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Bioengineering

La fabrication des électrochimique de l'ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d'acides nucléiques, protéines et petites molécules

doi: 10.3791/2922 Published: June 1, 2011

Summary

«E-DNA» de capteurs, sans réactif, les biocapteurs électrochimiques qui se comportent bien, même si contesté directement dans le sang et d'autres matrices complexes, ont été adaptés à la détection d'une large gamme d'acides nucléiques, de protéines et de petites molécules d'analytes. Nous présentons ici une procédure générale pour la fabrication et l'utilisation de tels capteurs.

Abstract

Comme la médecine est pratiquée actuellement, les médecins envoient des échantillons à un laboratoire central pour les tests et doivent donc attendre des heures ou des jours pour recevoir les résultats. Beaucoup de patients seraient mieux servis par des tests rapides et de chevet. À cette fin, notre laboratoire et d'autres ont développé un appareil polyvalent, plateforme sans réactif biocapteur qui soutient le quantitatif, sans réactif, détection électrochimique des acides nucléiques (ADN, ARN), des protéines (y compris des anticorps) et de petites molécules d'analytes non transformés directement dans des échantillons cliniques et environnementaux. Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation et l'utilisation de biocapteurs plusieurs reprises dans ce «E-DNA» de classe. En particulier, nous fabriquons et de démontrer des capteurs pour la détection d'une séquence d'ADN cible dans un mélange polymerase chain reaction, un anticorps spécifique du VIH et de la cocaïne drogue. La procédure de préparation ne nécessite que trois heures de pratique sur l'effort suivie d'une nuit d'incubation, et leur utilisation nécessite quelques minutes seulement.

Protocol

1. Préparer le terrain

  1. Acheter le pertinentes, sonde d'ADN modifié chimiquement par une société synthèse d'oligonucléotides personnalisés tels que Biosearch Technologies (Novato, Californie) ou Midland Certified (Midland, TX). La sonde est modifiée lors de la synthèse par l'ajout d'un thiol C6 à sa extrémité 3 'et un bleu de méthylène redox-actif à son extrémité 5'.
  2. Dissoudre la sonde d'ADN dans un tampon phosphate salin pH 7,4 à une concentration de 200 uM et de vérifier sa concentration en mesurant son absorbance à 260 nm avec un spectrophotomètre. En raison de la fraction du bleu de méthylène sur la sonde d'ADN de la solution doit avoir une teinte bleue visible.
  3. Fraîchement préparer 1 mL d'une solution 10 mM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine PTCE dans l'eau distillée, eau déminéralisée (eau déminéralisée). Dans notre expérience, ces solutions restent fraîches PTCE une semaine lorsque stockés dans l'obscurité à 4 ° C.
  4. Afin de réduire toute ponts disulfures qui pourraient être présents dans la solution d'ADN de sonde, combinez 1 pl de la solution stock sonde d'ADN avec 2 ul de la solution PTCE et mélanger doucement avec une pipette. Incuber le mélange pendant une heure dans un endroit sombre, conteneur réfrigéré. La solution initialement bleue devrait devenir claire que le PTCE réduit de façon réversible le bleu de méthylène. Si la solution ne devient pas claire, répéter la procédure en utilisant une solution PTCE frais ou, éventuellement, à la température ambiante.
  5. Après une heure de diluer la solution d'ADN réduite sonde avec 1 ml de tampon, ce sera le diluer à une concentration de 200nm. Plus tard, vous aurez incuber un ensemble d'électrodes à disque d'or en portions de 200 ul de cette solution diluée de sonde.
  6. Fraîchement préparer au moins 2 ml de 2mm mercaptohexanol en tampon phosphate salin.

