard G Morris år 1981 för att testa hippocampus-beroende lärande, inklusive förvärv av rumslig memoryand långsiktig fysisk minne 1. Den MWM är en relativt enkel procedur i typfallet bestod av sex dagars försök, den största fördelen är den skillnad mellan den rumsliga (dolda plattformar) och icke-spatial (synliga plattform) villkor 2-4. Dessutom minskar MWM testmiljön störningar lukt spår 5. Detta har lett till uppgift att användas mycket i studiet av den neurobiologi och neurofarmakologi av rumsliga inlärning och minne. Den MWM spelar en viktig roll i valideringen av musmodeller för neurokognitiva sjukdomar som Alzheimers sjukdom 6, 7. I detta protokoll diskuterade vi den typiska förfarandet för MWM för testning inlärning och minne och analys av data som ofta används vid Alzheimers sjukdom transgena modell möss.
Protocol
1. Förberedelser
- Förberedelse av utrustning
- Skaffa en rund bassäng med en diameter på 150 cm och ett djup av 50 cm (Fig. 1). Om du använder svart möss bör en vit pool användas, om du använder vita möss, bör en svart pool användas.
- Ordna rummet så att djuret testas inte kan se försöksledaren under testningen. Detta kan göras med gardiner eller rumsavdelare.
- Placera hög kontrast ledljud om rummet, och / eller på insidan av poolen på en plats som skulle vara ovanför vattenytan.
- Placera en plattform 10 cm diameter i poolen - vit för en vit pool, klar plexiglas för en svart pool. Fyll poolen med vatten tills plattformen är 1 cm ovanför vattenytan. Låt vattnet rumstemperatur (22 ° C). Beroende på vattentemperaturen detta kan ta en till tre dagar, alternativt hett vatten kan tillsättas för att skynda på jämvikt.
- Programvara preparatet
- Kalibrera poolen i mjukvara så att kameran kan skapa fysiska avståndet information från pixel-baserad information. Dela upp poolen i 4 kvadranter. Ange plattformen zonen som en variabel zon som kan förändras med varje försök. Skapa fem plattform subzones - en i varje kvadrant, och en i mitten av poolen. Spara kalibreringen och använda den för den återstående testdagar. (Se t.ex. figur. 2).
- Ställ in den maximala försökstiden som 60 sek. Om musen hittar plattformen före denna tid, programmera program för att stoppa rättegången när plattformen hittas.
- Ange programmet för att börja spåra automatiskt när försöksledaren lämnar testning området. Utnyttja alla "reflektion minimering" alternativ din programvara paket tillhandahåller.
- Spår längd, fly latens, och tid i varje kvadrant.
2. Dag 1: Synliga Plattform
- Datorprogram
- Ladda poolen kalibreringen i spårningsprogram.
- Skapa fem försök, med en internationell rättegång intervall är lämpligt för experimentet. Programmera plattformen plats och börjar riktning skiljer sig åt med varje prövning. Se tabell 1 för ett exempel protokoll.
- Testproceduren
- Överför möss från sin anläggning till beteendet rummet. Håll mössen i ett område där de inte kan se poolen eller ledljud. Låt dem anpassa sig till den nya miljön i minst 30 minuter innan test.
- Placera en flagga på plattformen för att öka dess synlighet.
- Till att börja testa att lyfta musen från buren genom svansroten. Stöd musen när du tar med den till testområdet. Lyft musen genom svansroten försiktigt placera musen i vattnet, mot bassängkanten. Snabbt lämna tester området.
- Om musen hittar plattformen innan 60 sek cut-off, låt musen för att stanna på perrongen i 5 sekunder sedan tillbaka till sitt hem bur. Om musen inte hittar den plattform, placera musen på plattformen och låt det stanna där i 20 sekunder innan han återvände till sitt hem bur.
- Upprepa för alla möss i leden. Börja varje efterföljande försök med en annan plattform plats och börjar riktning, eftersom du har programmerats i din programvara.
- Vid provning är klar tillbaka möss till sina bostäder anläggning. Möss torkas av och normothermia garanteras innan du returnerar för djurs anläggning.
- Som en förberedelse för nästa dag, ta bort flaggan från plattformen och lägga till ytterligare vatten till poolen för att dränka plattformen till 1 cm under ytan.
3. Dag 2-5: Hidden Plattform
- Datorprogram
- Ladda poolen kalibreringen i spårningsprogram.
