Summary
형광 수명 이미징 (FLIM)는 이미지 환경과 특정 단백질과 생활 세포에있는 염료의 상호 작용에 핵심 기술로 부상하고있다. 형광 분자 rotors의 FLIM은 살아있는 세포의 점도 매핑 있습니다.
Abstract
보급은 종종 화학 반응 또는 생물 학적 과정에 중요한 속도 - 결정 단계이며, 세포내 이벤트 광범위한 역할을 담당하고 있습니다. 점성은 분자와 단백질의 확산에 영향을 미치는 주요 매개 변수 중 하나이며, 점도의 변화가 세포 수준에서 질병 및 장애로 연결되었습니다. 1-3 대량 점도를 측정하는 방법이 잘 개발되어 있지만, 이미징 microviscosity는 과제 남아 . 최근 얻을 힘들었 때까지 같은 단일 세포와 같은 미세한 물체의 점성지도는 있습니다. 기타 광학 기술과 유사, 그것이 비 파괴적인, 최소한 침략이며 생활 세포와 조직에 적용할 수 있기 때문에 형광 기술과 매핑 점도는 유리입니다.
형광 분자 rotors는 형광 수명과 microenvironment의 점성 함수가 양자 수율을 나타냅니다. 4,5 분자내 왜곡하고 있군요 또는회전은 흥분 상태 뒤쪽에서 바닥 상태로 비 발광 붕괴로 이어집니다. 점성 환경이 아닌 발광 붕괴 경로에 대한 액세스를 제한하는이 회전하거나 트위스트 느려집니다. 이것은 형광 양자 수율 및 형광 수명의 증가로 이어집니다. 형광 분자 rotors 역할 수정된 소수성 BODIPY 염료의 형광 수명 이미징 (FLIM)는 이러한 프로브의 형광 수명 자신의 환경 microviscosity의 함수임을 보여줍니다. 6-8에게 용매 점도 수확량 대 형광 수명의 대수 음모를 포스터 호프만 방정식을 따르는 직선 9.이 음모는 점도에 형광 수명을 변환하는 보정 그래프로 제공합니다.
수정된 BODIPY 형광 분자 로터와 살아있는 세포의 부화 후, 작은 반점이있는 염료 배포는 형광 이미지에서 관찰된다. 회에서 얻어진 점도 값살아있는 세포에서 전자 puncta는 약 100 배 물이보다 높은과 세포 세포질의입니다. 6,7 시간 해결 형광 이방성 측정이 큰 microviscosity 가치와 계약에 회전 상관 시간을 얻을 수 있습니다. 형광 수명을 매핑하는 것은 형광 강도의 독립적이며, 따라서 프로브 농도와 점성 효과의 분리가 가능합니다.
요약에서 우리는 형광 분자 rotors의 FLIM을 바탕으로 세포의 microviscosity를 매핑하기위한 실용적이고 다양한 접근 방식을 개발했습니다.
Protocol
FLIM 샘플 준비를위한 프로토콜 공촛점 또는 넓은 필드 강도 기반의 형광 현미경 분들 다를하지 않습니다. 데이터 수집은 즉 원시 데이터의 형광 수명을 추출, 데이터 분석의 주요 작업은 다음에 있습니다. 일단 이들이 취득되어, 데이터 해석은 가설을 확인하거나 위조하는 데 도움이됩니다.
1. 분자 rotors있는 염색법 세포
- 에 염료 약 1 밀리그램 / ML을 해소하여 주식 솔루션 (10 ML)를 준비 적절한 용매 (BODIPY-C 12 예 : 메탄올) 6,7 정확한 균형과 피펫을 사용하여.
- 스테인드있을 세포는 (우리의 경우 모델 암 세포주, HELA) ~ 80 % 합류하기 전까지 5 % CO 2 분위기로 37 ° C에서 인큐베이터에서 현미경을위한 coverslide의 아래쪽으로 multiwell 플레이트에 대한 재배 .
- 10 추가 - 재고 용액 20 μl를 다중 나르는에서 성장하는 살아있는 세포에Opti-MEM 배지 (GIBCO) 당 잘 6 - 잘 접시 4 개 ML에 난 플레이트 (50 SmartSlide 마이크로 인큐베이션 시스템 Wafergen). 이것은 잘에서 마이크로 어금니 염료 농도를 얻을.
- 염색법에 대해 10-45 분를위한 5 % CO 2 분위기로 37 ° C에서 인큐베이터로 멀티 잘 번호판을 반환합니다.
