Summary
प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग (flim) एक प्रमुख पर्यावरण और छवि विशिष्ट प्रोटीन और जीवित कोशिकाओं में रंगों की बातचीत करने के लिए तकनीक के रूप में उभरा है. फ्लोरोसेंट आणविक रोटार के flim जीवित कोशिकाओं में चिपचिपापन की मैपिंग की अनुमति देता है.
Protocol
flim नमूना तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल confocal या व्यापक क्षेत्र तीव्रता आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए उन से अलग नहीं है. डाटा अधिग्रहण डेटा विश्लेषण का मुख्य कार्य के द्वारा पीछा किया जाता है, यानी कच्चे डेटा से प्रतिदीप्ति जन्मों निकालने. एक बार इन प्राप्त किया गया है, डेटा व्याख्या में मदद करता है सत्यापित करने के लिए या hypotheses के मिथ्या सिद्ध करना.
1. आणविक रोटार के साथ धुंधला हो जाना कोशिकाओं
- स्टॉक समाधान (10 मिलीलीटर) की तैयारी में लगभग 1 / डाई की मिलीग्राम मिलीग्राम भंग द्वारा एक उपयुक्त विलायक (उदाहरण के लिए 12 BODIPY - सी के लिए मेथनॉल) 6,7 एक सही संतुलन और एक विंदुक का उपयोग.
- कोशिकाओं (एक मॉडल कैंसर सेल, हमारे मामले में लाइन HeLa) दाग हो पर एक multiwell थाली में बड़े हो रहे हैं माइक्रोस्कोपी coverslide नीचे के साथ, एक मशीन में 37 ° C पर एक 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ ~ 80% संगामी तक .
- 10 जोड़ें रहने वाले एक बहु wel में बढ़ कोशिकाओं को स्टॉक समाधान के 20 μlOpti-सदस्य (GIBCO) मध्यम 6 अच्छी तरह से एक थाली के लिए प्रति अच्छी तरह के 4 मिलीलीटर में मैं थाली (SmartSlide 50 सूक्ष्म ऊष्मायन प्रणाली, WaferGen) के. यह एक माइक्रो दाढ़ अच्छी तरह से डाई एकाग्रता पैदावार.
- एक मशीन के लिए 37 ° सी में धुंधला के लिए 10-45 मिनट के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ बहु - अच्छी तरह से थाली पर लौटें.
- इनक्यूबेटर से multiwell थाली निकालें और कोशिकाओं को 4 मिली ऑप्टिकली स्पष्ट सेल संस्कृति (जैसे सदस्य - ऑप्टी) के माध्यम से अतिरिक्त डाई को हटाने के साथ 3-4 बार धो लो.
- खुर्दबीन मंच multiwell थाली को हस्तांतरण और तापमान नियंत्रक / 5% सीओ 2 गैस प्रवेश करने के लिए कनेक्ट के रूप में आवश्यक इमेजिंग के लिए तैयारी में है.
2. कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट आणविक रोटार के flim
- खुर्दबीन मंच पर नमूना प्लेस और एक संचरण और प्रतिदीप्ति फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की पहचान की छवि प्राप्त है. प्रयोगात्मक सेट अप के एक योजनाबद्ध आरेख छवि में दिखाया गया है. 1.Verify कि स्थानों के अनुभव से प्रतिदीप्ति उत्पन्नcted (कोशिका झिल्ली जैसे, cytoplasm). एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए, और सत्यापित करें कि यह डाई या प्रोटीन की उम्मीद की है, इस मामले में आणविक रोटर के स्पेक्ट्रम. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, गैर से सना हुआ एक नमूना छवि और सत्यापित करें कि यह प्रतिदीप्ति नहीं करता है. हालांकि इस कदम के लिए आवश्यक विशेष रूप से flim के लिए नहीं है, यह सामान्य में अच्छा अभ्यास है और सत्यापित करें कि नमूना है कि तुम क्या लगता है कि यह है मदद.