2. Préparation du capteur

  1. Combinez 0,05 microns de poudre d'alumine avec de l'eau sur un chiffon de polissage fines. Pologne un ensemble d'électrodes disque d'or (CH Instruments, Austin, TX) en appuyant sur la surface d'or fermement dans le tissu humide, et en les déplaçant dans un modèle à huit chiffres pour environ trois minutes par électrode.
  2. Rincer les électrodes polies avec de l'eau déminéralisée et de les immerger dans des tubes Eppendorf remplis de la même chose. Soniquer pendant cinq minutes pour enlever tout résidu de poudre d'alumine.
  3. Placer les électrodes dans une solution 0,5 M d'acide sulfurique, de les joindre à un potentiostat avec un compteur de platine et argent / chlorure d'électrode de référence, et d'exécuter une série de voltampérogrammes à s'oxyder, réduire, et électrochimiquement nettoyer leurs surfaces. Suite à cette effectuer un second nettoyage électrochimique dans une solution de 0,01 M de KCl à 0,1 M d'acide sulfurique. Les détails les plus fins de ces procédures de nettoyage peut être trouvé dans notre nature Protocoles papier 1, et dans le supplément à cette vidéo.
  4. Disposer d'un ensemble de deux tubes Eppendorf ml dans un rack et remplissez chacune avec 200 ul de la solution d'ADN sonde. La concentration de l'ADN sonde dans cette solution va définir la densité avec laquelle la sonde ADN paquet sur la surface du capteur. Les performances du capteur est fortement dépendante de la densité de sonde, avec la densité optimale varie d'une architecture de capteurs à l'autre. La concentration de sonde utilisés à cette étape devrait donc être optimisé pour chaque nouveau type de capteur 2. Pour les architectures de sonde que nous avons étudiés à ce jour, les concentrations d'ADN de sonde, nous comptons dans cette gamme étape à partir de 15 nm à 2 pm, avec 200 Nm étant une valeur typique.
  5. Rincer les électrodes à disque d'or avec de l'eau déminéralisée, puis les immerger dans la solution d'ADN sonde pertinentes dans un tube Eppendorf pendant une heure. À ce stade, l'ADN sonde joindre à la surface de l'électrode d'or par la formation d'une monocouche auto thiol-sur-or assemblés.
  6. Rincez les électrodes avec de l'eau déminéralisée, les plonger dans 2mM mercaptohexanol dans un tube Eppendorf et les stocker dans un endroit sombre pendant 3 heures à une nuit à température ambiante afin d'assurer la formation complète de la monocouche auto-assemblées. Cette étape intègre les mercaptohexanol dans le cadre d'une monocouche mixte pour assurer la formation d'une monocouche stable. Pour éviter l'évaporation, vous voudrez peut-être pour sceller l'électrode dans le tube Eppendorf avec du parafilm. Les capteurs peuvent être stockés dans cette solution pendant plusieurs jours si nécessaire.
  7. Lorsque vous êtes prêt à utiliser le capteur, le rincer avec de l'eau déminéralisée puis le tremper dans le tampon d'au moins dix minutes. Capteurs destinés à la détection d'anticorps doit également être immergées dans une solution 100 nM du brin de reconnaissance pertinentes avant de l'utiliser, rapidement suivie par une très rincer avec de la mémoire tampon.

