Summary
Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) görüntü ortamı ve spesifik proteinlerin ve canlı hücreler boyaların etkileşimi önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan moleküler rotor flim canlı hücreler viskozitenin haritalama sağlar.
Abstract
Difüzyon genellikle kimyasal tepkimeler veya biyolojik proseslerle önemli bir oran-belirleyen bir adım ve intraselüler olaylar, geniş bir aralıktaki bir rol oynar. Viskozite moleküllerin ve proteinlerin difüzyon etkileyen temel parametrelerden biridir, ve viskozite değişiklikleri hücresel düzeyde hastalık ve arıza bağlantılı olmuştur. 1-3 toplu viskozitesini ölçmek için yöntemler de geliştirilmiş olmakla birlikte, görüntüleme microviscosity bir sorun olmaya devam . Son zamanlarda elde etmek zor oldu kadar bu tek hücre gibi mikroskobik nesnelerin Viskozite haritalar, var. Diğer optik teknikler benzer, bu tahribatsız, minimal invaziv ve canlı hücrelere ve dokulara uygulanabilir, çünkü floresans teknikleri ile Haritalama viskozite avantajlıdır.
Floresan moleküler rotorlar floresans süreleri ve bunların mikroçevresinin viskozitesi bir fonksiyonu vardır kuantum verimleri sergilerler. 4,5 Moleküliçi büküm veyaDönme uyarılmış duruma geri asıl durumuna olmayan radyatif sönümü yol açar. Bir viskoz ortam bu ışıksız çürümesine yol erişimi kısıtlayarak, bu rotasyon veya büküm yavaşlatır. Bu floresans kuantum verimi ve floresans ömrü bir artışa yol açar. Floresan moleküler rotor olarak hareket değiştirilmiş hidrofobik BODIPY boyaların Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) bu prob floresans yaşam ortamlarının microviscosity bir fonksiyonu olduğunu gösteriyor. 6-8 çözücü viskozitesi verimi karşı floresans ömrü bir logaritmik grafikte Förster Hoffman denklemi itaat düz bir çizgi. 9 Bu komplo da viskozite içine floresans ömrü dönüştürmek için bir kalibrasyon grafiği olarak hizmet vermektedir.
Modifiye BODIPY floresan moleküler rotor ile yaşayan hücrelerin inkübasyonu takiben, noktasal boya dağıtım floresans görüntüleri görülmektedir. Th elde viskozite değericanlı hücrelerde e punktumlarda yaklaşık 100 kez su daha yüksek olduğu ve hücresel sitoplazmaya taşır. 6,7 Zaman bağımlı floresans anizotropi ölçümler bu büyük microviscosity değerleri ile uyum içinde dönme korelasyon kat verim. Floresans ömrü eşleyerek floresans yoğunluğunu bağımsızdır ve böylece prob konsantrasyonu ve viskozite etkileri ayırma sağlar.
Özet olarak, floresan moleküler rotorların flim dayalı hücrelerinde microviscosity eşlemek için pratik ve çok yönlü bir yaklaşım geliştirdik.
Protocol
Flim numune hazırlama için protokoller konfokal veya geniş alan şiddeti tabanlı floresan mikroskobu için farklılık yok. Veri toplama yani ham verilerden floresans yaşam ayıklanması, veri analizi ana görevi takip eder. Bir kere bu elde edilmiştir, veri yorumlama hipotez doğrulamak veya çürütmek için yardımcı olur.
1. Moleküler rotorlar ile boyanarak hücre
- In boya yaklaşık 1 mg / ml eriterek bir stok çözelti (10 ml) hazırlamak uygun bir çözücü (BODIPY-C 12 örneğin metanol) 6,7 doğru denge ve bir pipet kullanılarak.
- Lekeli olmak hücreleri (bizim durumumuzda bir model kanser hücre dizisi, HeLa) ~% 80 konfluent kadar% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de küvözde, mikroskopi için coverslide alt bir multiwell plaka üzerinde yetiştirilen .
- 10 Ekle - stok solüsyonu 20 ul çok wel büyüyen canlı hücreler içinOpti-MEM ortamı (GIBCO) başına de bir 6-kuyucuklu plak için 4 ml l plakası (SmartSlide 50 mikro-inkübasyon sistemi, Wafergen). Bu iyi bir mikro-molar boya konsantrasyonu verir.
- Boyanması için 10-45 dakika için% 5 CO2 atmosfer ile 37 ° C 'de bir inkübatör için çok kuyucuklu plak döner.
- Inkübatör gelen multiwell plaka çıkarın ve fazla boya kaldırmak için 4 ml optik olarak berrak hücreli kültür ortamı (örneğin Opti-MEM) ile hücreleri 3-4 kez yıkayın.
- Mikroskop sahneye multiwell plaka aktarın ve gerektiği gibi görüntüleme için hazırlık, bir sıcaklık kontrolörü /% 5 CO 2 gaz girişine bağlayın.
2. Hücrelerdeki floresan moleküler rotorların flim
- Mikroskop sahnede örnek yerleştirin ve bir iletim ve floresan hücrelerini tanımlamak için floresan görüntü elde. Kurulum deneysel bir şematik diyagramıdır Şek. 1.Verify olduğu yerlerde Expe gelen floresans kaynaklanmaktadırcted (örneğin, hücre zarı, sitoplazma). Bir floresan emisyon spektrumunu elde edilir, bu durumda, molekül rotor tayfı beklenen boya veya proteinin bir olduğunu doğrulamak. Bir negatif kontrol olarak, resim, bir non-boyanmış ve bu örnek floresan olmadığını kontrol. Bu adım flim için özel olarak gerekli olmamasına rağmen, genel olarak iyi uygulama ve örnek Sence ne olduğunu doğrulamak için yardımcı olur.
- Flim moduna geç - Bu kolayca flüoresan tespiti ışın yolu (Leica TCS SP2 devralma kontrolü yazılımı "ışın yolu ayarı" panelinde "dedektör" düğmesi) bir ayna hareket gerçekleştirilir. Dedektör ulaşan herhangi bir heyecan ışığı bloke etmek için uygun floresans emisyon filtresi floresan algılama beampath olmalıdır.
Şekil 1. Ac kullanarak time-domain flim için deneysel düzenlemeonfocal lazer tarama mikroskobu.
- Örnek Tarama ve dedektör sayısı oranı (Becker & Hickl SPC 830 kurulunun satın kontrol yazılımı CFD etiketli siyah bar) artık lazer tekrarlama oranı yaklaşık% 1 (daha olduğunu, Flim satın kontrol bilgisayarı kontrol yeşil çubuk) SYNC kazanım kontrol yazılımı etiketli. Eğer öyleyse, kazık kadar çarpık floresans bozunum eğrileri toplama önlemek için, lazer ışını yolu bir nötral yoğunluk filtresi koyarak örneğin lazer uyarılma yoğunluğu azaltın.
- , Tipik olarak 3-5 dakika süreyle, bir flim görüntü elde tarama durdurmak ve ham veri (3D veri mekansal koordinatları x ve y oluşan "küp", ve zamandan tasarruf).
- Örneğin TRI-2 14 veya ticari yazılım, floresan görüntüyü göstermek için floresans bozunum analiz yazılımı paketi ham veri, açın. Bu basitçe entegre floresans çürümesi, her, floresans bozunum eğrisi altında kalan alan yanipiksel.
- Üzerine imleci yerleştirerek tipik bir piksel seçin ve o piksel içinde floresans bozunum inceleyin. Pik sayısı 100'ün altında ise, piksel mekansal binning kullanın. Bitişik piksel (örn. 3x3 veya 5x5) ile sayımları, bir yüksek tepe sayısı da elde edilir, böylece, merkezi bir piksel içine eklenir. Bu, bir sonraki aşama için daha yüksek bir istatistiksel doğruluk sağlar. Alternatif olarak, ölçme uzun edinimi süresi (5. adım) için tekrar edilebilir. 30-50dakika için, yaklaşık 10 kat daha yüksek pik sayımı (ve toplam sayıları) elde edilir, ama bu çok uzun far, çünkü örnek hareketi nedeniyle eserler, mikroskop sürüklenme, fototoksisite ve tanıtma tehlikesi çoğu biyolojik örnekler için bir kazanım zamanı olarak photobleaching.
