Fluorescens Lifetime Imaging of Molecular Rotorer i levende celler

Summary

Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM) har dukket opp som en nøkkel teknikk til bilde miljøet og samspillet av spesifikke proteiner og fargestoffer i levende celler. FLIM av fluorescerende molekylære rotorer tillater kartlegging av viskositet i levende celler.

Abstract

Diffusjon er ofte en viktig sats-bestemme trinn i kjemiske reaksjoner eller biologiske prosesser, og spiller en rolle i et bredt spekter av intracellulære hendelser. Viskositet er en av de viktigste parametrene som påvirker spredningen av molekyler og proteiner, og endringer i viskositet har vært knyttet til sykdom og funksjonssvikt på cellenivå. ^1-3 Mens metoder for å måle bulk viskositet er godt utviklet, fortsatt bildebehandling microviscosity en utfordring . Viskositet kart av mikroskopiske objekter, for eksempel enkeltceller, har inntil nylig vært vanskelig å skaffe. Kartlegging viskositet med fluorescens teknikker er en fordel fordi, i likhet med andre optiske teknikker, er det minimalt invasiv, ikke-destruktiv og kan brukes på levende celler og vev.

Fluorescent molekylære rotorer viser fluorescens levetid og kvante avkastning som er en funksjon av viskositet mikromiljøet deres. ^4,5 intramolekulære vridning ellerrotasjon fører til ikke-strålingen forfall fra opphisset tilstand tilbake til grunntilstanden. En tyktflytende miljø bremser dette rotasjon eller vridning, begrense tilgang til denne ikke-strålingen forfall veien. Dette fører til en økning i fluorescens kvanteutbytte og fluorescens levetid. Fluorescens Lifetime Imaging (FLIM) av modifiserte hydrofobe BODIPY fargestoffer som fungerer som fluorescerende molekylære rotorer viser at fluorescens levetid disse sonder er en funksjon av microviscosity av sine omgivelser. ^6-8 En logaritmisk plott av fluorescens levetid versus løsningsmiddelet viskositet gir en rett linje som lystrer Förster Hoffman ligningen. ⁹ Denne tomten fungerer også som en kalibrering graf å konvertere fluorescens levetid til viskositet.

Etter inkubasjon av levende celler med modifisert BODIPY fluorescerende molekyl rotoren, er en punktformet fargestoff fordeling observert i fluorescens bildene. Viskositet Verdien innhentet i the puncta i levende celler er rundt 100 ganger høyere enn for vann og mobilnettet cytoplasma. ^6,7 Tid-løst fluorescens anisotropi målinger gi rotasjons korrelasjon ganger i avtale med disse store microviscosity verdiene. Kartlegging av fluorescens levetid er uavhengig av fluorescens intensitet, og dermed tillater separasjon av sonden konsentrasjon og viskositet effekter.

I sammendraget har vi utviklet en praktisk og allsidig tilnærming til å kartlegge microviscosity i celler basert på FLIM av fluorescerende molekylære rotorer.

Protocol

Protokollene for FLIM prøveopparbeidelse skiller seg ikke fra dem for confocal eller bred-feltet intensitet-baserte fluorescens mikroskopi. Datainnsamlingen er etterfulgt av hovedoppgave dataanalyse, dvs. trekke fluorescens levetid fra rådataene. Når disse har blitt oppnådd, hjelper tolking å verifisere eller forfalske hypoteser.