- 인큐베이터에서 multiwell 플레이트를 제거하고 여분의 염료를 제거하는 네 ML 광학적으로 투명 세포 배양 매체 (예 : Opti-MEM)와 세포에게 3-4 회 씻는다.
- 현미경 단계에 multiwell 판을 전송하고 필요에 따라 영상을위한 준비, 온도 컨트롤러 / 5 % CO 2 가스 유입구에 연결합니다.
2. 세포의 형광 분자 rotors의 FLIM
- 현미경 스테이지에 샘플을 넣고 전송 및 형광 세포를 확인하는 형광 이미지를 구하십시오. 설정 실험의 개략도는 그림에 표시됩니다. 1.Verify 그 위치 expe에서 형광 emanatescted (예 : 세포막, 세포질). 형광 방출 스펙트럼을 확보하고,이 경우에는 분자 로터의 스펙트럼 예상 염료이나 단백질의 있는지 확인합니다. 부정적인 컨트롤로, 이미지가 아닌 스테인드 샘플을하고 형광하지 않는 있는지 확인합니다. 이 단계가 FLIM 위해 특별히 필수는 아니지만, 그것은 일반적으로 좋은 습관이며, 예제는 당신이 그것이 무엇인지 확인하는 데 도움이 않습니다.
- FLIM 모드로 전환 -이 쉽게 형광 검출 빔 경로 (Leica TCS SP2 수집 제어 소프트웨어에서 "빔 경로 설정"패널에서 "외부 검출기"버튼)에서 거울을 이동하여 수행됩니다. 검출기에 도달으로부터 흥미로운 빛을 차단하는 적절한 형광 방출 필터는 형광 검출 beampath에 있어야합니다.
그림 1. AC를 사용하여 시간 도메인 FLIM위한 실험적 조치onfocal 레이저 현미경 스캐닝.
- 샘플을 검사하고 검출기 카운트 속도 (베커 & Hickl SPC 830 보드의 수집 제어 소프트웨어에 CFD 표시된 검은 막대)가 더 이상 레이저 반복 률의 약 1 % (이상 없다는 것을, FLIM 수집을 제어하는 컴퓨터에, 확인 녹색 막대) SYNC 수집 제어 소프트웨어를 분류. 그렇다면 더미 업 변형된 형광 붕괴 곡선을 수집 피하기 위해, 레이저 빔 경로에 중성 농도 필터를 배치하여 예를 들어 레이저 여기 강도를 줄일 수 있습니다.
- 일반적으로 3-5 분 동안 FLIM 이미지를 취득 스캔을 중지하고 원시 데이터 (3D 데이터 공간 좌표를 x와 y로 구성된 '큐브'및 시간) 저장하십시오.
- 예를 TRI-2 14 상용 소프트웨어, 형광 강도 이미지를 표시하려면위한 형광 붕괴 분석 소프트웨어 패키지의 원시 데이터를 엽니다. 이것은 단순히 통합 형광 붕괴이며, 각각에서 형광 붕괴 곡선 아래의 영역을 말한다픽셀.
- 거기에 커서를 배치하여 일반적인 픽셀을 선택하고 해당 픽셀의 형광 붕괴를 검사. 피크 카운트가 100 이하이면 픽셀의 공간적 binning을 사용합니다. 인접 픽셀 (예 : 3x3 또는 5x5)의 카운트가 높은 피크 카운트 거기서 얻은 것입니다 그래야 중심 픽셀에 추가됩니다. 이것은 다음 단계에 대한 높은 통계의 정확도를 제공합니다. 또는 측정은 긴 획득 시간 (5 단계)에 대한 반복 수 있습니다. 30 - 50 분 들면, 약 10 배 이상의 최대 개수 (그리고 총 카운트)이 얻어, 그러나 이것은 너무 오래 멀리 있기 때문에 샘플의 움직임에 의한 유물, 현미경 드리프트, phototoxicity 및 도입의 위험성이 대부분 생물 학적 샘플 수집 시간입니다 photobleaching.
- 글로벌 픽셀 임계값 값 (픽셀의 부패가 장착되는 위에있는)을 선택하고 이미지를 하나의 지수 감쇠 발작을 적용합니다. 결과는 다음으로 인코딩되어 임계값 위의 각 픽셀에 대한 형광 수명을 듭니다색상. 각 픽셀은 적합의 결과로 유색 인종이야, 그리고 FLIM지도가 얻어진다. 다양한 픽셀의 감소 치 제곱 값 체크 - 1 주변 (및 최대 1.3까지) 잘 맞는 나타냅니다. 무작위 제로 주위에 배포해야 해당 residuals을 검사합니다.