3. Test du capteur, détection de l'ADN

  1. Dans ce protocole, un brin 17 sonde nucléotidique est apposée sur une électrode en or. Il a une journaliste de méthylène bleu redox à sa extrémité 3 '(figure 1). Lorsque la molécule sonde s'hybride avec un brin capture, le courant à travers le circuit du capteur diminue.
  2. Rincez un capteur frais avec de l'eau déminéralisée et le plonger dans un videl'échantillon manquant la cible afin d'enregistrer le signal de fond qu'il produit. Fixez le capteur à la tête électrode de travail d'un potentiostat. Placez une contre-électrode de platine et une électrode d'argent / chlorure d'argent dans la solution de référence.
  3. Exécuter une mesure d'ondes carrées de 0 à -0,6 V avec une amplitude de 25 mV et une taille de pas de 1mV. La fréquence de l'onde optimale carrés dépendra des détails de l'architecture de sonde 2,3; pour les architectures de sonde que nous avons employé les valeurs optimales sont typiquement dans la gamme 60 à 600 Hz. Vous devriez voir un pic arrondi à environ -0,35 V, le potentiel redox de bleu de méthylène (le potentiel de pointe peuvent changer légèrement selon le pH de votre solution précise de test). La hauteur de référence actuelle à ce pic est proportionnelle à la l'efficacité de transfert d'électrons entre le bleu de méthylène et l'électrode en or (figure 2). Sauvegarder cette mesure initiale.
  4. Déplacez les électrodes à une solution qui contient la molécule d'ADN cible d'intérêt, à équilibrer (5 à 120 mn selon la taille, la structure et la concentration des target4, 5) et de percevoir un voltammagram deuxième vague carrée. La hauteur du pic à -0,35 V va changer à partir de la mesure de fond, initiales. L'ampleur de ce changement est lié à la concentration de l'analyte. C'est la sortie des données principales de ce capteur (figure 3).
  5. Mesurer le changement de signal relatif, le pourcentage de diminution ou d'augmentation du signal par rapport au pic de fond, est souvent plus reproductible que la mesure de la variation absolue de courant, car cela corrige les variations de la surface de l'électrode. Pour ce faire, la différence entre le courant de crête et le courant de crête de fond sont divisées par le pic de courant de fond.

4. Régénération du capteur

  1. Une fois que vos mesures sont terminées, placez le capteur dans un récipient rempli d'eau déminéralisée pendant 30 s, ou gicler c'est avec un flux régulier de l'eau déminéralisée pendant 30 s. Répétez ceci deux fois plus avec de l'eau déminéralisée fraîche. Remarque: certains analytes sont résistantes à cette approche, car les essayer agressive de rinçage dans le chlorhydrate de guanidine 6 M ou de l'éthanol à 70%.
  2. Placez le capteur de retour dans une solution où les mesures seront prises. En une minute, la hauteur du pic aurait dû retourner à sa valeur initiale. Il est à noter que ces capteurs présentent souvent un changement de signal légèrement plus grande au cours de leur premier test et le cycle de régénération, et des résultats très cohérents au cours des cycles ultérieurs 6.

5. Test du capteur, la détection d'anticorps

  1. Dans ce protocole, la sonde d'ADN au bleu de méthylène et de thiols modifiés utilisés dans ces capteurs sert une "ancre" brin 7. Il est rattaché directement à l'électrode d'or. Ceci est ensuite hybridée avec une deuxième brin d'ADN «reconnaissance» qui a été conjugué de façon covalente à l'antigène pertinents (figure 4). Nous avons eu de la chance avec ses maisons synthèse commerciale, tels que Biosearch Technologies et Panagene, pour la synthèse de l'ADN de l'antigène nécessaire chimères. L'étape d'hybridation est effectuée par le transfert d'un capteur de pré-fabriqués dans un tube Eppendorf contenant 100 nM de brin d'ADN de reconnaissance pertinents dans du PBS pendant 1 heure.
  2. Placez le capteur dans la solution pertinente vierge. Attachez-le à la tête de l'électrode de travail d'un potentiostat et placer une contre-électrode de platine et argent / électrode de référence de chlorure dans la solution.
  3. Effectuer voltamétrie à onde carrée comme décrit ci-dessus. Pour l'architecture sonde particulière que nous avons employé ici la fréquence optimale d'onde carrée est de 60 Hz. Vous devriez voir un pic arrondi autour de -0,35 V. Enregistrer cette mesure de fond.
  4. Transfert des électrodes dans une solution contenant l'analyte cible, incuber pendant 5 à 60 min, et de recueillir une seconde vague voltammagram carrés. Si l'anticorps cible est présente le pic à -0,35 V va diminuer. L'ampleur de ce changement est lié à la concentration d'anticorps.