- Flim मोड में स्विच करें - यह आसानी से एक दर्पण प्रतिदीप्ति पता लगाने किरण पथ ("" किरण पथ सेटिंग "Leica टीसीएस SP2 अधिग्रहण नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर पैनल पर बाहरी डिटेक्टर" बटन) के बाहर के द्वारा पूरा किया है. एक उपयुक्त प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के डिटेक्टर तक पहुँचने से किसी भी रोमांचक प्रकाश ब्लॉक फिल्टर प्रतिदीप्ति पता लगाने beampath में होना चाहिए.
चित्रा 1 एसी का उपयोग कर समय डोमेन flim के लिए प्रायोगिक व्यवस्था.onfocal लेजर खुर्दबीन स्कैनिंग.
- नमूना स्कैन और flim अधिग्रहण नियंत्रित कंप्यूटर पर जाँच, कि डिटेक्टर गिनती दर (काले अधिग्रहण बेकर और Hickl छठे वेतन आयोग 830 बोर्ड के नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर CFD पट्टी लेबल) लेजर पुनरावृत्ति दर के बारे में 1% से अधिक है ( हरे रंग की पट्टी सिंक अधिग्रहण नियंत्रण सॉफ्टवेयर लेबल). अगर ऐसा है, लेजर बीम पथ में एक तटस्थ घनत्व फिल्टर रखकर लेजर उत्तेजना तीव्रता, जैसे कम करने के लिए संग्रह से बचने के ढेर विकृत प्रतिदीप्ति क्षय घटता.
- Flim छवि अधिग्रहण, आम तौर पर 3-5 मिनट के लिए, स्कैनिंग रोक और कच्चे डेटा (एक 3 डी डेटा "घन" स्थानिक निर्देशांक x और y से मिलकर, और समय) को बचाने के.
- प्रतिदीप्ति क्षय विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज में कच्चे 14 त्रिकोणीय 2 या वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर, प्रतिदीप्ति तीव्रता छवि प्रदर्शित उदाहरण के लिए, डेटा को खोलें. यह बस एकीकृत प्रतिदीप्ति क्षय के, प्रतिदीप्ति क्षय वक्र के तहत प्रत्येक क्षेत्र में, अर्थात्पिक्सेल.
- यह पर कर्सर रखकर एक ठेठ पिक्सेल का चयन करें, और कि पिक्सेल में प्रतिदीप्ति क्षय का निरीक्षण किया. यदि शिखर गिनती 100 से नीचे है, पिक्सल के स्थानिक binning का उपयोग करें. आसन्न पिक्सल (जैसे 3x3 या 5x5) की गिनती केंद्रीय पिक्सेल में जोड़ रहे हैं, ताकि वहाँ एक उच्च शिखर गिनती प्राप्त की है. यह अगले कदम के लिए एक उच्च सांख्यिकीय सटीकता प्रदान करता है. वैकल्पिक रूप से, माप अब अधिग्रहण के समय (5 कदम) के लिए दोहराया जा सकता है. 30-50min के लिए, एक लगभग 10 बार उच्च शिखर गिनती (और कुल मायने रखता है) प्राप्त की है, लेकिन यह भी लंबे समय तक सबसे जैविक नमूने के लिए एक नमूना आंदोलन की वजह से कलाकृतियों, खुर्दबीन बहाव, phototoxicity और शुरू करने के खतरे की वजह से अधिग्रहण का समय है photobleaching.
- एक वैश्विक पिक्सेल सीमा मान (जो ऊपर एक पिक्सेल में क्षय फिट है) का चयन करें और एक एक घातीय क्षय छवि फिट लागू होते हैं. परिणाम सीमा से ऊपर प्रत्येक पिक्सेल के लिए प्रतिदीप्ति जीवन है, जो तब में एन्कोडेड है पैदावाररंग. प्रत्येक पिक्सेल फिट के परिणाम के साथ रंग का है, और flim नक्शा प्राप्त की है. विभिन्न पिक्सल के लिए कम ची - वर्ग मान जांच में लगभग 1 (1.3) के लिए एक अच्छी फिट इंगित करता है. इसी बच गया, जो बेतरतीब ढंग से शून्य के आसपास वितरित किया जाना चाहिए का निरीक्षण किया.