1. Fargeløsninger celler med molekylære rotorer

1. Forbered en stamløsning (10 ml) ved å løse ca 1 mg / ml av fargestoff i et passende løsemiddel (f.eks metanol for BODIPY-C ₁₂₎ ^6,7 ved hjelp av en nøyaktig balanse og en pipette.
2. Cellene (en modell kreft cellelinje, Helà i vårt tilfelle) for å være beiset er dyrket på i en multiwell plate med en coverslide underside for mikroskopi, i en inkubator ved 37 ° C med en 5% CO ₂ atmosfæren til ~ 80% konfluent .
3. Legg 10-20 mL av stamløsningen til de levende cellene vokser i en multi-well plate (SmartSlide 50 mikro-inkubasjon system, Wafergen) i 4 ml Opti-MEM medium (GIBCO) per brønn for en seks-brønns plate. Dette gir en mikro-molar dye konsentrasjonen i brønnen.
4. Returner multi-brønn plate til en inkubator ved 37 ° C med en 5% CO ₂ atmosfæren for 10-45 minutter for farging.
5. Fjern multiwell platen fra inkubatoren og vaske cellene 3-4 ganger med 4 ml optisk klart cellekultur medium (f.eks Opti-MEM) for å fjerne overflødig farge.
6. Overfør multiwell plate til mikroskopet scenen og koble til en temperatur kontrolleren / 5% CO ₂ gass innløp som kreves, i forberedelse for bildebehandling.

2. FLIM av fluorescerende molekylære rotorer i celler

1. Plasser prøven på mikroskopet scenen og få en overføring og fluorescens bilde å identifisere fluorescerende celler. En prinsippskisse av det eksperimentelle oppsettet er vist i fig. 1.Verify at fluorescens utgår fra steder erfacted (f.eks cellemembranen, cytoplasma). Skaff en fluorescens utslipp spektrum, og bekrefte at det er at av fargestoff eller protein forventet, i dette tilfellet spekteret av molekylære rotoren. Som en negativ kontroll, image en ikke-farget prøven og verifisere at den ikke fluoresce. Selv om dette trinnet er ikke viktig spesielt for FLIM, er det god praksis generelt og hjelper til å kontrollere at prøven er hva du tror det er.
2. Bytt til FLIM modus - dette gjør du enkelt ved å flytte et speil ut av fluorescens deteksjon strålebanen ("ekstern detektor" knappen på "strålebanen setting" panel på Leica TCS SP2 oppkjøpet kontroll programvare). En passende fluorescens utslipp filter for å blokkere ethvert spennende lys fra å nå detektoren må være i fluorescens deteksjon beampath.

Figur 1. Experimental ordning for tid-domene FLIM bruke aconfocal laserskanning mikroskop.