6. Test du capteur, la détection de molécules petites

  1. Dans ce cas, la molécule sonde sur la surface du capteur est un aptamère, un molécule d'ADN ou d'ARN qui a été sélectionné in vitro pour lier un analyte spécifique moléculaire, que les changements de sa structure (plis) lors de la liaison à son analyte cible 8,9 ( Figure 5). Ici nous employons un aptamère cocaïne liaison à l'ADN, développé par le laboratoire de 10,11 Stojanovic.
  2. Rincez un capteur frais avec de l'eau déminéralisée et le plonger dans un échantillon blanc manquent la cible afin d'enregistrer le signal de fond qu'il produit. Fixez le capteur à la tête électrode de travail d'un potentiostat. Placer un compteur de platine et une référence en argent / chlorure d'argent dans la solution.
  3. Effectuer voltamétrie à onde carrée comme décrit ci-dessus. Pour l'architecture sonde particulière que nous avons employé ici la fréquence des ondes optimale carré est de 200Hz (Mais 60 Hz fonctionne aussi). Vous devriez voir un pic arrondi autour de -0,35 V. Enregistrer cette mesure de fond.
  4. Transfert des électrodes dans une solution contenant l'analyte cible, incuber pendant ~ 5 min, et de recueillir une seconde vague voltammagram carrés. La hauteur du pic à -0,35 V va changer. L'ampleur de ce changement est lié à la concentration de l'analyte cible. Si vous ne pouvez pas obtenir un échantillon de la cocaïne, la procaïne, dont l'utilisation n'est pas réglementée, peut être utilisé comme un substitut.

7. Les résultats représentatifs:

Quand il est utilisé pour détecter l'ADN en utilisant l'architecture d'abord, le signal devrait diminuer d'au moins 60% lorsque l'équilibre à une cible de 200 nM. Après trois rinçages brève dans l'eau déminéralisée, le signal devrait revenir très proche (dans 0,1-5%) à sa valeur initiale. Capteurs de détection d'anticorps devraient subir une baisse de signal de 40 à 80%. Aptamères à base de capteurs pour la détection de la cocaïne présentent une augmentation du signal de jusqu'à 200% selon la fréquence et la couverture de surface au cours de laquelle ils opèrent. Pour le capteur de la cocaïne, une couverture de surface faible est le meilleur 3.

Figure 1
Figure 1. Détection de l'ADN avec un biocapteur ADN électrochimique.

Figure 2
Capture d'écran la figure 2. Montrant le signal produit par un biocapteur E-ADN au cours de la voltamétrie à onde carrée.

Figure 3
Capture d'écran la figure 3. Montrant les signaux produits par un biocapteur E-ADN au cours de la voltamétrie à onde carrée, avant et après hybridation avec un analyte.

Figure 4
Figure 4. Détection des anticorps avec un biocapteur échafaud.

Figure 5
Figure 5. Détection de cocaïne ou de la procaïne avec un biocapteur électrochimique aptamère.

Oligo personnalisé Séquence Commentaires
Linéaire sondes à ADN (LP17) 5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 ' Purifiée par HPLC, peut être commandé avec SS
L'ADN analyte cible AATAAAACGCCGATCCA Unmodified
Reconnaissance Strand 5'-antigène-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 '
Échafaudage Anchor 5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH2) 7-MB Purifiée par HPLC, peut être commandé avec SS
A4 cocaïne aptamères 5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 ' Purifiée par HPLC, peut être commandé avec SS

Tableau 1. Probe et séquences d'ADN cible.

Discussion

Une remarque importante est que aucun des expériences décrites ci-dessus fonctionnera correctement si les électrodes ont été correctement nettoyé. Voici un guide à notre procédure de nettoyage électrochimique. Lorsque vous travaillez avec potentiostats Instruments CH, nous exécuter ces étapes de nettoyage en utilisant un ensemble de trois programmes de macro.

Phase Zéro (E-propre O)
Plonger les électrodes dans 0.5MH 2 SO 4 et de les connecter à des électrodes de travail d'un potentiostat. Également joindre et plonger une référence Ag / AgCl et contre-électrode de platine. Commencez avec une étape d'oxydation (2 V pendant 5 s), puis une étape de réduction (0,35 V pendant 10 s).