- प्रतिदीप्ति जीवनकाल हिस्टोग्राम भूखंडों अक्सर कैसे कुछ प्रतिदीप्ति जन्मों बनाम प्रतिदीप्ति जीवनकाल में ही होते हैं. रंग रेंज जैसे कि प्रतिदीप्ति जीवनकाल वितरण रंग रेंज में फिट बैठता है समायोजित करें.
- यदि एक monoexponential फिट लगभग 1 के एक मूल्य ची - वर्ग (और 1.3) की उपज नहीं है, और वहाँ शून्य से बच व्यवस्थित विचलन है, एक और अधिक परिष्कृत मॉडल की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, प्रतिदीप्ति decays एक डबल घातीय मॉडल फिटिंग, दो अलग अलग वातावरण जांच अंदर फिट भी पूर्व घातीय कारकों या आयाम है जो एक में डाई के रिश्तेदार राशि का एक संकेत दे निकलेगा हो सकता है के लिए खाते में करने की कोशिश सीमानाअन्य या बयान. वैकल्पिक रूप से, एक बढ़ाकर घातीय समारोह प्रतिदीप्ति जन्मों के वितरण के लिए खाते के लिए उपयुक्त हो सकता है.
- प्रतिदीप्ति जन्मों, पूर्व घातीय कारकों, और जीवन भर के अनुपात प्रत्येक पिक्सेल के लिए और कारक पूर्व घातीय अनुपात के लिए परिणाम फिर रंग में encoded किया जा सकता है. अपने मूल्य के अनुसार प्रत्येक पिक्सेल रंग है, और प्रतिदीप्ति जन्मों, पूर्व घातीय कारक है और उनके अनुपात के कारण विपरीत प्राप्त है. फिर से, कम ची - वर्ग मान (जो भी रंग में इनकोड किया जा सकता है और एक छवि के रूप में प्रदर्शित) की जांच लगभग 1 (1.3) एक अच्छी फिट इंगित करता है. बच गया, जो बेतरतीब ढंग से शून्य के आसपास वितरित किया जाना चाहिए का निरीक्षण किया.
- प्रतिदीप्ति जीवनकाल histograms औसत प्रतिदीप्ति जीवनकाल मूल्यों की आसान दृश्य है, और प्रतिदीप्ति जीवनकाल वितरण के लिए सभी छवियों के साथ करना चाहिए.
3. प्रतिनिधि परिणाम
प्रतिदीप्ति decays के लिए मापा/ मेथनॉल ग्लिसरॉल मिश्रण में चिपचिपापन बढ़ रही है पर फ्लोरोसेंट आणविक रोटर छवि में दिखाया जाता है. 2. प्रतिदीप्ति decays monoexponential हैं, और प्रतिदीप्ति आजीवन चिपचिपाहट के एक समारोह के रूप में स्पष्ट रूप से भिन्न होता है. यह लगभग 300 मेथनॉल में पी एस (चिपचिपापन 0.6 सी.पी.) से 95% ग्लिसरॉल (चिपचिपाहट 950 cp) में 3.4 एनएस के लिए बढ़ जाती है.
चित्रा 2 BODIPY सी के लिए प्रतिदीप्ति क्षय प्रोफाइल अलग दलदलापन के मिश्रण में मेथनॉल ग्लिसरॉल / 12 6.
प्रतिदीप्ति जीवन भर के लघुगणक अंशांकन साजिश τ बनाम फ्लोरोसेंट आणविक रोटर के लिए चिपचिपापन η छवि में दिखाया गया है. 3. यह एक सीधी रेखा के रूप में Forster हॉफमैन 9 समीकरण द्वारा की मांग की
जहां कश्मीर 0 radiativ हैई स्थिर दर, और स्थिरांक जेड और एक्स 0 <x <1 के साथ, कर रहे हैं. दोनों पक्षों की पैदावार पर लघुगणक ले रहा है
जहाँ x सीधी रेखा की ढाल है.