- Skapa fem försök, med en internationell rättegång intervall är lämpligt för experimentet. Programmera plattformen plats att stanna kvar i samma position i alla prövningar och dagar, men har börjar riktning skiljer sig varje försök, varje dag.
- Testproceduren
- För svarta möss, lägg giftfri, vit, pulveriserad tempera färg till poolen och blanda väl. Använd tillräckligt med färg så att nedsänkt plattform är inte synliga från vattenytan. För vita möss, bör en svart bassäng med klart vatten och en klar plexiglas plattform användas.
- Följ steg 2.2.3 till 2.2.6.
4. Dag 6: Probe Trial
- Datorprogram
- Ladda poolen kalibreringen i spårningsprogram.
- Skapa en studie med ingen plattform zon, och en start riktning. Utgångspunkten riktning längst bort från plattformen kvadranten används dag 2-5 föredra. Ställ leden längd till 60 sek.
- Testproceduren
- Avlägsna plattformen från poolen.
- Följ steg 2.2.3 till 2.2.6.
5. Dataanalys
- För varje dag och varje mus, i genomsnitt 5 försök att ge en enda våglängd och fly latens för varje försöksperson. Beräkna den kombinerade felet på lämpligt sätt. För dag 6, helt enkelt samla ljuspassagelängden fly latens, och tid i plattformen kvadrant för varje mus.
- Om några skillnader finns mellan grupper på dag 1, är det sannolikt ett problem med visioner i stället för inlärning och minne. Bara fortsätta med analys om inga skillnader ses på dag 1.
- Jämför inlärningskurvor för Days 2-5 med hjälp av statistik lämpliga för din datauppsättning. En brantare kurva innebär snabbare uppgift förvärv, en grundare kurvan representerar ett underskott i uppgift förvärvet. Uppgifterna från dag 2 till dag 5 analyseras med ANOWA.
- För dag 6, jämföra procent av tiden tillbringas i tidigare lärt plattformen kvadranten, med hjälp av statistik lämpligt för din datauppsättning. En högre andel av tiden tillbringas i plattformen kvadranten tolkas som en högre nivå av minne lagring.
6. Representativa resultat
Vi har använt Morris provvattnet Maze undersöka hypoxi effekt på AD patogenes (7) och valproinsyra (VPA) s läkemedels potential för AD behandling (6) i transgena möss AD modell. Figur 3 är representativt resultat vi rapporterade i vår studie på VPA: s effekt på minnet underskott i APP23 AD musmodell (6). På dag 1 (synlig plattform studier), är det ingen skillnad mellan behandlade VPA och kontrollgrupp i latens (Fig. 3A) och våglängd (Fig. 3A) visar att båda grupperna har liknande motor och visuell kapacitet. Från detta antar vi att möss kan se det flaggas-plattformen och signaler i omgivningen, och kan simma acceptabelt. För dagar 2-5 (dag 1 till 4 av dolda plattformen studier) Exemplet visar en skillnad i flykten latens (Fig. 3C) och våglängd (Fig. 3D) mellan grupperna, vilket tyder på att VPA behandlade möss presterade signifikant bättre än kontrollerna över tiden. Sonden Leden resultat på den sista dagen (dag 6) visar att antalet gånger de möss färdades i den tredje kvadranten, där den dolda plattformen tidigare var placerad, var signifikant större med VPA behandling jämfört med kontroll (Fig. 3E). Dessa data visar att VPA behandling signifikant förbättrar minnet underskotten ses i APP23 möss.
Figur 1. Installation av utrustningen för Morris Water Maze synliga plattform testdagen. Poolen är avskärmad från försöksledaren använda rumsavdelare. Ledljud finns på väggarna, och kanske placeras på insidan av poolen, ovanför vattenytan, om så önskas. Poolen är fylld med klart vatten, med plattformen ligger 1 cm ovanför ytan. En flagga har placerats på plattformen för att öka synligheten.
Figur 2. Screen Capture från All-Maze ™ Video Tracking System visar poolen kalibrering. Poolen är sett från ovan genom en svartvit analog spårning kamera med en RTV24 Digitizer. Flera zoner definieras i mjukvaran och den totala poolen är indelad i fyra kvadranter. En femte, plattform zon som trädde kan variera mellan olika studier, med fem möjliga platser: NW, NE, SW, SE, eller Center. En kalibrering linje (kryssat linje tvärs över mitten) läggs till att programvaran för att konvertera pixel avstånd till fysiska avstånd.