- 형광 수명 히스토그램의 특정 형광의 수명은 형광 수명 자체에 비해 발생 빈도 플롯. 형광 수명 분포는 색상 범위로 맞는되는 색상 범위 등의 조정합니다.
- monoexponential 판단 주변 1 기의-제곱 값 (및 최대 1.3까지)를 양보하지 않으며, 제로로부터 residuals의 체계적인 편차가있다면,보다 정교한 모델이 필요합니다. 예를 들어, 탐사선이 적합도 하나 염료의 상대적인 양을 알려주지 사전 지수 요인이나 amplitudes을 낼 것입니다 인치있을 수 있습니다 두 개의 서로 다른 환경에 계좌로, 형광 붕괴로 이중 지수 모델을 맞추려고 시도 둘러 싸다, 표준 또는 기타. 양자 택일로, 뻗어 지수 함수는 형광 수명의 분포 계좌가 적절한 수 있습니다.
- 각 픽셀에 대한 형광 수명, 사전 지수 요인 및 수명 비율과 사전 지수 인자 비율에 대한 결과는 다음 컬러로 인코딩 할 수 있습니다. 각 픽셀은 가치에 따라 컬러이며, 형광 수명, 사전 지수 요인과 그 비율에 따라 명암이 얻어진다. 적합한를 나타내는 1 시경 (및 최대 1.3까지) - 다시 감소 치 제곱 값 (도 컬러 인코딩 및 이미지로 표시할 수 있음) 확인합니다. 무작위 제로 주위에 배포해야합니다 residuals을 검사합니다.
- 형광 평생 histograms 평균 형광 평생 가치를 쉽게 시각화, 그리고 형광 수명 분포에 대한 모든 이미지를 동반해야합니다.
3. 대표 결과
형광 자연 붕괴를 위해 측정메탄올 / 글리세린 섞어으로 점도를 증가시 형광 분자 로터는 그림에 표시됩니다. 2. 형광 붕괴는 monoexponential이며, 형광 수명은 점성 함수로 현저하게 다릅니다. 그것은 메탄올에 약 300 PS (점도 0.6 CP)에서 95 % 글리세롤 (점도 950 CP)의 3.4 NS로 증가합니다.
BODIPY-C 그림 2. 형광 붕괴 프로필 다양한 점도의 메탄올 / 글리세린 섞어 12 6.
형광 수명의 로그 보정 줄거리는 τ 대 형광 분자 로터에 대한 점성 η는 그림에 표시됩니다. 3. 포스터 호프만 방정식 9 일까지 요구대로 그것은 직선이다
K 0 radiativ입니다전자 일정한 속도, 그리고 Z와 x는 0 <X <1, 상수입니다. 양측의 수율에서 모두 로그를 복용
X 어디는 직선의 기울기이다.
그림 3. 포스터 - 호프만 방정식에 따라 BODIPY-C 12 수확량 직선에 대한 로그 형광 수명 대 로그 점도의 줄거리 6.
형광 분자 로터와 살아있는 세포의 배양에 이어 작은 반점이있는 염료 배포는 형광 이미지에서 관찰된다. meso - 치환 BODIPY 색소를 incubated HELA 세포의 FLIM 이미지는 그림에 표시됩니다. 4. 이미지의 각 픽셀의 형광 붕괴는 적절 하나의 지수 감쇠 모델을 이용하여 장착할 수 있습니다.
그림 4. () 형광 강도 및 BODIPY-C 12 물들일 HELA 세포 (B) FLIM 이미지. 밝고 중단 지역은 다른 지역보다 짧은 수명을 나타냅니다. 이 짧은 liftime는 포스터 - 호프만 방정식에 의하면, puncta의 낮은 점도, 아마도 지질 방울에 해당합니다.
모든 픽셀에서 추출한 수명을하려함으로써, 우리는 그림과 같이 전체 이미지의 형광 수명 히스토그램을 구하십시오. 5.
그림 5. meso - 치환 BODIPY 분자 rotors 물들일 HELA 세포의 FLIM 이미지에서 형광 수명의 Histograms.
