Summary
وقد برزت مضان التصوير العمر (فليم) كأسلوب رئيسي لصورة البيئة وتفاعل بروتينات معينة، والأصباغ في الخلايا الحية. فليم من الدوارات الجزيئية فلوري يسمح رسم الخرائط من اللزوجة في الخلايا الحية.
Abstract
نشر في كثير من الأحيان مهمة تحديد معدل خطوة في التفاعلات الكيميائية أو العمليات البيولوجية، ويلعب دورا في طائفة واسعة من الأحداث داخل الخلية. اللزوجة هي واحدة من المعالم الرئيسية التي تؤثر على انتشار الجزيئات والبروتينات، وارتبطت التغيرات في اللزوجة للمرض وخلل على المستوى الخلوي. 1-3 في حين أن وسائل متطورة لقياس اللزوجة السائبة، والتصوير microviscosity لا يزال يشكل تحديا . خرائط من الكائنات المجهرية اللزوجة، مثل الخلايا واحدة، لديها حتى وقت قريب يصعب الحصول عليها. اللزوجة رسم الخرائط مع تقنيات مضان هو مفيد لأنه، على غرار التقنيات البصرية الأخرى، فمن مينيملي، غير مدمرة، ويمكن تطبيقها على الخلايا الحية والأنسجة.
الدوارات الجزيئية فلوري يحمل عمر مضان والغلة الكم التي هي وظيفة من لزوجة المكروية بهم. التواء أو 4،5 ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئتناوب يؤدي إلى عدم الاضمحلال الإشعاعي من الخلف الحالة المثارة إلى الحالة الأرضية. إن وجود بيئة لزجة تبطئ هذا التناوب أو التواء، وتقييد الوصول إلى هذا المسار الاضمحلال غير الإشعاعي. وهذا يؤدي إلى زيادة في الغلة الكم مضان وعمر مضان. مضان التصوير العمر (فليم) من تعديل الأصباغ BODIPY مسعور أن تكون بمثابة المحرك الجزيئي فلوري تبين أن عمر مضان من هذه التحقيقات هي وظيفة من microviscosity من بيئتهم. 6-8 مؤامرة لوغاريتمي من عمر مضان مقابل عوائد اللزوجة مذيب خط مستقيم أن يطيع المعادلة هوفمان فورستر. 9 هذه المؤامرة أيضا بمثابة معايرة الرسم البياني لتحويل حياة مضان في اللزوجة.
بعد حضانة الخلايا الحية مع الدوار تعديل BODIPY الجزيئية فلوري، ويلاحظ توزيع صبغ منقط في الصور مضان. قيمة اللزوجة التي تم الحصول عليها في اله نقاط وفي الخلايا الحية هي في حدود 100 مرة أعلى من المياه ومن السيتوبلازم الخلوي. 6،7 الوقت لحلها القياسات تباين مضان تسفر مرات ارتباط التناوب في اتفاق مع هذه القيم microviscosity كبير. تعيين عمر مضان مستقلة عن كثافة مضان، ويسمح بالتالي فصل تركيز التحقيق والآثار اللزوجة.
في ملخص، وضعنا نهجا عمليا وتنوعا لتعيين microviscosity في الخلايا استنادا فليم من الدوارات الجزيئية فلوري.
Protocol
وبروتوكولات لإعداد عينة فليم لا تختلف عن تلك التي للفحص المجهري كثافة مقرها مبائر أو واسعة في الميدان مضان. ويتبع في الحصول على البيانات من قبل المهمة الرئيسية لتحليل البيانات واستخراج أي عمر مضان من البيانات الخام. مرة واحدة وقد تم الحصول على هذه، وتفسير البيانات يساعد على التحقق من الفرضيات أو تزوير.
1. تلطيخ الخلايا مع الدوارات الجزيئية
- يعد حل سهم (10 مل) من خلال حل ما يقرب من 1 ملغ / مل من الصبغة في مناسبة مذيب (الميثانول على سبيل المثال لBODIPY-C 12) 6،7 باستخدام ميزان دقيق وماصة 1.