Phase One (E-propre 1)
Initier l'oxydation et de réduction de scans dans les mêmes conditions acides (0.5MH 2 SO 4) 0,35 à 1,5 V (20 numérise à une vitesse de balayage de 4 V / s et un intervalle d'échantillonnage de 0,01 V, suivie par quatre numérise à une vitesse de balayage de 0,1 V / s et un intervalle d'échantillonnage de 0,01 V).

Phase Deux (E-nettoyage 2)
Effectuer une autre série d'oxydation électrochimique et scans de réduction dans des conditions acides (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4) couvrant quatre différentes gammes potentielles (toutes réalisées pour 10 segments à une vitesse de balayage de 0,1 V s 1 et un intervalle d'échantillonnage de 0,01 V ): (i) portée potentielle de 0,2 à 0,75 V, (ii) gamme potentielle de 0,2 à 1,0 V, (iii) gamme potentielle de 0,2 à 1,25 V, (iv) éventail potentiel de 0,2 à 1,5 V.

Plusieurs types d'électrodes en or peuvent être utilisés pour réaliser ces expérimentations. En plus d'électrodes à disque d'or telles que celles utilisées ici, nous avons eu du succès avec des surfaces d'or microfabriqué, fil d'or, et or sur les circuits imprimés.

Avec les capteurs décrits dans ce document, de nombreuses autres architectures électrochimique biocapteur ADN ont été signalés. Cela comprend des capteurs avec un pseudo-noeud 12, 13 triple brin, un sandwich 14, sandwich Super 15, 16 ou triplex architecture.

Dans l'avenir, nous prévoyons que ces capteurs seront utilisés dans le diagnostic sur les soins médicaux. Ils ont été intégrés avec succès dans plusieurs dispositifs microfluidiques 17,18, et offrent de nombreux avantages sur les systèmes optiques détection de l'analyte. En particulier, ces capteurs peuvent fonctionner en trouble, optiquement dense et très auto-fluorescence des échantillons.

Disclosures

Il n'ya rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par une subvention (OPP1015402) de la Fondation Bill and Melinda Gates Foundation à travers la Challenges Explorations Initiative Grand, et par le biais de subventions des NIH GM062958-01 et 2R01EB002046. Ce travail a été exécuté en partie sous les auspices du Département américain de l'énergie par le Lawrence Livermore National Laboratory en vertu du contrat DE-AC52-07NA27344.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold Disk Electrodes CH Instruments, Inc. CHI101 Can be re-used
Synthetic Probe DNA Biosearch Technologies Custom
Synthetic Target DNA Sigma-Aldrich Custom
Mercaptohexanol Sigma-Aldrich 725226-1G Store in cool dark place
Platinum Electrode BASi MW-1032 Can be re-used
Ag/AgCl Reference BASi MF-2052 Can be re-used
Polishing Cloth Buehler 40-7212
Alumina Polish Buehler 40-6325-016
Phosphate buffered saline Buffer, pH 7.4 Sigma-Aldrich P7059-1L
CH Instruments 605A CH Instruments, Inc. 605A Use any potentiostat
Newborn Calf Serum Sigma-Aldrich N4637-500ML Stored frozen
NanoDrop Fisher Scientific ND-2000 Use any UV-Vis
PCR Mix Bio-Rad 170-8862 Stored frozen
Cocaine Sigma-Aldrich C5776 DEA License Required
Procaine Sigma-Aldrich P9879 Substitute for Cocaine
Anti-Flag Antibody Sigma-Aldrich F1804-1mg

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References

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Rowe, A. A., White, R. J., Bonham, A. J., Plaxco, K. W. Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules. J. Vis. Exp. (52), e2922, doi:10.3791/2922 (2011).More

Rowe, A. A., White, R. J., Bonham, A. J., Plaxco, K. W. Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules. J. Vis. Exp. (52), e2922, doi:10.3791/2922 (2011).

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