Discussion
FLIM는 강도 기반의 형광 이미징 이상의 몇 가지 주요 이점을 제공합니다. 그것이 형광단 농도 효과에서 그들을 분리할 수 있기 때문에 그것은 형광 강도 이미징에 의해 관찰하기 어렵거나 불가능 photophysical 이벤트에 대한 리포트를 작성할 수 있습니다. 이것은 이미징 형광 분자 rotors하여 세포내 점도를 매핑에 특히 유용합니다. 그림과 같이 형광 수명은 쉽게, 보정 그래프를 사용하여 점도로 변환할 수 있습니다. 3, 형광 분자 rotors의 농도가 독립.
FLIM의 데이터 해석을 복잡 수 유물이있을 수 있습니다. 10 경음악 유물은 형광 부패의 시작 부분 위에 피크로 표시되며 짧은 붕괴 시간과 혼동 수 있습니다 흩어진 빛, 또는 이후에 작은 피크를 포함 IRF는 어떤 현미경 내부 반사에 의해 발생할 수 있습니다. 이 흩어져 빛이 유물은 같은 확인할 수 있습니다그들이 스펙트럼 차별로 구분할 수 있기 때문에 - 그들은 흥미로운 빛이 같은 파장에 항상있다. 공중에, 라이트는 1 nanosecond에서 30 센티미터 여행 것을 외우는 건 반사의 출처를 정확히 파악할 수 있도록 도와줍니다.
필터 혹은 유리 형광은 또한 특히 낮은 샘플 형광에서 유물을 일으킬 수 있지만, 이것은 쉽게 샘플없이 측정을 복용하여 확인하실 수 있습니다 부패가 이런 상황에서 얻은 것입한다면, 그것은 악기에 의한이며 아무 상관이 없어 샘플로! 반면에, 샘플 autofluorescence 또한 형광 부패에 기여할 수 있습니다.
시간이 서로 관련 단일 광자의 계산에서는 (TCSPC), 타임 - 투 - 진폭 컨버터 (TAC)가 아닌 linearities는 가난한 면에서 발생할 수 있으나, 여기를 차단하고 샘플로 전송 광원의 예 : 주위 조명, 빛나는하여 확인할 수 있습니다 그리고 타이밍을 측정. 상수 배경이 있어야이미지의 각 픽셀에 취득. 일정한 배경에서 편차가 발생 지역은 잘 맞는가 나올 않을 것이며 그들이 TCSPC 카드에 대한 매개 변수를 조정하여 제거될 수 없다면 측정을 위해 피해야한다.
TCSPC의 한 악명높은 유물이 너무 높이 광자 검출 률에 의해 발생되는 더미 업 광자입니다. 11,12 이것은 전자가 바쁜시기이기 때문에 후속 광자를 무시하고 최초로 광자를 처리, 시간 초과되는 첫 번째 광자로 안내합니다. 형광 수명의 단축, 그리고 이것을 방지하는 최선의 방법으로 연쇄 충돌 리드는 레이저 반복 율이 1 % 정도의 광자 개수 율을 유지하는 것입니다.
시야
응용 프로그램에 따라이 FLIM의 다양한 구현이 있으며, 각각은 장점과 단점이 있습니다. 13 이상적인 형광 현미경 획득 것이 전체 다차원 형광 emissio가단일 광자 감도, 최대 공간 해상도 및 최소 획득 시간과 단일 측정의 강도, 위치, 평생, 파장과 편광의 N 곡선. 이 기능이 독특한 조합을 가진 기술은 현재는 없으며, 하나를 구축하는 계기 개발자를위한 도전 남아있다. 세포 생물학에서 중요한 문제에 대한 새로운 물리 기술의 응용 프로그램은 종종 예상치 못한 발견의 경로이며, 우리는 세포 생물학을위한 형광 이미징의 포화 기능을 가까이에 위치하기 전에 갈 길이가 있습니다. 실제로, 그러한 수명, 스펙트럼 및 편광뿐만 아니라 높은 공간적 해상도에서 3D로보다 빠르게 영상과 같은 이미징 형광 파라미터는, 세포 생물학의 새로운 측면을 나타내기 위해 특정 수 있습니다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
MKK은 영국의 공학 및 개인 반지 원정대 물리 과학 연구위원회 (EPSRC) 생명 과학 인터페이스 프로그램을 감사드립니다. 우리는 또한 영국의 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC)에 의해 자금을 인정하고 싶습니다.
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
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