Summary
Флуоресценции жизни (FLIM) стал ключевым технику изображения окружающей среды и взаимодействие специфических белков и красителей в живых клетках. FLIM люминесцентных молекулярных роторов позволяет отображение вязкости в живых клетках.
Abstract
Диффузия часто является важным лимитирующей шаг в химических реакциях или биологических процессов и играет важную роль в широком диапазоне внутриклеточных событий. Вязкость является одним из ключевых параметров, влияющих на диффузии молекул и белков, а также изменение вязкости были связаны с болезнью и сбоев на клеточном уровне. 1-3 Хотя методы для измерения объемной вязкости хорошо развиты, изображения микровязкость остается проблемой . Вязкость карты микроскопических объектов, таких, как отдельные клетки, до недавнего времени было сложно. Сопоставление вязкости флуоресценции методы выгодно, потому что, как и другие оптические методы, это минимально инвазивный, неразрушающего и может быть применен к живым клеткам и тканям.
Флуоресцентные молекулярных роторов, обладают жизни флуоресценции и квантовые выходы которых зависят от вязкости их микроокружения. 4,5 Внутримолекулярная скручивания иливращение приводит к не-радиационного распада из возбужденного состояния обратно в основное состояние. Вязкая среда замедляет это вращение или скручивание, ограничение доступа к этой не-радиационного распада пути. Это приводит к увеличению квантового выхода флуоресценции и флуоресценции. Флуоресценции жизни (FLIM) модифицированных гидрофобными красителями BODIPY которые выступают в качестве флуоресцентных молекулярных роторов, показали, что флуоресценция жизни этих датчиков является функцией микровязкости окружающей среды. 6-8 логарифмическая зависимость флуоресценции по сравнению с вязкостью растворителя дает прямая линия, которая удовлетворяет уравнению Ферстер Хоффман. 9 Этот участок также служит в качестве калибровочного графика для преобразования жизни флуоресценции в вязкости.
После инкубации живых клеток с измененной молекулярной BODIPY люминесцентные ротора, точечные распределения красителя наблюдается в флуоресцентных изображений. Значения вязкости, полученные в гоэлектронной puncta в живых клетках в 100 раз выше, чем у воды и клеточной цитоплазме. 6,7 с временным разрешением флуоресцентных измерений анизотропии дают времена вращательной корреляции в соответствии с этим большое значение микровязкости. Отображение флуоресценции не зависит от интенсивности флуоресценции, и таким образом позволяет отделению концентрации зонда и вязкость эффектов.
Таким образом, мы разработали практический и универсальный подход к карте микровязкость в клетках на основе FLIM люминесцентных молекулярных роторов.
Protocol
Протоколы FLIM пробоподготовки не отличаются от тех, для конфокальной или широким поля на основе флуоресцентной микроскопии. Сбор данных следует основная задача анализа данных, то есть извлечение жизни флуоресценции от исходных данных. Как только они были получены, интерпретации данных позволяет проверить или фальсифицировать гипотез.
1. Окрашивание клеток молекулярных роторов
- Подготовка исходного раствора (10 мл) путем растворения примерно 1 мг / мл красителя в подходящем растворителе (например, метанол для BODIPY-C 12) 6,7 помощью точного баланса и пипетки.
- Клетки (клетки рака модель линии, HeLa в нашем случае), что окрашенные выращиваются на пластине в многоямного с нижней coverslide для микроскопии, в инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2 атмосферы до ~ 80% сливной .
- Добавить 10 - 20 мкл исходного раствора в живые клетки, растущие в нескольких-вэйл пластины (SmartSlide 50 микро-инкубации системы, Wafergen) в 4 мл Opti-MEM среде (GIBCO) в каждую лунку по 6-луночного планшета. Это приводит к микро-молярные концентрации красителя в скважине.
- Вернуться в мульти-и пластины инкубатор при 37 ° С с 5% CO 2 атмосферы 10-45 минут для окрашивания.
- Снимите пластину многоямного из инкубатора и промыть клетки 3-4 раза с 4 мл прозрачное среду клеточной культуры (например, Opti-MEM), чтобы удалить лишнюю краску.
- Передача пластины многоямного на предметный столик микроскопа и подключаться к контроллеру температуры / 5% СО 2 газа на входе в случае необходимости, в рамках подготовки к визуализации.
2. FLIM люминесцентных молекулярных роторов, в клетках
- Поместите образец на предметный столик микроскопа и получения передач и флуоресценции изображений для определения флуоресцентных клеток. Схема экспериментальной установки показана на рис. 1.Verify, что флуоресценция исходит от места expeИДКТК (например, клеточной мембраны, цитоплазмы). Получить флуоресценции спектр излучения, и убедитесь, что это то, что на красителе или белка и ожидалось, в этом случае спектр молекулярных роторов. В качестве отрицательного контроля, изображение, не окрашенный образец и убедитесь, что она не светиться. Хотя этот шаг не является необходимым специально для FLIM, это хорошая практика в целом, и это поможет убедиться, что образец является то, что вы думаете.
- Переключитесь на режим FLIM - это легко сделать, перемещая зеркало из флуоресценции путь луча обнаружения ("внешний детектор" на "луча настройки" панели Leica TCS SP2 приобретение программного управления). Соответствующий флуоресцентный фильтр излучения, чтобы блокировать любые возбуждающего света от достижения детектор должен быть в флуоресценции beampath обнаружения.
Рисунок 1. Экспериментальная установка для временной области FLIM с помощью сетевогоonfocal лазерного сканирующего микроскопа.
- Проверка образца и проверить, на компьютере управления FLIM приобретения, что скорость счета детектора (черная полоса помечены CFD на приобретение программного обеспечения управления в Беккера и Hickl SPC 830 платы) составляет не более 1% от частоты повторения лазер ( Зеленая полоса помечены SYNC приобретение программного обеспечения управления). Если это так, снизить интенсивность лазерного возбуждения, например, поставив фильтр нейтральной плотности на пути лазерного луча, чтобы избежать сбора нагромождение искаженных флуоресценции кривых затухания.
- Получить FLIM изображение, как правило, в течение 3-5 мин, остановить сканирование и сохранение исходных данных (3D-данных "куб", состоящий из пространственных координат х и у, и времени).
- Откройте исходные данные в флуоресценции пакет программного обеспечения для анализа распада, например TRI-2 14 или коммерческое программное обеспечение, чтобы отобразить изображение флуоресценции интенсивности. Это просто интегрированной флуоресценции, т.е. площадь под кривой затухания флуоресценции в каждойпиксель.
- Выберите типичный пикселей, поместив на нее курсор и проверить флуоресценции в том, что пиксел. Если пик количества ниже 100, использование пространственных биннинга пикселей. Пунктам соседних пикселей (например, 3x3 или 5x5) добавляется в центральное пикселей, так что более высокий пик количества получается там. Это обеспечивает более высокую статистическую точность для следующего шага. Кроме того, измерения можно повторить в течение длительного времени приобретения (шаг 5). В течение 30-50мин, примерно в 10 раз выше, пик количества (и общего счета) получается, но это слишком долго приобретения время для большинства биологических образцов в связи с опасностью введения артефактов из-за перемещения образца, микроскоп дрейф, и фототоксичности фотообесцвечивания.
- Выберите глобальной порогового значения пикселей (выше которого распада пикселя установлен) и применять единый экспоненциальный спад подходит к изображению. В результате получается флуоресценции для каждого пикселя выше порога, который затем кодируется вцвета. Каждый пиксель окрашен с результатом нужным, и FLIM карта получается. Проверьте снижение хи-квадрат значения для различных точек - около 1 (до 1.3) указывает на хорошую подгонку. Проверьте соответствующие остатки, которые должны быть случайным образом распределены вокруг нуля.
- Флуоресценции гистограмма участков, как часто определенные жизни флуоресценции происходит по отношению к флуоресценции себя. Настройка цветовой гаммы, что распределение флуоресценции жизни вписывается в цветовую гамму.
- Если monoexponential подходит не дает хи-квадрат стоимостью около 1 (до 1.3), и есть систематическое отклонение остатков от нуля, более сложные модели не требуется. Например, попробуйте установку двойной экспоненциальной модели флуоресценции распадов, на счет в течение двух различных средах зонд может быть дюйма подходит также дают предэкспоненциальный факторов или амплитуды, которые дают представление об относительной количество красителя в одном средаобращения или другой. Кроме того, растянутый экспоненциальной функции может быть полезно для учета распределения жизни флуоресценции.
- Результаты для жизни флуоресценции, предэкспоненциальный факторов, а жизнь и отношение предэкспоненты коэффициент для каждого пикселя может быть закодирована в цвете. Каждый пиксель окрашен в соответствии с его значением и контрастности благодаря флуоресценции жизни, предэкспоненциальный факторов и их соотношение получается. Опять же, проверить приведенные хи-квадрат значения (которые также могут быть закодированы в цвете и отображаются в виде изображения) - около 1 (до 1.3) указывает на хорошую подгонку. Осмотр остатков, которые должны быть случайным образом распределены вокруг нуля.
- Флуоресценции гистограммы жизни должно сопровождать все изображения для легкой визуализации среднего значения флуоресценции жизни, и распределение флуоресценции жизни.
3. Представитель Результаты
Флуоресценции распадов измеренылюминесцентные молекулярной ротора при увеличении вязкости в метанол / глицерин смеси показана на рис. 2. Флуоресценции распадов monoexponential и флуоресценции заметно различается в зависимости от вязкости. Она увеличивается с около 300 пс в метаноле (вязкость 0,6 сП) до 3,4 нс в 95% глицерина (вязкость 950 сП).
Рисунок 2. Флуоресценция профилей распада BODIPY-C 12 в метаноле / глицерин смеси различной вязкости 6.
Логарифмическом калибровки флуоресценции τ по сравнению с вязкостью η для люминесцентных молекулярного ротора показаны на рис. 3. Он представляет собой прямую линию, как того требует уравнение Ферстер Хоффман 9
где А 0 radiativэлектронная константа скорости, и г и х постоянные, причем 0 <х <1. Логарифмируя с обеих сторон дает
где х градиент прямой линии.
Рисунок 3. Участка журнала флуоресценции вязкости против журнала для жизни BODIPY-C 12 дает прямой в соответствии с Ферстер-Гоффмана уравнений 6.
После инкубации живых клеток с флуоресцентным молекулярного ротора точечной распределение красителя наблюдается в флуоресцентных изображений. FLIM изображений клеток HeLa инкубировали с мезо-замещенных краситель BODIPY показаны на рис. 4. Флуоресценции распадов в каждом пикселе изображения могут быть надлежащим образом установлены с помощью одного экспоненциальная модель распада.
Рисунок 4. (А) и интенсивности флуоресценции (б) FLIM изображений клеток HeLa окрашивали BODIPY-C 12. Яркий, точечный регионов демонстрируют более короткий срок, чем в других регионах. Этот короткий liftime соответствует более низкой вязкостью в puncta, вероятно, липидные капли, в соответствии с Ферстер-Гоффмана уравнений.
Построив жизни извлечены из каждого пикселя, получаем флуоресценции гистограмма жизни все изображение, как показано на рис. 5.
Рисунок 5. Гистограммы жизни флуоресценции от FLIM изображений клеток HeLa окрашивали мезо-замещенных BODIPY молекулярных роторов.
Discussion
FLIM предлагает несколько ключевых преимуществ по сравнению с интенсивностью на основе флуоресценции. Он может сообщить о фотофизических события, которые трудно или невозможно заметить на интенсивность флуоресценции, потому что он может отделить их от воздействия флуорофора концентрации. Это особенно полезно для отображения внутриклеточной вязкости изображений флуоресцентных молекулярных роторов. Флуоресценции может быть легко преобразован в вязкости с помощью калибровочного графика, как показано на рис. 3, зависит от концентрации люминесцентных молекулярных роторов.
В FLIM могут быть артефакты, которые могут осложнить интерпретацию данных 10. Инструментальная артефакты включают рассеянный свет, который будет отображаться в виде пика на вершине начале флуоресценции и можно перепутать с коротким временем распада, или после небольшой пик МДФ, которые могут быть вызваны отражений внутри микроскопа. Эти артефакты, разбросанные света может быть определена как таковаяпотому что они могут быть выделены со спектральным дискриминации - они всегда на одной волне, как возбуждающего света. Учитывая, что в воздух, свет проходит 30 см в 1 наносекунды помогает определить происхождение размышления.
Фильтр или стекло флуоресценции может также вызвать артефакты, особенно при низких флуоресценции образца, но это можно легко определить, взяв измерения без образца: если распад получается при таких обстоятельствах, это связано с инструментом и не имеет ничего общего с образцом! С другой стороны, обратите внимание, что пример флуоресценции может также способствовать флуоресценции.
В с корреляцией по времени одного счета фотонов (TCSPC), время-амплитуда преобразователь (TAC) нелинейность может привести к снижению приступов, но может быть идентифицирована путем блокирования возбуждения и блестящие освещенности, например, от источника света передается на образец и измерения времени. Постоянный фон должен бытьполучить в каждом пикселе изображения. Регионы, где отклонения от постоянного фона происходит, никогда не даст хорошую подгонку и его следует избегать для измерения, если они не могут быть устранены путем корректировки параметров TCSPC карты.
Одно печально известный артефакт в TCSPC является фотон скопления что обусловлено слишком высокой скорости фотона обнаружения. 11,12 Это приводит к только первый фотон быть приурочено, игнорируя любые последующие фотонов, так как электроника заняты сроки и обработки первого фотона. Скопления приводит к сокращению времени жизни флуоресценции, а лучший способ избежать этого является сохранение скорость счета фотонов составляет около 1% от частоты повторения лазер.
Прогноз
Существуют различные реализации FLIM, и, в зависимости от приложения, каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. 13 идеальным флуоресцентного микроскопа приобретет весь многомерный флуоресценции emissioн контура интенсивности, должность, срок службы, длины волны и поляризации в одном измерении, с одним фотоном чувствительность, максимальным пространственным разрешением и минимальным временем приобретения. Существует в настоящее время нет технологии с этой уникальной комбинации функций, и построить один остается проблемой для разработчиков аппаратуры. Применение новых физических методов для важных проблем в области клеточной биологии часто путь к неожиданным открытиям, и есть длинный путь, прежде чем мы близки к насыщению возможности флуоресценции для клеточной биологии. Действительно, изображение флуоресценции такие параметры, как срок службы, спектр и поляризацию, а также изображения быстрее в 3D на более высокое пространственное разрешение, определенные выявить новые аспекты в области клеточной биологии.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
МКК благодаря инженерной Великобритании и физических наук Исследовательского Совета (EPSRC) Науки о жизни Интерфейс программы для личного стипендий. Мы также хотели бы признать, финансирование биотехнологий в Великобритании и биологических наук Исследовательского Совета (СИББН).
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
References
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area. International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).
- Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269, 847-850 (1995).
- Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).
- Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A. Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. Demchenko, A. P. 8, Springer. Berlin Heidelberg. 267-308 (2010).
- Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4, (2010).
- Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).
- Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).
- Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes. J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).
- Förster, T., Hoffmann, G. Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme. Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).
- vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. J. Fluores. 15, 377-413 (2005).
- Becker, W. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , Springer. (2005).
- O'Connor, D. V., Phillips, D. Time-correlated single-photon counting. , Academic Press. New York. (1984).
- Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).
