Summary
Imágenes de fluorescencia vida (Flim) ha surgido como una técnica clave para la imagen del medio ambiente y la interacción de proteínas específicas y colorantes en las células vivas. Flim de los rotores moleculares fluorescentes permite el mapeo de la viscosidad en las células vivas.
Abstract
La difusión es a menudo un importante determinante de la velocidad paso en las reacciones químicas o procesos biológicos y juega un papel en una amplia gama de eventos intracelulares. La viscosidad es uno de los parámetros clave que afectan a la difusión de las moléculas y proteínas, y cambios en la viscosidad se han relacionado con la enfermedad y el mal funcionamiento en el nivel celular. 1-3 Si bien los métodos para medir la viscosidad a granel están bien desarrolladas, microviscosidad imagen sigue siendo un reto . Mapas de viscosidad de los objetos microscópicos, como las células individuales, que hasta hace poco difícil de obtener. Mapeo de viscosidad con técnicas de fluorescencia es ventajoso porque, similar a otras técnicas ópticas, es mínimamente invasiva, no destructiva y se puede aplicar a las células vivas y tejidos.
Fluorescentes rotores moleculares exhiben tiempos de vida de fluorescencia y los rendimientos cuánticos que son una función de la viscosidad de su microambiente. Torsión intramolecular 4,5 orotación conduce a la decadencia no radiativo de la parte posterior estado excitado al estado fundamental. Un ambiente viscoso reduce esta rotación o torsión, restringir el acceso a esta vía de desintegración no radiativa. Esto conduce a un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia y la vida de fluorescencia. Imágenes vida de fluorescencia (Flim) de colorantes modificados BODIPY hidrófobos que actúan como fluorescentes rotores moleculares muestran que el tiempo de vida de fluorescencia de estas sondas es una función de la microviscosidad de su entorno. 6-8 Una representación logarítmica de la vida de fluorescencia frente a los rendimientos de viscosidad del disolvente una línea recta que obedece a la ecuación de Förster Hoffman. 9 Esta trama también sirve como una curva de calibración para convertir toda la vida de fluorescencia en la viscosidad.
Después de la incubación de las células vivas con el BODIPY modificada fluorescente rotor molecular, una distribución puntiforme colorante se observa en las imágenes de fluorescencia. El valor de la viscosidad obtenida en ªe puncta en células vivas es de alrededor de 100 veces mayor que la del agua y del citoplasma celular. 6,7 resueltos tiempo mediciones de anisotropía de fluorescencia ceder veces rotacionales de correlación de acuerdo con estos valores microviscosidad grandes. Mapeo de la vida de fluorescencia es independiente de la intensidad de fluorescencia, y por lo tanto permite la separación de concentración de la sonda y los efectos de viscosidad.
En resumen, hemos desarrollado un enfoque práctico y versátil para asignar el microviscosidad en las células sobre la base de Flim de los rotores moleculares fluorescentes.
Protocol
Los protocolos para la preparación de la muestra Flim no difieren de los de confocal o de ancho de campo basado en la intensidad de microscopía de fluorescencia. La adquisición de datos es seguido por la tarea principal de análisis de datos, es decir, la extracción de los tiempos de vida de fluorescencia de los datos en bruto. Una vez que estos han sido obtenidos, interpretación de los datos ayuda a verificar o refutar hipótesis.
1. Células de la tinción con rotores moleculares
- Preparar una solución madre (10 ml) mediante la disolución de aproximadamente 1 mg / ml del colorante en un disolvente apropiado (por ejemplo metanol para BODIPY C-12) 6,7 utilizando una balanza de precisión y una pipeta.
- Las células (una línea celular de cáncer de modelo, HeLa, en nuestro caso) a teñir se cultivan en una placa en multipocillos con una superficie inferior coverslide para microscopía, en una incubadora a 37 ° C con un 5% de CO 2 atmósfera hasta ~ 80% confluente .
- Añadir 10 a 20 l de la solución madre a las células vivas que crecen en un multi-well placa (SmartSlide 50 micro-incubación sistema, WaferGen) en 4 ml de Opti-MEM (GIBCO) por pocillo de una placa de 6 pocillos. Esto produce una concentración de colorante de micro-molar en el pozo.
