Summary
无试剂，“E - DNA”的传感器，电化学传感器表现良好，即使在血液和其他复杂的矩阵直接挑战时，已适应了广泛的核酸，蛋白质和小分子分析物的检测。在这里，我们介绍了这种传感器的制造和使用的一般程序。
Abstract
医药是目前实行的，医生送标本到中心实验室进行测试，因此必须等待数小时或数天来收到的结果。快速，床头的测试，许多病人将得到更好的服务。为此，我们的实验室和其他人开发的一种多功能，无试剂生物传感器的平台，可支持定量，无试剂，核酸（DNA和RNA），蛋白质（包括抗体）和小分子直接在未处理的临床及环境样品的分析物的电化学检测。在这段视频中，我们展示了在这个“E - DNA”类的几种生物传感器的制备和使用。特别是，我们制造和展示在聚合酶链反应混合物中，艾滋病毒特异性抗体和毒品可卡因的目标DNA序列的检测传感器。准备过程只需要三个小时孵育过夜的努力，其使用只需要几分钟。
Protocol
1。设置舞台
- 购买一个自定义的寡核苷酸的合成，如Biosearch科技（诺瓦托，CA）或美联认证（德克萨斯州米德兰，）公司的相关性，化学修饰的探针DNA。在其3' -末端的另外一个C6巯基，并在其5' -末端氧化还原活性的亚甲基蓝的探针合成过程中被修改。
- 探针DNA溶解在磷酸缓冲液pH值7.4至200微米的浓度，并确认其浓度用分光光度计在260 nm处测量其吸光度。由于亚甲基蓝基团的DNA探针上的解决方案应该有一个可见的蓝色色调。
- 刚准备1毫升蒸馏水，去离子水（DI水）的三（2 - 羧乙基）膦TCEP 10毫米的解决方案。根据我们的经验，这些TCEP解决方案仍然在黑暗中保存在4 ° C时的一个星期的新鲜
- 为了减少任何可能探针DNA溶液中的二硫键，结合2μL的TCEP溶液1μL的探针DNA原液，用移液器轻轻混匀。孵育1小时在黑暗，冷藏集装箱的混合物。最初蓝色的解决方案应该成为TCEP可逆降低亚甲蓝。如果解决方案不很清楚，重复使用一个新鲜的TCEP解决方案的过程，或者可能的话，在室温下。
- 一小时后，稀释1缓冲液的减少DNA探针解决方案，这将削弱它的200nm的浓度。后来，你会孵化金盘电极在200μL这种稀释探头解决方案部分。
- 刚准备至少2毫升2MM mercaptohexanol磷酸盐缓冲液。
2。传感器的制备
- 结合0.05微米的精细抛光布水氧化铝粉末。金盘电极（CH仪器，美国德克萨斯州奥斯汀）波兰坚决按金表面到湿布，并在数字移动8约3分钟每电极的格局。
- DI水冲洗打磨电极浸入到洋溢着相同的Eppendorf管。超声五分钟，以除去残留的氧化铝粉。
- 放入一个0.5 M的硫酸溶液中的电极，将它们连接到一个电位随着铂金柜台和银/氯化银参比电极，并运行一系列的伏安氧化，减少和电化学清洁其表面。在此之后执行第二个的0.01 M氯化钾在0.1 M硫酸溶液中的电化学清洗。这些清洗程序的细节，可以发现在我们的本性协议文件 1，在这个视频的补充。
- 安排2毫升的Eppendorf管，在一个机架，并填写每个探针DNA溶液200μL。在此解决方案的探针DNA的浓度将定义与探针DNA的包上的传感器的表面密度。传感器的性能很大程度上取决于探针密度，从一个传感器架构下的最优变密度。因此，应在此步骤中使用的探针浓度优化每个新型传感器 2 。探头我们调查的架构，我们采用探针DNA的浓度在这一步的范围从15纳米到2微米，与200纳米，是一个典型的价值。
- 金盘电极与离子水冲洗，然后一小时，他们沉浸在有关的探头在Eppendorf管中的DNA溶液。此时，探针DNA会附着在金电极表面通过一个巯基金自组装单分子膜的形成。
- 离子水冲洗电极，沉浸在2MM mercaptohexanol在Eppendorf管中，并存储在3小时黑暗的地方，在室温下过夜，以确保完整的自组装单分子膜的形成。这一步采用混合单层的一部分mercaptohexanol，以确保形成一个稳定的单层的。你可能想Eppendorf管中，用封口膜密封电极，以防止蒸发。传感器可以储存数天，如有必要，在此解决方案。
- 当您准备使用的传感器，DI水冲洗，至少10分钟，然后浸泡在缓冲。旨在抗体检测的传感器，还必须在100纳米的有关承认链解决方案之前使用，其次是一个非常快速用缓冲液冲洗，浸泡。
3。传感器检测，DNA检测
- 在这个协议中，17个核苷酸探针链是贴金电极。它有一个亚甲基蓝在其3' -末端的氧化还原记者（图1）。当探针分子杂交捕获链，通过传感器电路中的电流减小。
- 一个新的传感器与离子水冲洗，沉浸在一片空白样本缺乏目标，以记录它产生的背景信号。将传感器的电位电极导线。放置一个铂电极和一个到溶液中的银/氯化银参比电极。
- 运行幅度为25 mV和一个1mV的步长从0到-0.6 V方波测量。最佳的方波的频率将取决于探头架构的细节 2,3;探头架构，我们聘请的最优值通常是在距离60到600赫兹。您应该看到一个圆润峰值约为-0.35 V时，亚甲蓝的氧化还原电位（峰电位可能会改变您的测试解决方案的精确的pH值略有不同）。这个峰值电流从基线的高度是成正比的效率之间的亚甲基蓝和金电极（图2）电子转移。保存此背景下测量。
- 一个解决方案，包含利益的目标DNA分子的电极移动，平衡（5至120分钟的规模，结构和target4，5浓度而定），并收集了第二个方波voltammagram。在-0.35 V峰值的高度将发生变化，从最初的背景测量。这种变化的幅度与分析物的浓度。这是该传感器的主要输出数据（图3）。
- 测量相对信号的变化，这一比例减少或增加信号的背景峰相对，往往更比电流测量的绝对变化重现性，在电极表面面积的变化纠正。要做到这一点，峰值电流和背景峰值电流之间的差异分为背景峰值电流。
4。传感器再生
- 一旦测量完成后，移动到30秒充满离子水的容器传感器，或喷用DI水源源不断为30秒。用新鲜去离子水的重复这两个次以上。注：一些分析物有抗药性的这种方法，他们试图在6 M盐酸胍或70％的乙醇冲洗进取。
- 把传感器将测量到一个解决方案。一分钟内，峰的高度应该返回到其原始值。这是值得注意的，这些传感器通常表现出他们的第一个测试和再生循环过程中稍大的信号变化，并在随后的 6个周期高度一致的结果。
5。传感器检测，抗体检测
- 在这个协议中，这些传感器中使用的亚甲基蓝和巯基修饰的DNA探针作为一个“ 锚 ”链7。它是直接连接到金电极。这是第二个，“承认”的DNA链，已共价键结合的相关抗原（图4）杂交。我们有好运气，与商业合成房子，如Biosearch技术和帕纳锦社，所需要的DNA抗原嵌合体的合成。杂交步骤进行，转移到一个预制的Eppendorf管含1小时100纳米的有关识别DNA链在PBS的传感器。
- 将有关的空白溶液中的传感器。附加电位电极导线放置一个铂电极和银/氯化银参比电极的解决方案。
- 如上所述，执行方波伏安法。为特定的探头架构，我们采用最佳的方波的频率是60赫兹。您应该看到一个圆形的高峰围绕-0.35五，保存这样的背景下测量。
- 含有目标分析物的电极传送到一个解决方案，培育5至60分钟，并收集了第二个方波voltammagram。如果目标抗体是目前在-0.35 V的峰值将有所下降。这种变化的幅度是相关的抗体浓度。
6。传感器测试，小分子检测
- 在这种情况下，传感器的表面上的探针分子是适体，DNA或RNA分子，已在体外选择绑定一个特定的分子分析物，改变其结构（折叠）结合后其目标分析8,9（图5）。在这里，我们聘请可卡因结合，DNA Stojanovic 10,11实验室开发的适体。
- 一个新的传感器与离子水冲洗，沉浸在一个空白样本缺乏目标，以记录它产生的背景信号。将传感器的电位电极导线。将铂金计数器和一个银/氯化银参考到该解决方案。
- 如上所述，执行方波伏安法。为特定的探头架构，我们已在这里雇用的最佳方波的频率是200HZ（但是，60赫兹工程）。您应该看到一个圆形的高峰围绕-0.35五，保存这样的背景下测量。
- 含有目标分析物的电极传送到一个解决方案，孵化〜5分钟，并收集了第二个方波voltammagram。在-0.35 V的峰值高度会发生变化。这种变化的幅度与目标分析物的浓度。如果你不能获得可卡因样品，普鲁卡因，使用的是不受管制的的，可以作为替代品使用。
7。代表性的成果：
当使用的架构，用来检测DNA，信号应至少减少60％时，在200 nm目标的平衡。三个简短的去离子水冲洗后，应返回的信号非常接近（0.1-5％内）到其原始值。应该接受抗体检测传感器的信号减少40％至80％。基于核酸适体传感器检测可卡因展览以200％的信号增加他们的频率和表面覆盖而定。可卡因传感器，低表面覆盖是最好的3。
图1。电化学DNA生物传感器的DNA检测。
图2的屏幕截图显示在方波伏安法的E - DNA生物传感器产生的信号。
图3的屏幕截图显示在方波伏安法的E - DNA生物传感器产生的信号，分析物杂交前后。
图4。脚手架传感器抗体的检测。
图5。可卡因或普鲁卡因与电化学适体生物传感器检测。
| 自定义的Oligo | 序列 | 评论 |
| 线性探针DNA（LP17） | 5' - HS -（CH2）6 - TGGATCGGCGTTTTATT -（CH2）7的NH - MB - 3' | HPLC纯化，可以订购与SS |
| 目标分析物的DNA | AATAAAACGCCGATCCA | 未修改 |
| 识别东街 | 5' -抗原- TEG - CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG - 3“ | |
| 脚手架锚 | 5' - HS -（CH 2）6 - GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC -（CH 2）7 MB的 | HPLC纯化，可以订购与SS |
| A4可卡因的核酸适体 | 5' - HS - AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG MethyleneBlue - 3“ | HPLC纯化，可以订购与SS |
表1。探针和目标DNA序列。
Discussion
一个重要的注意的是，上述实验都将正常工作电极，除非得到了妥善清理。这里是我们的电化学清洗程序的指南。 CH仪器恒电位工作时，我们使用三个宏程序运行这些清洁步骤。
零阶段（电子商务清洁Ø）
沉浸在0.5MH 2 SO 4电极，将它们连接到工作电极的电位。还重视和浸泡的Ag / AgCl参比和铂电极。开始氧化步骤（5秒2 V），然后减少步长为10秒（0.35 V）。
第一阶段（E清洁1）
在相同的酸性条件下，从0.35至1.5 V（20扫描，扫描速度为4 V / S和0.01 V的采样间隔，四个扫描，扫描速率（0.5MH 2 SO 4）启动氧化和还原扫描0.1 V / S和0.01 V的采样间隔）。
第二阶段（E清洁2）
另一个涉及四个不同的潜在范围（所有扫描速度在0.1 V S - 1和0.01 V的采样间隔为10段（0.01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4）在酸性条件下进行电化学氧化和还原扫描）：（一）潜在范围从0.2到0.75 V;（ii）潜在的范围从0.2到1.0 V;（三）潜在的范围从0.2到1.25 V;（四）潜在的范围从0.2至1.5 V。
金电极的种类很多，可以用来进行这些实验。此外，如这里的金盘电极，我们已成功与金表面微加工，金线，并在印刷电路板上的黄金。
随着本文中所描述的传感器，许多其他的电化学DNA生物传感器架构已报告。这包括用假结12传感器，三股13 14，三明治，15超级三文治，或三缸16架构。
在未来，我们预期，这些传感器将被用于点保健医疗诊断。他们已经成功地集成到了17,18微流体装置，光学分析物的检测系统，并提供许多优点。特别是，这些传感器可以在浑浊的功能，光学密集和高度自动荧光的样品。
Disclosures
有没有透露。
Acknowledgments
这项工作是从比尔和梅林达盖茨基金会资助，通过“探索大挑战”倡议，由美国国立卫生研究院GM062958 - 01和2R01EB002046通过赠款，赠款（OPP1015402）。这项工作是在根据合同DE - AC52 - 07NA27344根据美国能源部的主持下的劳伦斯 - 利弗莫尔国家实验室的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold Disk Electrodes | CH Instruments, Inc. | CHI101 | Can be re-used |
| Synthetic Probe DNA | Biosearch Technologies | Custom | |
| Synthetic Target DNA | Sigma-Aldrich | Custom | |
| Mercaptohexanol | Sigma-Aldrich | 725226-1G | Store in cool dark place |
| Platinum Electrode | BASi | MW-1032 | Can be re-used |
| Ag/AgCl Reference | BASi | MF-2052 | Can be re-used |
| Polishing Cloth | Buehler | 40-7212 | |
| Alumina Polish | Buehler | 40-6325-016 | |
| Phosphate buffered saline Buffer, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| CH Instruments 605A | CH Instruments, Inc. | 605A | Use any potentiostat |
| Newborn Calf Serum | Sigma-Aldrich | N4637-500ML | Stored frozen |
| NanoDrop | Fisher Scientific | ND-2000 | Use any UV-Vis |
| PCR Mix | Bio-Rad | 170-8862 | Stored frozen |
| Cocaine | Sigma-Aldrich | C5776 | DEA License Required |
| Procaine | Sigma-Aldrich | P9879 | Substitute for Cocaine |
| Anti-Flag Antibody | Sigma-Aldrich | F1804-1mg |
References
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