3. Skann prøven og sjekk på datamaskinen styrer FLIM oppkjøpet, at detektoren teller rate (svart strek merket CFD på kjøp kontroll programvare av Becker & Hickl SPC 830 bord) er ikke mer enn ca 1% av laser repetisjon rate ( grønn linje merket SYNC oppkjøpet kontroll programvare). Hvis det er, redusere laser eksitasjon intensitet, f.eks ved å plassere en nøytral tetthet filter i laserstrålen banen, for å unngå innsamling haug-up forvrengte fluorescens forfall kurver.
4. Erverve en FLIM bilde, typisk for 3-5 min, stoppe skanning og lagre rådataene (en 3D-data "kuben" bestående av romlig koordinater x og y, og tid).
5. Åpne rådata i fluorescens forfallet analyse programvarepakke, for eksempel TRI-2 ¹⁴ eller kommersiell programvare, for å vise fluorescensintensiteten bildet. Dette er ganske enkelt den integrerte fluorescens forfall, dvs. arealet under fluorescens forfall kurven, i hvertpiksel.
6. Velg en typisk piksel ved å plassere markøren på det, og inspisere fluorescens forfall i det pixel. Hvis peak teller er under 100, bruk romlig Binning av piksler. De tellinger av tilstøtende bildepunkter (f.eks 3x3 eller 5x5) er lagt inn i den sentrale pixel, slik at en høyere topp teller er fremstilt der. Dette gir en høyere statistisk nøyaktighet for neste trinn. Alternativt kunne målingen gjentas for en lengre oppkjøp tid (trinn 5). For 30-50min, er en ca 10 ganger høyere peak count (og totaltellinger) innhentet, men dette er altfor lenge et oppkjøp tid for de fleste biologiske prøver på grunn av faren for å introdusere gjenstander på grunn av prøven bevegelse, mikroskop drift, fototoksisitet og photobleaching.
7. Velg en global pixel terskelverdi (over hvor forfallet i en piksel er montert) og påfør et enkelt eksponentiell tilpasning til bildet. Resultatet gir en fluorescens levetid for hver piksel over terskelen, som deretter kodet ifarge. Hver piksel er farget med resultatet av passform, og en FLIM kart oppnås. Sjekk de reduserte chi-kvadrat verdier for ulike piksler - rundt 1 (og opp til 1.3) indikerer en god passform. Inspiser tilsvarende residualene, som bør være tilfeldig fordelt rundt null.
8. Fluorescens levetid histogram plotter hvor ofte visse fluorescens levetid oppstå versus fluorescens levetid selv. Juster fargeområdet slik at fluorescens levetid fordeling passer inn fargeområdet.
9. Hvis en monoexponential passform ikke gir en chi-kvadrat verdi på rundt 1 (og opp til 1.3), og det er en systematisk avvik residualene fra null, er en mer sofistikert modell nødvendig. For eksempel prøve å montere en dobbel eksponentiell modell til fluorescens henfall, å ta hensyn til to ulike miljøer sonden kan være i. passform vil også gi de pre-eksponensielle faktorer eller amplituder som gir en indikasjon på den relative mengden av fargestoff i en miljøutvikling eller den andre. Alternativt kan en strukket eksponentiell funksjon være riktig å stå for en fordeling av fluorescens levetid.
10. Resultatene for fluorescens levetid, pre-eksponensielle faktorene, og levetiden forholdet og pre-eksponentielle faktor ratio for hver piksel kan deretter kodes i farger. Hver piksel er farget i henhold til dens verdi, og kontrast på grunn av fluorescens levetid, pre-eksponensielle faktorer og deres forholdstall oppnås. Igjen, sjekk de reduserte chi-kvadrat verdier (som også kan kodes i farge og vises som et bilde) - ca 1 (og opp til 1.3) viser en god passform. Inspiser residualene, som bør være tilfeldig fordelt rundt null.
11. Fluorescens levetid histogrammer bør følge alle bildene for enkel visualisering av gjennomsnittlig fluorescens levetid verdier, og fluorescens levetid fordeling.

3. Representative Resultater

Fluorescens henfall målt forden fluorescerende molekylær rotoren på å øke viskositet i metanol / glyserol blandinger er vist i fig. 2. Fluorescens henfall er monoexponential, og fluorescens levetid varierer markert som en funksjon av viskositet. Det øker fra rundt 300 ps i metanol (viskositet 0,6 cP) til 3,4 ns i 95% glyserol (viskositet 950 cP).

Figur 2. Fluorescens forfallet profiler for BODIPY-C ₁₂ i metanol / glyserol blandinger av ulik viskositet. ⁶

Det logaritmiske kalibrering plott av fluorescens livs τ versus viskositet η for fluorescerende molekylær rotoren er vist i fig. 3. Det er en rett linje som kreves av Förster Hoffman ligningen ⁹

hvor k ₀ er radiative hastighetskonstanten, og z og x er konstanter, med 0 <x <1. Tar logaritmen på begge sider gir

der x er gradient av den rette linjen.

Figur 3. En tomt på logg fluorescens livs vs logg viskositet for BODIPY-C ₁₂ gir en rett linje i samsvar med Förster-Hoffmann ligning. ⁶

Etter inkubasjon av levende celler med fluorescerende molekylære rotoren en punktformet fargestoff distribusjon er observert i fluorescens bildene. FLIM bilder av Jakten celler inkubert med en meso-substituert BODIPY fargestoff er vist i fig. 4. Fluorescens henfall i hvert piksel i bildet kan være tilstrekkelig utstyrt med en enkelt eksponentiell modell.

Figur 4. (A) fluorescensintensiteten og (b) FLIM bilder av Jakten celler farget med BODIPY-C _12. De lyse, punktum regioner viser en kortere levetid enn andre regioner. Denne kortere liftime tilsvarer en lavere viskositet i puncta, sannsynligvis lipid dråper, ifølge Förster-Hoffmann ligning.