चित्रा 3. BODIPY - सी 12 एक सीधी रेखा की पैदावार के लिए लॉग प्रतिदीप्ति आजीवन बनाम लॉग चिपचिपापन के Forster - Hoffmann समीकरण के अनुसार भूखंड 6
फ्लोरोसेंट आणविक रोटर साथ में जीवित कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद एक कबरा डाई वितरण प्रतिदीप्ति छवियों में मनाया जाता है. HeLa एक meso-प्रतिस्थापित BODIPY डाई के साथ incubated कोशिकाओं के flim छवियाँ छवि में दिखाया जाता है. 4. छवि के हर पिक्सेल में प्रतिदीप्ति decays पर्याप्त रूप से एक एकल घातीय क्षय मॉडल का उपयोग फिट कर सकते हैं.
चित्रा 4 (क) प्रतिदीप्ति तीव्रता और (ख) HeLa 12 BODIPY - सी के साथ दाग कोशिकाओं की छवियों flim. उज्ज्वल, टोकना क्षेत्रों अन्य क्षेत्रों की तुलना में एक छोटे जीवनकाल दिखा रहे हैं. इस छोटे liftime puncta में कम दलदलापन, शायद लिपिड बूंदों से मेल खाती है Forster - Hoffmann समीकरण के अनुसार.
हर पिक्सेल से निकाले जन्मों की साजिश रचने के द्वारा, हम पूरी छवि की एक प्रतिदीप्ति जीवनकाल हिस्टोग्राम के रूप में छवि में दिखाया गया प्राप्त करते हैं. 5.
चित्रा 5 HELA कोशिकाओं के flim छवियों meso-प्रतिस्थापित BODIPY आणविक रोटार के साथ दाग से प्रतिदीप्ति जन्मों की Histograms.
Discussion
Flim तीव्रता आधारित प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर कुछ महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. यह photophysical घटनाओं है कि मुश्किल या असंभव प्रतिदीप्ति तीव्रता इमेजिंग के द्वारा निरीक्षण कर रहे हैं पर रिपोर्ट है, क्योंकि यह उन्हें fluorophore एकाग्रता प्रभाव से अलग नहीं कर सकता कर सकते हैं. यह इमेजिंग फ्लोरोसेंट आणविक रोटार द्वारा intracellular चिपचिपापन मानचित्रण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. प्रतिदीप्ति जीवनकाल चिपचिपाहट का उपयोग कर एक अंशांकन ग्राफ में आसानी से परिवर्तित किया जा सकता है, के रूप में चित्र में दिखाया. 3, फ्लोरोसेंट आणविक रोटार की एकाग्रता के स्वतंत्र है.
Flim में कलाकृतियों कि डेटा व्याख्या जटिल हो सकता है 10 वी कलाकृतियों. बिखरे हुए प्रकाश प्रतिदीप्ति क्षय की शुरुआत के शीर्ष पर एक चोटी के रूप में दिखाने के लिए और एक कम क्षय समय के साथ भ्रमित किया जा सकता है, या के बाद एक छोटी सी चोटी शामिल IRF जो माइक्रोस्कोप के अंदर प्रतिबिंब के कारण हो सकता है. ये बिखरे हुए प्रकाश कलाकृतियों इस तरह के रूप में पहचाना जा सकता हैक्योंकि वे वर्णक्रमीय भेदभाव के साथ प्रतिष्ठित किया जा सकता है - वे रोमांचक प्रकाश के रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य में हमेशा से रहे हैं. याद है कि हवा में प्रकाश 1 nanosecond में 30 सेमी की यात्रा करने के लिए प्रतिबिंब का मूल पहचानने में मदद करता है.