- Volver la placa de múltiples pocillos a una incubadora a 37 ° C con un 5% de CO 2 atmósfera durante 10-45 minutos para la tinción.
- Retirar la placa de múltiples pocillos de la incubadora y lavar las células 3-4 veces con 4 ml de medio de cultivo celular ópticamente transparente (por ejemplo Opti-MEM) para eliminar el exceso de tinte.
- Colocar la placa multipocillo de la platina del microscopio y conectarse a un controlador de temperatura / 5% de CO 2 de entrada de gas según sea necesario, en preparación para la imagen.
2. Flim de los fluorescentes de los rotores moleculares en las células
- Colocar la muestra en la platina del microscopio y obtener una imagen de transmisión y fluorescencia para identificar las células fluorescentes. Un diagrama esquemático del montaje experimental se muestra en la fig. 1.Verifique que emana de fluorescencia de la expe lugaresCTED (por ejemplo, la membrana celular, el citoplasma). Obtener un espectro de emisión de fluorescencia, y verificar que es la del tinte o de proteína era de esperar, en este caso, el espectro del rotor molecular. Como control negativo, la imagen de una muestra no manchado y verificar que no fluorescencia. Aunque este paso no es esencial especialmente para Flim, es una buena práctica en general y no ayuda a verificar que la muestra es lo que usted piensa que es.
- Cambiar a modo de Flim - esto se logra fácilmente al mover un espejo de la trayectoria del haz de detección de fluorescencia ("detector externo" botón "camino del haz de ajuste" del panel sobre el software Leica TCS SP2 de control de la adquisición). Un filtro adecuado emisión de fluorescencia para bloquear cualquier luz de excitación de alcanzar el detector debe estar en la Marcha de los rayos de detección de fluorescencia.
Figura 1. Dispositivo experimental de Flim el dominio del tiempo utilizando corriente alternaonfocal microscopio de barrido láser.
- Analizar la muestra y comprobar, en el ordenador que controla la adquisición Flim, que la tasa de recuento del detector (barra de color negro marcado CFD de software de adquisición de control de la Becker y Hickl SPC 830 placa) no es más que aproximadamente el 1% de la tasa de repetición láser ( barra verde con la etiqueta de adquisición del software de sincronización de control). Si lo es, reducir la intensidad de excitación láser, por ejemplo, mediante la colocación de un filtro de densidad neutra en la trayectoria del haz láser, para evitar la recogida hasta pila-curvas distorsionadas decaimiento de fluorescencia.
- Adquirir una imagen de Flim, por lo general durante 3-5 minutos, detener la exploración y guardar los datos en bruto (uno de datos en 3D "cubo" que consiste en coordenadas espaciales x e y, y el tiempo).
- Abra los datos en bruto en el paquete de software de análisis de fluorescencia de la caries, por ejemplo TRI-2 14 u otro software comercial, para mostrar la imagen la intensidad de fluorescencia. Esto es simplemente el decaimiento de fluorescencia integrado, es decir, el área bajo la curva de caída de fluorescencia, en cadapíxel.
- Seleccione un píxel típica colocando el cursor sobre él, e inspeccionar el decaimiento de fluorescencia en ese píxel. Si el recuento de pico es inferior a 100, usar binning espacial de pixeles. Los recuentos de pixeles adyacentes (por ejemplo 3x3 o 5x5) se añaden en el píxel central, de modo que un recuento pico más alto se obtiene allí. Esto proporciona una mayor precisión estadística para el siguiente paso. Alternativamente, la medición puede ser repetida para un tiempo de adquisición más largo (paso 5). Para el 30-50min, un recuento de aproximadamente 10 veces mayor pico (y los recuentos totales) se obtiene, pero esto es demasiado tiempo un tiempo de adquisición para la mayoría de las muestras biológicas, debido al peligro de introducir artefactos debido al movimiento de la muestra, la deriva de microscopio, fototoxicidad y photobleaching.
- Seleccione un valor de píxeles umbral global (por encima del cual la decadencia de un píxel está equipado) y aplicar un ajuste simple decaimiento exponencial de la imagen. El resultado se obtiene una vida útil de fluorescencia para cada píxel por encima del umbral, que luego es codificada encolor. Cada pixel es de color con el resultado del ajuste, y un mapa obtenido se Flim. Compruebe los reducidos valores de chi-cuadrado de píxeles diferentes - en torno a 1 (y hasta a 1,3) indica un buen ajuste. Inspeccione los residuos correspondientes, los cuales deben ser distribuidos al azar en torno a cero.
- Las parcelas de toda la vida de fluorescencia histograma con qué frecuencia se producen tiempos de vida ciertos fluorescencia frente a la vida de fluorescencia en sí. Ajustar la gama de colores de tal manera que la distribución de fluorescencia vida encaja en la gama de colores.
- Si un ajuste monoexponencial no produce un valor Chi-cuadrado de alrededor de 1 (y hasta 1,3), y hay una desviación sistemática de los residuos de cero, un modelo más sofisticado se requiere. Por ejemplo, trate de ajustar un modelo exponencial doble para los decaimientos de fluorescencia, para dar cuenta de dos ambientes diferentes de la sonda puede estar adentro El ajuste también se dan los factores pre-exponenciales o amplitudes que dan una indicación de la cantidad relativa de tinte en una medio ambienteción o el otro. Alternativamente, una función exponencial estirada puede ser apropiado para dar cuenta de una distribución de tiempos de vida de fluorescencia.
- Los resultados para los tiempos de vida de fluorescencia, los factores de pre-exponencial, y la razón de por vida y la relación de factor pre-exponencial para cada píxel puede ser codificado en color. Cada pixel es de color de acuerdo a su valor, y el contraste de vidas debido a la fluorescencia, los factores pre-exponenciales y sus relaciones se obtiene. Una vez más, comprobar los reducidos valores de chi-cuadrado (que también puede ser codificado en color y se muestra como una imagen) - Alrededor de 1, y hasta a 1,3) indica un buen ajuste. Inspeccione los residuos, que deben ser distribuidos al azar en torno a cero.
- Histogramas de fluorescencia de toda la vida debe acompañar a todas las imágenes para una fácil visualización de los valores medios de vida de fluorescencia, y la distribución de fluorescencia vida.
3. Los resultados representativos
Decae fluorescencia medida parael rotor fluorescente molecular a aumentar la viscosidad en mezclas de metanol / glicerol se muestra en la figura. 2. Los decaimientos de fluorescencia son monoexponencial, y la vida de fluorescencia varía notablemente en función de la viscosidad. Se aumenta de alrededor de 300 ps en metanol (viscosidad 0,6 cP) a 3,4 ns en el 95% de glicerol (viscosidad 950 cp).
Figura 2. Perfiles de decaimiento de fluorescencia para BODIPY C-12 en mezclas de metanol / glicerol de viscosidad variable. 6
La trama de calibración logarítmica de vida de fluorescencia frente a τ viscosidad η para el rotor molecular fluorescente se muestra en la fig. 3. Se trata de una línea recta como lo exige la ecuación de Förster Hoffman 9
donde k es 0 el radiativtasa constante e, y la Z y X son constantes, con 0 <x <1. Tomando el logaritmo en ambos lados rendimientos
donde x es el gradiente de la línea recta.
Figura 3. Un gráfico de la viscosidad de registro de registro de por vida frente a la fluorescencia de BODIPY C-12 da una línea recta de acuerdo con la ecuación de Förster-Hoffmann. 6
Después de la incubación de las células vivas con el rotor molecular fluorescente una distribución puntiforme colorante se observa en las imágenes de fluorescencia. Fli imágenes de células HeLa incubadas con un meso-sustituido colorante BODIPY se muestra en la figura. 4. Los decaimientos de fluorescencia en cada píxel de la imagen puede ser adecuadamente equipado con un único modelo de decaimiento exponencial.
Figura 4. (A) La intensidad de fluorescencia y (b) imágenes Fli de células HeLa teñidas con BODIPY C-12. Las regiones brillantes y puntiformes presentan una vida útil más corta que en otras regiones. Este liftime más corta corresponde a una viscosidad más baja en los puntos lagrimales, probablemente gotitas de lípidos, de acuerdo con la ecuación de Förster-Hoffmann.
Representando los tiempos de vida extraídos de cada píxel, se obtiene un histograma de fluorescencia vida de toda la imagen como se muestra en la fig. 5.
Figura 5. Histogramas de vida de fluorescencia de imágenes Fli de células HeLa teñidas con meso-sustituidos rotores moleculares BODIPY.