Ved å plotte livene hentet fra hver piksel, får vi en fluorescens levetid histogram for at hele bildet som vist i fig. 5.

Figur 5. Histogrammer av fluorescens levetid fra FLIM bilder av Jakten celler farget med meso-substituerte BODIPY molekylære rotorer.

Discussion

FLIM har noen viktige fordeler fremfor intensitet-baserte fluorescens bildebehandling. Det kan rapportere om photophysical hendelser som er vanskelig eller umulig å observere ved fluorescensintensiteten bildebehandling, fordi det kan skille dem fra fluoroforen konsentrasjon effekter. Dette er spesielt nyttig for å kartlegge intracellulær viskositet ved bildediagnostikk fluorescerende molekylære rotorer. Fluorescens levetid kan lett omgjøres til en viskositet ved hjelp av en kalibrering graf, som vist i fig. 3, uavhengig av konsentrasjonen av fluorescerende molekylære rotorer.

I FLIM det kan være gjenstander som kan komplisere tolking. ¹⁰ Instrumentelle artefakter inkluderer spredt lys som vil vise seg som en topp på toppen av begynnelsen av fluorescens forfall og kan forveksles med en kort forfall tid, eller en liten topp etter IRF som kan være forårsaket av refleksjoner inne i mikroskop. Disse spredte lyset gjenstander kan identifiseres som sådanfordi de kan skilles med spektral diskriminering - de er alltid på samme bølgelengde som den spennende lys. Huske at i luft, reiser lys 30 cm i 1 nanosekund bidrar til å finne opprinnelsen refleksjoner.

Filter eller glass fluorescens kan også føre til en gjenstand, særlig ved lav fluorescens, men dette kan lett identifiseres ved å ta en måling uten prøven: hvis et forfall oppnås under slike omstendigheter, er det grunn til instrumentet og har ingenting å gjøre med prøven! På den annen side, merk at prøven autofluorescens kan også bidra til en fluorescens forfall.

I time-korrelerte enkelt foton telling (TCSPC), tid-til-amplitude omformer (TAC) ikke-linearities kan føre til dårlige rier, men kan identifiseres ved å blokkere eksitasjon og skinnende lys fra omgivelsene, for eksempel fra den overførte lyskilden på prøven og måle timing. En konstant bakgrunn bør væreinnhentes i hvert piksel i bildet. Regioner hvor avvik fra en konstant bakgrunn oppstå, vil aldri gi en god passform og bør unngås for måling hvis de ikke kan elimineres ved å justere parametere for TCSPC kortet.

En beryktet gjenstand i TCSPC er foton hoper opp som er forårsaket av for høyt et foton oppklaringsprosenten. ^11,12 Dette fører til bare den første fotonet blir tidsbestemt, ignorerer eventuelle senere fotoner fordi elektronikken er opptatt timing og behandle den første fotonet. Pile-up fører til en forkortelse av fluorescens levetid, og den beste måten å unngå dette på er å holde foton telle rate på rundt 1% av laser repetisjon rate.

Outlook

Det finnes ulike implementeringer av FLIM, og, avhengig av programmet, har hver sine fordeler og ulemper. ^13. ideelle fluorescens mikroskop ville kjøpe hele flerdimensjonale fluorescens emission konturene av intensitet, stilling, levetid, bølgelengde og polarisering i en enkelt måling, med enkelt foton følsomhet, maksimal romlig oppløsning og minimum oppkjøp tid. Det er i dag ingen teknologi med denne unike kombinasjonen av funksjoner, og å bygge en fortsatt en utfordring for instrumentering utviklere. Anvendelsen av nye fysiske teknikker til viktige problemstillinger i cellebiologi er ofte veien til uventede funn, og det er en lang vei å gå før vi er nær å mette evnene av fluorescens bildebehandling for cellebiologi. Faktisk, bildebehandling fluorescens parametre som levetid, spektrum og polarisering, samt bildebehandling raskere i 3D ved høyere romlig oppløsning, er sikker på å avdekke nye sider i cellebiologi.

Materials

Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl