Summary
Lifetime Imaging di fluorescenza (FLIM) è emersa come una tecnica fondamentale per l'immagine l'ambiente e l'interazione di proteine specifiche e coloranti nelle cellule viventi. FLIM fluorescenti di rotori molecolari consente mappatura di viscosità in cellule viventi.
Abstract
Diffusion è spesso un importante fattore limitante in reazioni chimiche o processi biologici e gioca un ruolo in una vasta gamma di eventi intracellulari. Viscosità è uno dei parametri fondamentali che riguardano la diffusione delle molecole e proteine, e le variazioni di viscosità sono state collegate a malattie e malfunzionamenti a livello cellulare. 1-3 Mentre i metodi per misurare la viscosità bulk sono ben sviluppati, microviscosità immagini ancora una sfida . Mappe di viscosità di oggetti microscopici, come le cellule singole, fino ad oggi sono difficili da ottenere. Viscosità Mapping con tecniche di fluorescenza è vantaggioso perché, simile ad altre tecniche ottiche, è minimamente invasivo, non distruttivo e può essere applicata alle cellule e tessuti viventi.
Fluorescenti rotori molecolari vite presentano fluorescenza e rese quantiche che sono una funzione della viscosità del loro microambiente. 4,5 torsione o intramolecolarela rotazione porta al decadimento non-radiativo dal retro stato eccitato allo stato fondamentale. Un ambiente viscoso rallenta la rotazione o torsione, limitare l'accesso a questa non-radiative percorso di decadimento. Questo porta ad un aumento della resa quantica di fluorescenza e la durata della fluorescenza. Imaging vita di fluorescenza (FLIM) di coloranti modificati BODIPY idrofobiche che agiscono come fluorescenti rotori molecolari mostrano che la vita di fluorescenza di queste sonde è una funzione della microviscosità del loro ambiente. 6-8 Un grafico logaritmico della durata della fluorescenza contro le rese viscosità solvente una linea retta che obbedisce l'equazione Förster Hoffman. 9 Questa trama serve anche come un grafico di taratura per convertire vita di fluorescenza in viscosità.
Dopo l'incubazione delle cellule viventi con il rotore modificato BODIPY fluorescente molecolare, una distribuzione puntiforme colorante si osserva nelle immagini di fluorescenza. Il valore di viscosità ottenuto in the puncta in cellule vive è di circa 100 volte superiore a quello dell'acqua e del citoplasma cellulare. 6,7 Time-ha deliberato misure di anisotropia di fluorescenza di correlazione cedere tempi di rotazione in accordo con questi valori microviscosità di grandi dimensioni. Mapping la durata della fluorescenza è indipendente dell'intensità di fluorescenza, e consente così la separazione di concentrazione sonda e effetti di viscosità.
In sintesi, abbiamo sviluppato un approccio pratico e versatile per mappare la microviscosità in celle in base a FLIM di rotori molecolari fluorescenti.
Protocol
I protocolli per la preparazione del campione FLIM non differiscono da quelli per confocale o wide-field-based intensità microscopia a fluorescenza. L'acquisizione dei dati è seguito dal compito principale di analisi dati, cioè estrarre i tempi di vita di fluorescenza dai dati grezzi. Una volta che questi sono stati ottenuti, l'interpretazione dei dati consente di verificare o falsificare le ipotesi.
1. Cellule colorazione con rotori molecolari
- Preparare una soluzione stock (10 ml) sciogliendo circa 1 mg / ml del colorante in un solvente appropriato (ad esempio metanolo per BODIPY-C 12) 6,7 usando una bilancia accurata e una pipetta.
- Le cellule (un cancro linea modello cellulare, HeLa nel nostro caso) per essere tinto sono coltivate su una piastra a cavità multiple con un lato coverslide per microscopia, in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 atmosfera fino ~ 80% confluenti .
- Aggiungere 10-20 microlitri della soluzione madre alle cellule viventi che crescono in un multi-well piastra (50 SmartSlide micro-incubazione sistema, WaferGen) in 4 ml di Opti-MEM (GIBCO) per pozzetto per una piastra da 6 pozzetti. Ciò produce un micro-molare concentrazione di colorante nel pozzo.
- Riportare la piastra multipozzetto ad un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 ambiente per 10-45 minuti per la colorazione.
- Rimuovere la piastra multipozzetto dall'incubatore e lavare le cellule 3-4 volte con 4 ml di medium cell otticamente trasparente della cultura (ad esempio, Opti-MEM) per eliminare il colorante in eccesso.
- Trasferire la piastra a cavità multiple alla fase microscopio e connettersi ad un controllore di temperatura / 5% CO 2 entrata del gas come richiesto, in preparazione per l'imaging.
2. FLIM di rotori molecolari fluorescenti in cellule
- Posizionare il campione sul microscopio scena e ottenere una trasmissione e immagine di fluorescenza per identificare le cellule fluorescenti. Un diagramma schematico del set-up sperimentale è mostrato in fig. 1.Verify che emana fluorescenza dalla espe posizionicted (es membrana cellulare, citoplasma). Ottenere uno spettro di emissione di fluorescenza, e verificare che è quello del colorante o proteine previsto, in questo caso lo spettro del rotore molecolare. Come controllo negativo, l'immagine non-tinto campione e verificare che non è fluorescente. Sebbene questo passaggio non è essenziale specificamente per FLIM, è buona in generale e aiuta a verificare che il campione è quello che si pensa che sia.
- Passa alla modalità FLIM - questo è facilmente eseguita spostando uno specchio di fuori del percorso fluorescenza fascio di rilevamento ("esterno detector" Cliccare su "percorso del raggio setting" sul pannello di controllo del software Leica TCS SP2 di acquisizione). Un filtro appropriato emissione di fluorescenza a bloccare qualsiasi luce eccitante di raggiungere il rivelatore deve essere in beampath rivelazione della fluorescenza.
Figura 1. Disposizione sperimentale per dominio del tempo utilizzando FLIM aclaser onfocal microscopio a scansione.
- Eseguire la scansione del campione e verificare, sul computer che controlla l'acquisizione FLIM, che il tasso di conteggio del rivelatore (barra nera etichettato CFD sul software di controllo acquisizione del Becker & Hickl SPC 830 a bordo) non più di circa l'1% del tasso di ripetizione del laser ( barra verde etichettato software di acquisizione di controllo SYNC). Se è, ridurre l'intensità di eccitazione laser, ad esempio inserendo un filtro a densità neutra nel percorso del raggio laser, per evitare di raccogliere pile-up curve distorte decadimento della fluorescenza.
- Acquisire un'immagine FLIM, tipicamente per 3-5 minuti, fermare la scansione e salvare i dati grezzi (un 3D di dati "cubo" composto da coordinate spaziali x e y, e il tempo).
- Aprire i dati grezzi del pacchetto software di analisi di fluorescenza di decadimento, per esempio TRI-2 14 o software commerciale, per visualizzare l'immagine intensità di fluorescenza. Questo è semplicemente il decadimento fluorescenza integrato, cioè l'area sotto la curva di decadimento di fluorescenza, in ciascunpixel.
- Selezionare un pixel tipica posizionando il cursore su di esso, e controllare il decadimento di fluorescenza in quel pixel. Se il conteggio di picco è inferiore a 100, utilizzare binning spaziale di pixel. I conteggi di pixel adiacenti (ad esempio 3x3 o 5x5) vengono aggiunti nel pixel centrale, in modo che un numero maggiore di picco è ottenuto. Ciò fornisce una maggiore precisione statistica per il passaggio successivo. In alternativa, la misurazione può essere ripetuta per un più lungo tempo di acquisizione (fase 5). Per i 30-50min, un conteggio di circa 10 volte superiore di picco (e conte totali) viene ottenuto, ma questa è troppo lungo un tempo di acquisizione per la maggior parte dei campioni biologici per il pericolo di introdurre artefatti dovuti al movimento del campione, la deriva microscopio, fototossicità e photobleaching.
- Selezionare un valore di soglia globale pixel (sopra la quale il decadimento in un pixel è montato) e applicare un accoppiamento unico decadimento esponenziale all'immagine. Il risultato produce una vita di fluorescenza per ciascun pixel sopra la soglia, che viene poi codificato incolore. Ogni pixel viene colorato con il risultato della misura, e una mappa FLIM si ottiene. Controllare i ridotti valori di chi-quadrato per vari pixels - circa 1 (e fino a 1.3) indica una buona forma. Controllare i residui corrispondenti, che dovrebbero essere distribuiti casualmente intorno allo zero.
- La fluorescenza durata istogramma la frequenza con cui si verificano determinati tempi di vita di fluorescenza contro la vita stessa di fluorescenza. Regolare la gamma di colori in modo tale che la distribuzione durata della fluorescenza si inserisce nella gamma di colori.
- Se un accoppiamento monoesponenziale non produce un valore di chi-quadrato di circa 1 (e fino a 1,3), e vi è una deviazione sistematica dei residui da zero, un modello più sofisticato è richiesto. Ad esempio, vai a montare un modello a doppio esponenziale per i decadimenti fluorescenza, per tenere conto di due diversi ambienti la sonda può essere poll L'adattamento anche dare i pre-esponenziali fattori o ampiezze che danno un'indicazione della quantità relativa di colorante in uno ambientemento o l'altro. In alternativa, una funzione esponenziale allungato può essere opportuno rappresentano una distribuzione di vite fluorescenza.
- I risultati per le durate di fluorescenza, pre-esponenziali fattori, e il rapporto di vita e la pre-esponenziale rapporto fattore per ciascun pixel può essere codificato a colori. Ogni pixel è colorato in base al suo valore, e il contrasto a causa di tempi di vita di fluorescenza, pre-esponenziale dei fattori e dei loro rapporti si ottiene. Anche in questo caso, controllare i ridotti valori di chi-quadrato (che può anche essere codificati a colori e visualizzati sotto forma di immagine) - circa 1 (e fino a 1.3) indica una buona forma. Controllare i residui, che devono essere distribuiti casualmente intorno allo zero.
- Istogrammi durata della fluorescenza deve accompagnare tutte le immagini per una visualizzazione semplice dei valori medi di durata della fluorescenza, la distribuzione e la durata della fluorescenza.
3. Risultati rappresentativi
Decadimenti di fluorescenza misuratail rotore fluorescente molecolare ad aumentare la viscosità in metanolo / glicerolo miscele sono mostrati nella fig. 2. I decade fluorescenza sono monoesponenziale, e la vita di fluorescenza varia sensibilmente in funzione della viscosità. Aumenta da circa 300 ps in metanolo (0,6 viscosità cP) a 3,4 ns nel 95% glicerolo (viscosità 950 cP).
Profili decadimento Figura 2. Fluorescenza per BODIPY-C 12 in metanolo / glicerolo miscele di viscosità varia 6.
Il diagramma di taratura logaritmica della durata della fluorescenza rispetto a τ viscosità η per il rotore fluorescente molecolare è mostrato in fig. 3. Si tratta di una linea retta come richiesto dall'equazione Förster Hoffman 9
dove k è 0 la radiativvelocità e costante, e Z e X sono costanti, con 0 <x <1. Prendendo il logaritmo su entrambi i lati rese
dove x è la pendenza della retta.
Figura 3. Un grafico di log fluorescenza viscosità log vs vita per BODIPY C-12 produce una linea retta secondo la Förster-Hoffmann equazione 6.
Dopo l'incubazione delle cellule viventi con il rotore fluorescente molecolare una distribuzione puntiforme colorante si osserva nelle immagini di fluorescenza. FLIM immagini di cellule HeLa incubate con un colorante meso-sostituito BODIPY sono mostrati nella fig. 4. I decade di fluorescenza in ogni pixel dell'immagine può essere adeguatamente montate con un unico modello di decadimento esponenziale.
Figura 4. (A) L'intensità della fluorescenza e (b) FLIM immagini di cellule HeLa colorati con BODIPY-C 12. Le luminose regioni puntuate mostrano una vita più breve rispetto ad altre regioni. Questo liftime inferiore corrisponde ad una viscosità più bassa nel puncta, goccioline lipidiche probabilmente, secondo la Förster-Hoffmann equazione.
Riportando i tempi di vita estratti da ogni pixel, si ottiene un istogramma di fluorescenza vita dell'intera immagine come mostrato in fig. 5.
Figura 5. Istogrammi di vite fluorescenza da immagini FLIM di cellule HeLa colorati con meso-sostituiti BODIPY rotori molecolari.
Discussion
FLIM offre alcuni vantaggi chiave rispetto intensità-based imaging di fluorescenza. Esso può riferire eventi fotofisiche che sono difficili o impossibili da osservare da imaging intensità di fluorescenza, perché può separarli da effetti concentrazione del fluoroforo. Ciò è particolarmente utile per mappare viscosità intracellulare di imaging rotori fluorescenti molecolare. La durata della fluorescenza può essere facilmente convertito in una viscosità utilizzando una curva di taratura, come mostrato in fig. 3, indipendente dalla concentrazione di fluorescenti rotori molecolari.
In FLIM ci possono essere artefatti che possono complicare l'interpretazione dei dati. A 10 artefatti strumentali includono luce diffusa, che verrà visualizzato come un picco sopra l'inizio del decadimento di fluorescenza e può essere confuso con un tempo di decadimento breve, o un piccolo picco dopo l' IRF che può essere causato dai riflessi all'interno del microscopio. Questi manufatti leggeri sparsi possono essere identificati come taliperché possono essere distinti con la discriminazione spettrale - sono sempre alla stessa lunghezza d'onda della luce eccitante. Ricordando che in aria, la luce viaggia a 30 cm in 1 nanosecondo aiuta a individuare l'origine di riflessioni.
Filtro o di vetro a fluorescenza potrebbe anche causare un artefatto, soprattutto in fluorescenza del campione bassa, ma questo può essere facilmente identificata da prendere una misura in assenza del campione: se un decadimento si ottiene in queste circostanze, è dovuta allo strumento e non ha niente a che fare con il campione! D'altra parte, notare che autofluorescenza campione può inoltre contribuire ad un decadimento fluorescenza.
In tempo-correlata conteggio di singolo fotone (TCSPC), tempo-per-ampiezza convertitore (TAC) non linearità può causare convulsioni poveri, ma può essere identificato bloccando l'eccitazione e lucente luce ambientale, ad esempio dalla sorgente di luce trasmessa sul campione e misurando la temporizzazione. Uno sfondo costante deve essereottenuto in ciascun pixel dell'immagine. Regioni in cui deviazioni da uno sfondo costante verificarsi, non cederà mai una buona e dovrebbe essere evitato per la misura, se non può essere eliminato regolando i parametri per la scheda TCSPC.
Un artefatto è infame in TCSPC fotone pile-up, che è causato da un tasso troppo alto di rilevamento fotone. 11,12 Questo porta solo al primo fotone che è stato misurato, ignorando qualsiasi fotoni successivi, perché l'elettronica sono i tempi occupati e l'elaborazione del primo fotone. Pile-up porta a un accorciamento della durata di fluorescenza, e il modo migliore per evitare questo è di mantenere il tasso di conteggio di fotoni a circa l'1% del tasso di ripetizione laser.
Prospettiva
Esistono diverse implementazioni di FLIM, e, a seconda dell'applicazione, ciascuno ha i suoi vantaggi e svantaggi. 13 Il microscopio a fluorescenza ideale sarebbe acquisire l'intera multidimensionale fluorescenza emission contorno di intensità, posizione, durata, lunghezza d'onda e la polarizzazione in una singola misura, con sensibilità al singolo fotone, la massima risoluzione spaziale e tempo di acquisizione minimo. Non vi è attualmente nessuna tecnologia con questa combinazione unica di caratteristiche, e per costruire uno rimane una sfida per gli sviluppatori di strumentazione. L'applicazione di nuove tecniche fisiche per problemi importanti in biologia cellulare è spesso il percorso di scoperte inattese, e vi è una lunga strada da percorrere prima che siamo vicini a saturare le capacità di imaging di fluorescenza per la biologia cellulare. Infatti, imaging parametri di fluorescenza come durata, spettro e polarizzazione, nonché immagini più rapidamente in 3D a più alta risoluzione spaziale, sono determinate a rivelare nuovi aspetti della biologia cellulare.
Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
MKK ringrazia Ingegneria del Regno Unito e Physical Science Research Council (EPSRC) programma Life Sciences Interface per una borsa di studio personale. Vorremmo inoltre ringraziare finanziamento da parte del Regno Unito Biotechnology e Biological Sciences Research Council (BBSRC).
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
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