Discussion
Flim ofrece algunas ventajas clave sobre la intensidad basada en imágenes de fluorescencia. Se puede informar sobre los eventos fotofísicas que son difíciles o imposibles de observar por imágenes de la intensidad de fluorescencia, ya que se pueden separar de los efectos de la concentración de fluoróforo. Esto es particularmente útil para el mapeo de viscosidad intracelular por imagen molecular rotores fluorescentes. La vida de fluorescencia puede ser fácilmente convertido en una viscosidad usando una curva de calibración, como se muestra en la fig. 3, independiente de la concentración de los rotores moleculares fluorescentes.
En Flim puede haber artefactos que pueden complicar la interpretación de los datos. 10 artefactos instrumentales incluyen la luz dispersa, que se mostrará como un pico en la parte superior del inicio de la decadencia de fluorescencia y se puede confundir con un tiempo de decaimiento corto, o un pequeño pico después de la IRF que puede ser causada por las reflexiones en el interior del microscopio. Estos artefactos de luz dispersos puede ser identificada como talporque se pueden distinguir con la discriminación espectral - son siempre a la misma longitud de onda como la luz de excitación. Recordando que en el aire, la luz viaja a 30 cm en 1 nanosegundo ayuda a precisar el origen de las reflexiones.
Filtro o fluorescencia de vidrio también puede causar un artefacto, especialmente en la fluorescencia de la muestra bajo, pero esto puede ser fácilmente identificado por tomar una medida sin la muestra: si una descomposición se obtiene bajo estas circunstancias, es debido a que el instrumento y no tiene nada que ver con la muestra! Por otro lado, nótese que autofluorescencia muestra también puede contribuir a un decaimiento de fluorescencia.
Con el tiempo-correlacionada conteo de fotones simple (TCSPC), convertidor de tiempo de amplitud (TAC) no linealidades puede causar ataques pobres, pero se pueden identificar mediante el bloqueo de la excitación y brillante de luz ambiental, por ejemplo, de la fuente de luz transmitida sobre la muestra y medir el tiempo. Un fondo debe ser constanteobtenida en cada píxel de la imagen. Las regiones donde las desviaciones de un fondo constante ocurrir, nunca producirá un buen ajuste y deben ser evitados para la medición, si no pueden ser eliminadas mediante el ajuste de los parámetros para la tarjeta TCSPC.
Un artefacto infame en TCSPC es fotón amontonamiento que es causada por una muy alta tasa de detección de fotones. 11,12 Esto conduce a sólo el primer fotón está temporizado, ignorando cualquier fotones posteriores debido a los componentes electrónicos son temporización ocupado y procesar el primer fotón. Pile-up conduce a un acortamiento de la vida de fluorescencia, y la mejor manera de evitar esto es mantener la tasa de recuento de fotones en torno al 1% de la tasa de repetición del láser.
Punto de vista
Hay varias implementaciones de Flim, y, dependiendo de la aplicación, cada uno tiene sus ventajas e inconvenientes. 13 El microscopio de fluorescencia ideal sería adquirir la totalidad multidimensional fluorescencia emission del contorno de intensidad, posición, tiempo de vida, longitud de onda y la polarización en una sola medición, con una sensibilidad de fotón único, la resolución espacial máxima y el tiempo de adquisición mínimo. Actualmente no hay tecnología con esta combinación única de características, y para construir una sigue siendo un reto para los desarrolladores de instrumentación. La aplicación de nuevas técnicas físicas para los problemas importantes en la biología celular es a menudo el camino a los descubrimientos inesperados, y hay un largo camino por recorrer antes de que estemos cerca de la saturación de las capacidades de las imágenes de fluorescencia de la biología celular. En efecto, los parámetros de fluorescencia de imagen tales como la vida, el espectro y la polarización, así como imágenes con mayor rapidez en 3D en alta resolución espacial, es seguro que revelan nuevos aspectos de la biología celular.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
MKK gracias Ingeniería del Reino Unido y Ciencias Físicas Research Council (EPSRC) La vida del programa Ciencias de la interfaz de una beca de personal. También queremos agradecer a los fondos por la Biotecnología del Reino Unido y Ciencias Biológicas de Investigación (BBSRC).
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
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