फ़िल्टर या गिलास प्रतिदीप्ति भी एक artifact का कारण बन सकता है, कम नमूना प्रतिदीप्ति पर विशेष रूप से, लेकिन इस नमूना बिना माप लेने के द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है: अगर एक क्षय इन परिस्थितियों में प्राप्त की है, यह साधन के कारण है और कुछ नहीं करना है नमूने के साथ! दूसरी ओर, ध्यान दें कि नमूना autofluorescence भी एक प्रतिदीप्ति क्षय के लिए योगदान कर सकते हैं.
(TCSPC) के समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती, समय से आयाम कनवर्टर (टीएसी) गैर linearities गरीब फिट बैठता हो, लेकिन हो सकता है उत्तेजना अवरुद्ध और नमूना पर परिवेश, पारेषित प्रकाश स्रोत से प्रकाश जैसे चमक द्वारा पहचाना जा सकता है और समय को मापने. निरंतर पृष्ठभूमि होना चाहिएछवि के प्रत्येक पिक्सेल में प्राप्त है. क्षेत्र जहां एक निरंतर पृष्ठभूमि से विचलन होते हैं, एक अच्छा फिट नहीं उपज और माप के लिए बचा जाना चाहिए अगर वे TCSPC कार्ड के लिए मापदंडों का समायोजन द्वारा समाप्त नहीं किया जा सकता है.
एक TCSPC में कुख्यात विरूपण साक्ष्य फोटॉन ढेर के ऊपर है जो बहुत अधिक एक फोटान का पता लगाने की दर के कारण होता है 11,12 यह केवल पहली फोटॉन समय पर जा रहा होता है, बाद में किसी भी फोटॉनों की अनदेखी क्योंकि इलेक्ट्रॉनिक्स व्यस्त समय कर रहे हैं और पहली फोटॉन प्रसंस्करण के. प्रतिदीप्ति जीवन भर का एक छोटा है, और इस से बचने का सबसे अच्छा तरीका करने के लिए ढेर के ऊपर होता है लेजर पुनरावृत्ति दर का लगभग 1% पर फोटोन गिनती दर बनाए रखना है.
दृष्टिकोण
Flim के विभिन्न implementations कर रहे हैं, और आवेदन के आधार पर, प्रत्येक के अपने फायदे और कमियां है 13 आदर्श प्रतिदीप्ति खुर्दबीन प्राप्त होगा. पूरे बहुआयामी प्रतिदीप्ति घावतीव्रता, स्थिति, जीवन भर, तरंगदैर्ध्य और एक ही माप में ध्रुवीकरण एक फोटान संवेदनशीलता, अधिकतम स्थानिक संकल्प और न्यूनतम अधिग्रहण के समय के साथ, n समोच्च. वर्तमान सुविधाओं के इस अद्वितीय संयोजन के साथ कोई तकनीक है, और एक का निर्माण उपकरण के डेवलपर्स के लिए एक चुनौती बनी हुई है. नई भौतिक तकनीक की कोशिका जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण समस्याओं के लिए आवेदन अक्सर अप्रत्याशित खोजों के लिए पथ है, और वहाँ के लिए एक लंबा रास्ता जाने से पहले हम कोशिका जीव विज्ञान के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग की क्षमताओं saturating के करीब हैं. दरअसल, जीवनकाल, स्पेक्ट्रम और ध्रुवीकरण, साथ ही उच्च स्थानिक संकल्प पर 3 डी में और अधिक तेजी से इमेजिंग जैसे इमेजिंग प्रतिदीप्ति पैरामीटर, कोशिका जीव विज्ञान में नए पहलुओं को उजागर करने के लिए कुछ कर रहे हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
MKK ब्रिटेन की इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (EPSRC) जीवन विज्ञान एक निजी फैलोशिप के लिए इंटरफ़ेस कार्यक्रम धन्यवाद. हम भी ब्रिटेन के जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) से धन स्वीकार करना होगा.
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
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