- وتزرع الخلايا (خلية سرطانية خط نموذج، هيلا في حالتنا) لتكون ملطخة على طبق من ذهب في multiwell مع السفلي coverslide للفحص المجهري، في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع أجواء 5٪ CO 2 حتى 80٪ ~ متكدسة .
- إضافة 10 - في الخلايا الحية التي تنمو في أهلا وسهلا متعددة 20 ميكرولتر من محلول المخزونلوحة ل (50 SmartSlide الدقيقة حضانة النظام، Wafergen) في 4 مل من غروب-MEM المتوسطة (GIBCO) لكل بئر لوحة 6 جيدا. هذه تعطي تركيز الصبغة الدقيقة الرحى في البئر.
- عودة لوحة متعددة أيضا إلى حاضنة في 37 درجة مئوية مع أجواء 5٪ CO 2 ل10-45 دقيقة للتلطيخ.
- إزالة لوحة multiwell من الحاضنة، ويغسل خلايا 3-4 مرات مع 4 مل واضح بصريا خلية ثقافة المتوسط (على سبيل المثال غروب-MEM) لإزالة الصبغة.
- نقل لوحة multiwell إلى مرحلة مجهر والاتصال إلى وحدة تحكم في درجة الحرارة / 5٪ مدخل ثاني أكسيد الكربون غاز 2 كما هو مطلوب، وذلك استعدادا للتصوير.
2. فليم من الدوارات فلوري الجزيئية في الخلايا
- ضع العينة على مرحلة مجهر والحصول على نقل صورة ومضان لتحديد الخلايا فلوري. ويظهر رسم تخطيطي للالتجريبية مجموعة المتابعة في الشكل. 1.Verify أن ينبع من مضان بة المواقعالمديرية (مثل غشاء الخلية، والسيتوبلازم). الحصول على طيف الانبعاث مضان، والتحقق من ذلك هو أن من الصبغة أو بروتين المتوقع، في هذه الحالة طيف من الدوار الجزيئية. كوسيلة لمراقبة سلبية، صورة عينة غير ملون والتحقق من أنه لا يتألق. على الرغم من أن هذه الخطوة ليست ضرورية خصيصا للفليم، ومن الممارسات الجيدة بشكل عام ولا مساعدة للتحقق من أن النموذج هو ما كنت أعتقد أنه.
- التبديل إلى وضع فليم - ويتم إنجاز هذا بسهولة عن طريق تحريك مرآة للخروج من مسار الكشف عن شعاع مضان ("خارجي للكشف عن" الموجود على لوحة "مسار شعاع الإعداد" على برنامج لايكا SP2 TCS سيطرة الاستحواذ). يجب على المرشح المناسب الانبعاثات مضان لمنع أي ضوء مثيرة من الوصول إلى الكشف عن أن تكون في beampath كشف مضان.
الشكل 1. ترتيب التجريبي لمرة ونطاق فليم باستخدام تيار مترددالليزر onfocal المجهر.
- مسح عينة والتحقق، على الكمبيوتر السيطرة على اكتساب فليم، أن معدل عدد كاشف (شريط أسود المسمى CFD على برنامج حاسوبي لمراقبة الاستحواذ على بيكر وHickl SPC 830 متن) هو لا يزيد عن 1٪ من معدل تكرار الليزر ( الشريط الأخضر المسمى SYNC برنامج حاسوبي لمراقبة الاستحواذ). إذا كان ذلك، والحد من شدة الإثارة الليزر، على سبيل المثال عن طريق وضع مرشح كثافة محايدا في مسار شعاع الليزر، لتجنب جمع كومة المتابعة مشوه منحنيات الاضمحلال مضان.
- الحصول على صورة فليم، وعادة لمدة 3-5 دقيقة، والتوقف عن المسح الضوئي وحفظ البيانات الخام (أ 3D البيانات "مكعب" التي تتألف من x و y الإحداثيات المكانية، والوقت).