Figur 3. Representativa resultat för Morris Water Maze. Den 7-månaders APP23 transgena möss bär mänskliga svenska muterade APP genen testades efter en månad av daglig VPA (n = 30 möss) eller fordon lösning (n = 30 möss) injektioner. (A) under den första dagen av synliga plattform tester uppvisade VPA behandlade och kontroll APP23 möss en liknande fördröjning för att fly ut på synliga plattformen. P> 0,05 av Students t-test. (B) VPA-behandlade och kontroll APP23 möss hade liknande simma sträckor innan de flyr ut på synliga plattform i den synliga plattformen testet. P> 0,05 av Students t-test. (C) i dolda plattform tester behandlas VPA APP23 möss visade en kortare latens att fly på de dolda plattformen på 3: e och 4: e dagen, P <0,001 av ANOVA. (D) VPA-behandlade APP23 möss hade en kortare simma längd innan fly på dolda plattformen på 3: e och 4: e dagen, P <0,01 med ANOVA. (E) I sonden studie på 6: e dagen reste VPA-behandlade APP23 möss i den tredje kvadranten, där den dolda plattformen tidigare var placerad, betydligt fler gånger än kontroller. * P <; 0,005 av Students t-test. (Anpassad och omtryckt från The Journal of Experimental Medicine 205, 2781-2789, 2008, Rockefeller University Press, ursprungligen publicerad i J. Exp Med doi:... 10.1084/jem.20081588) (6).
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | ||
| Plattform plats | Starta Riktning | Plattform Plats: SW startplatsen enligt följande: | Inga plattform. | ||||
| Trial 1 | SW | S | W | N | N | E | N |
| Trial 2 | NV | N | S | W | E | S | |
| Trial 3 | NE | S | N | E | W | W | |
| Trial 4 | Center | E | E | W | S | E | |
| Trial 5 | SE | W | S | S | N | N | |
Tabell 1. Exempel water maze protokoll *
* Lägg märke till hur både plattformen position och börjar riktning ändra på dag 1, medan dag 2-5 plattformen ställning förblir konstant medan start riktning ändras. På dag 6, det finns ingen plattform och en enda rättegång. Utgångspunkten riktningen för dag 6 är längst bort från den tidigare plattformen plats (SW) så att mössen måste färdas en bit innan den tidigare lärt plattformen kvadranten.
Discussion
Ålder, kön, art och skillnader stam påverkan MWM prestanda (8). Studier visar att äldre möss har dålig prestanda i MWM, medan manliga gnagare presterar bättre än kvinnor, dessutom, är flytande mer uttalad hos möss än råttor (9, 10). Därför bör dessa delar kan likställas i alla tester. Bevis tyder också på att betonas djuren utför mer dåligt i MWM (11), vilket miljöfaktorer som kan orsaka stress, såsom temperatur, ljus och buller bör övervakas och hålls konstant under hela uppgiften.
Disclosures
Alla experiment utfördes i enlighet med University of British Columbia Djurvård och användning kommitté och riktlinjer CIHR.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR), den Townsend familjen, och Jack Brown och Familj Alzheimers Research Foundation (till WAS). WS är innehavaren av Kanada forskning ordförande i Alzheimers sjukdom. PL fick stöd av en NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship doktorsavhandling Award och en Michael Smith Stiftelsen för hälsoforskning Senior Graduate utbildningsbidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnyMaze Video Tracking System | Stoelting Co. | ||
| Tempera Paint | Reeves Poole Groups | White, powdered |
References
- Morris, R. G. M. Spatial localization does not require the presence of local cues. Learning and Motivation. 12, 239-260 (1981).
- O'Keefe, J. A review of the hippocampal place cells. Prog Neurobiol. 13, 419-439 (1979).
- Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20, 11-21 (1957).
- Eichenbaum, H., Stewart, C., Morris, R. G. Hippocampal representation in place learning. J Neurosci. 10, 3531-3542 (1990).
- Block, F. Global ischemia and behavioural deficits. Progress in Neurobiology. 58, 279-295 (1999).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. , 18727-18732 (2006).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60-90 (2001).
- Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. The use of the Morris Water Maze in the study of memory and learning. Int J Neurosci. 48, 29-69 (1989).
- Lipp, H. P., Wolfer, D. P. Genetically modified mice and cognition. Curr Opin Neurobiol. 8, 272-280 (1998).
- Sandi, C. The role and mechanisms of action of glucocorticoid involvement in memory storage. Neural Plast. 6, 41-52 (1998).