- فتح البيانات الخام في حزمة الاضمحلال مضان برامج التحليل، على سبيل المثال TRI-2 14 أو البرمجيات التجارية، لعرض الصورة كثافة مضان. هذا هو ببساطة الاضمحلال متكاملة مضان، أي المنطقة الواقعة تحت منحنى الاضمحلال مضان، في كلبكسل.
- حدد بكسل نموذجي عن طريق وضع المؤشر على ذلك، وافحص الاضمحلال مضان في أن بكسل. إذا كان عدد الذروة هو أقل من 100، استخدم binning المكاني للخلية. تضاف تهمة المتاخمة بكسل (على سبيل المثال 3X3 أو 5x5) في بكسل المركزية، بحيث يتم الحصول على عدد أعلى قمة هناك. هذا يوفر دقة أعلى الإحصائية لاتخاذ الخطوة التالية. بدلا من ذلك، يمكن تكرار قياس لفترة أطول اكتساب (الخطوة 5). ل50min-30، يتم الحصول على حصيلة ما يقرب من 10 أضعاف الذروة (وتعول الكل)، ولكن هذا هو وقتا طويلا جدا لحظة الاستحواذ على معظم العينات البيولوجية بسبب الخطر من ادخال القطع الأثرية بسبب حركة العينة، والانجراف المجهر، والضيائية photobleaching.
- حدد عتبة بكسل العالمية القيمة (أعلاه والتي يتم تركيبها في الاضمحلال في بكسل) وتطبيق واحد يصلح الاضمحلال الأسي على الصورة. نتيجة غلة العمر مضان لكل بكسل فوق العتبة، والتي يتم ترميز ثم فياللون. هو لون كل بكسل مع نتيجة لائقا، ويتم الحصول على خريطة فليم. تحقق من انخفاض تشي مربع القيم لمختلف بكسل - حوالي 1 (وتصل إلى 1.3) يدل على حسن صالح. فحص مخلفات المقابلة، والتي ينبغي أن توزع عشوائيا حول الصفر.
- الرسم البياني عمر مضان المؤامرات وكم عمر مضان معينة تحدث مقابل عمر مضان نفسها. ضبط نطاق اللون مثل أن توزيع عمر مضان يلائم نطاق اللون.
- إذا نوبة monoexponential لا تسفر عن قيمة خي مربع من حوالي 1 (وتصل إلى 1.3)، وهناك الانحراف المنهجي للمخلفات من الصفر، وهناك حاجة إلى نموذج أكثر تطورا. على سبيل المثال، حاول تركيب نموذج مزدوج الأسي ليضمحل مضان، على حساب لاثنين من بيئات مختلفة في التحقيق قد يكون فيها ومناسبا سيحقق أيضا عوامل ما قبل الأسي أو سعة والتي تعطي مؤشرا على مبلغ قريب من صبغة واحدة البيئيةمنة أو من جهة أخرى. بدلا من ذلك، قد امتدت وظيفة الأسي تكون ملائمة لرصد عملية توزيع عمر مضان.
- ويمكن بعد ذلك نتائج لأعمار مضان، وعوامل ما قبل الأسي، ونسبة العمر، ونسبة عامل قبل الأسي لكل بكسل يتم تشفيرها في اللون. كل بكسل غير ملون وفقا لقيمتها، ويتم الحصول على النقيض من ذلك بسبب عمر مضان، وعوامل ما قبل الأسي والنسب. مرة أخرى، والتحقق من انخفاض تشي مربع القيم (التي يمكن أيضا أن يتم تشفيرها في اللون ويظهر على شكل صورة) - حوالي 1 (وتصل إلى 1.3) يدل على حسن صالح. فحص مخلفات، والتي ينبغي أن توزع عشوائيا حول الصفر.
- وينبغي أن المدرج الاحصائي عمر مضان مرافقة جميع الصور للمن السهل تصور متوسط القيم عمر مضان، وتوزيع عمر مضان.
3. ممثل النتائج
يضمحل مضان قياس للوتظهر الدوار فلوري الجزيئية إلى زيادة اللزوجة في الميثانول / الجلسرين مخاليط في الشكل. 2. ويضمحل مضان هي monoexponential، وعمر مضان يختلف بشكل ملحوظ بوصفها وظيفة من اللزوجة. لأنه يزيد من حوالي 300 فرع فلسطين في الميثانول (اللزوجة 0.6 CP) إلى 3.4 نانوثانية في الجلسرين 95٪ (950 اللزوجة CP).
الشكل 2. ملامح الاضمحلال الإسفار عن BODIPY-C 12 في الميثانول / الجلسرين خليط من اللزوجة متفاوتة. 6
المؤامرة معايرة لوغاريتمي من عمر مضان τ مقابل يظهر اللزوجة η لدوار الجزيئية فلوري في الشكل. 3. هذا هو خط مستقيم كما طالب المعادلة هوفمان فورستر 9
حيث ك 0 هو radiativ معدل ثابت ه، و z و x هي ثوابت، مع 0 <س <1. أخذ اللوغاريتم على غلة الجانبين على حد سواء
حيث x هو التدرج في خط مستقيم.
الشكل 3. قطعة من اللزوجة سجل عمر مضان سجل للمباراة BODIPY-C غلة 12 خط مستقيم وفقا لمعادلة فورستر، هوفمان. 6
بعد حضانة الخلايا الحية مع الدوار الجزيئية فلوري لوحظ توزيع صبغ منقط في الصور مضان. وتظهر الصور فليم من خلايا هيلا حضنت مع صبغة BODIPY المتوسط واستبداله في الشكل. 4. ويمكن أن يضمحل مضان في كل بكسل من الصورة مجهزة بشكل كاف باستخدام نموذج واحد الاضمحلال الأسي.
> 
الشكل 4 (أ) شدة الإسفار والصور فليم (ب) من خلايا هيلا ملطخة BODIPY-C 12. ومشرق، والمناطق نقط يحمل أقصر مدى الحياة من مناطق أخرى. هذا أقصر liftime يتوافق مع انخفاض اللزوجة في نقاط و، قطرات الدهن على الأرجح، وفقا للمعادلة فورستر، هوفمان.
بواسطة المتهم بالتآمر في أعمار المستخرجة من كل بكسل، نحصل على الرسم البياني عمر مضان من الصورة بأكملها كما هو مبين في الشكل. 5.
الشكل 5. المدرج الإحصائي من عمر مضان من الصور فليم من خلايا هيلا ملطخة المتوسط واستبدال الدوارات الجزيئية BODIPY.
Discussion
فليم يقدم بعض المزايا الرئيسية على مدى شدة القائم على التصوير مضان. يمكن أن يقدم تقريرا عن أحداث photophysical أن من الصعب أو المستحيل لمراقبة من قبل التصوير كثافة مضان، لأنه لا يمكن فصلها عن التأثيرات تركيز fluorophore. هذا مفيد جدا لرسم خرائط لزوجة داخل الخلايا بواسطة الدوارات التصوير الجزيئي فلوري. ويمكن بسهولة عمر مضان أن تتحول إلى اللزوجة باستخدام الرسم البياني معايرة، كما هو مبين في الشكل. 3، ومستقلة عن تركيز الدوارات الجزيئية فلوري.
في فليم قد تكون هناك القطع الأثرية التي يمكن أن تعقد تفسير البيانات. 10 التحف الآلي وتشمل الضوء المتناثرة والتي ستظهر باعتبارها ذروة على رأس بداية الاضمحلال مضان، ويجوز الخلط بينه وبين زمن الاضمحلال قصير، أو ذروة صغيرة بعد الحرية الدينية الدولية والتي قد تكون ناجمة عن انعكاسات داخل المجهر. يمكن التعرف على هذه التحف الضوء المتناثرة على هذا النحولأنه لا يمكن تمييزها مع التمييز الطيفية - هم دائما على نفس الموجة مثل ضوء مثيرة. نتذكر أن في الهواء، وعلى ضوء يسافر 30 سم في 1 النانوسيكند تساعد على تحديد الأصل من الأفكار.
ويمكن تصفية أو مضان زجاج تسبب أيضا قطعة أثرية، لا سيما في مضان عينة منخفض، ولكن يمكن بسهولة تحديد هذا عن طريق أخذ عينة من دون قياس: إذا تم الحصول على الاضمحلال في ظل هذه الظروف، فإن ذلك يرجع إلى وثيقة وليس له اي علاقة مع عينة! من ناحية أخرى، نلاحظ أن تألق ذاتي عينة يمكن أن تسهم أيضا إلى الاضمحلال مضان.
في الوقت مترابطة العد فوتون واحد (TCSPC)، الوقت للوصول الى سعة المحول (TAC) يجوز لغير linearities يسبب نوبات الفقراء، ولكن يمكن تحديدها من خلال منع الإثارة وتسليط الضوء، على سبيل المثال المحيطة من مصدر الضوء ينتقل على العينة وقياس توقيت. وينبغي أن تكون خلفية ثابتةتم الحصول عليها في كل بكسل من الصورة. والمناطق التي يكون فيها الانحراف عن خلفية ثابت يحدث، وتستسلم أبدا مناسبا، وينبغي تجنبها للقياس إذا لا يمكن القضاء عليها عن طريق ضبط المعلمات من أجل بطاقة TCSPC.
واحد القطع الأثرية الشهيرة في TCSPC هو الفوتون كومة المتابعة والذي كان سببه أيضا ارتفاع معدل كشف الفوتون. 11،12 وهذا يؤدي إلى الفوتون الأول فقط يجري توقيتها، وتجاهل أي الفوتونات لاحقة، لأن الإلكترونيات هي توقيت مشغول وتجهيز الفوتون الأول. كومة المتابعة يؤدي الى تقصير عمر مضان، وأفضل طريقة لتجنب هذا هو الحفاظ على معدل العد فوتون في حوالي 1٪ من معدل تكرار ليزر.
توقعات
وهناك تطبيقات مختلفة من فليم، واعتمادا على التطبيق، كل له مزاياه وعيوبه. (13) مجهر مضان المثالي والحصول على كامل متعدد الأبعاد مضان emissioن من كفاف، شدة الموقف، والطول الموجي، مدى الحياة، والاستقطاب في قياس واحد، مع حساسية فوتون واحد، القرار المكانية القصوى والدنيا وقت الشراء. لا يوجد حاليا أي تكنولوجيا مع هذا مزيج فريد من السمات، وإلى بناء واحد لا يزال يشكل تحديا لمطوري الأجهزة. تطبيق تقنيات جديدة لمشاكل مادية هامة في بيولوجيا الخلية وغالبا ما يكون الطريق إلى اكتشافات غير متوقعة، وهناك طريق طويل يتعين قطعه قبل ونحن على مقربة من تشبع قدرات التصوير مضان لبيولوجيا الخلية. في الواقع، والتصوير المعلمات مضان مثل العمر، والطيف، والاستقطاب، فضلا عن التصوير بسرعة أكبر في 3D في أعلى المكاني القرار، من المؤكد أن تكشف عن جوانب جديدة في بيولوجيا الخلايا.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
مخك بفضل الهندسة في المملكة المتحدة، والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EPSRC) واجهة برنامج علوم الحياة لزمالة الشخصية. ونود أيضا أن نعترف التمويل بواسطة التكنولوجيا الحيوية في المملكة المتحدة، والعلوم البيولوجية في مجلس البحوث (BBSRC).
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
References
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area. International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).
- Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269, 847-850 (1995).
- Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).
- Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A. Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. Demchenko, A. P. 8, Springer. Berlin Heidelberg. 267-308 (2010).
- Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4, (2010).
- Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).
- Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).
- Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes. J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).
- Förster, T., Hoffmann, G. Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme. Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).
- vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. J. Fluores. 15, 377-413 (2005).
- Becker, W. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , Springer. (2005).
- O'Connor, D. V., Phillips, D. Time-correlated single-photon counting. , Academic Press. New York. (1984).
- Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).