- Küresel bir piksel eşik değerini (piksel çürüme takıldığı üstte) seçin ve görüntüyü tek bir üstel bozulma uygun geçerlidir. Sonuç sonra kodlanmıştır eşiğinin üzerinde her piksel için bir floresan ömrü verirrenk. Her piksel oturması sonucu ile renklendirilir ve bir flim haritası elde edilir. Çeşitli piksel için azaltılmış ki-kare değerleri kontrol edin - 1 civarında (ve yukarı 1.3) iyi bir uyum gösterir. Rastgele sıfır etrafında dağıtılması gerekmektedir gelen artıklar, inceleyin.
- Floresans ömrü histogram belli floresans ömürleri floresans ömrü kendisini karşı ortaya ne sıklıkta araziler. Floresans ömrü dağıtım renk aralığına uyan renk yelpazesi gibi ayarlayın.
- Bir monoexponential uyum yaklaşık 1 bir ki-kare değeri (ve yukarı 1.3) vermezse, ve sıfırdan artıklar sistematik bir sapma olursa, daha gelişmiş bir modeli gereklidir. Örneğin, sonda uygun biri ile de boya miktarı göreceli bir göstergesidir ön-üstel faktörleri veya genlikleri verecektir inç olabilecek iki farklı ortamlar için hesaba, floresans bozunumları bir çift üstel modeli uydurma deneyin çevreMent veya diğer. Alternatif olarak, bir gerilmiş üstel fonksiyonu floresans yaşamların bir dağıtım hesabını vermek uygun olabilir.
- Her bir piksel için floresans ömürleri, pre-üstel faktörleri ve ömrü oranı ve pre-üstel faktörü oranı sonuçları daha sonra renkli kodlanabilir. Her bir piksel ile bir değere göre renkli, ve floresans ömürleri, pre-üstel faktörleri ve bunların oranları nedeniyle kontrast elde edilir. Iyi bir uyum gösterir yaklaşık 1 (en fazla 1.3) - Yine, azaltılmış ki-kare değerleri (renkli kodlanmış ve görüntü haline edilebilir) kontrol edin. Rastgele sıfır etrafında dağıtılması gerekmektedir artıklar, inceleyin.
- Floresans ömrü histogramlar ortalama floresans ömrü değerlerin kolay görselleştirme ve floresans ömrü dağıtımı için tüm görüntüleri eşlik etmelidir.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Floresans bozunumu için ölçülenMetanol / gliserol karışımlarında viskozite arttırıcı olarak floresan moleküler rotor Şekil 'de gösterilmiştir. 2. Floresans bozunur monoexponential, ve floresans ömrü viskozitesi bir fonksiyonu olarak belirgin bir şekilde değişir. Bu metanol içinde yaklaşık 300 ps (viskozite 0.6 cP) den% 95 gliserol (viskozite 950 cP) 3.4 ns artırır.
BODIPY-C için Şekil 2. Floresans çürümesi profilleri değişen viskozite metanol / gliserol karışımları 12. 6
Floresans ömür boyu logaritmik kalibrasyon arsa τ karşı floresan moleküler rotor için viskozitesi η Şek. 3. Förster Hoffman denklemi 9 talep olarak düz bir çizgi
k 0 radiativ olduğue sabit bir oranda ve z, x 0 <x <1 ile, sabittir. Iki verimleri hem Serinin
x yerde doğrunun degrade olduğunu.
Şekil 3. Förster-Hoffmann denklemine uygun BODIPY-C 12 verim düz bir hat için günlük floresans ömrü vs günlük viskoziteli bir arsa. 6
Floresan moleküler rotor ile yaşayan hücrelerin inkübasyonu takiben bir punktat boya dağıtım floresans görüntüleri görülmektedir. Bir meso-sübstitüe BODIPY boya ile inkübe HeLa hücrelerinin Flim görüntü şekil gösterilmektedir. 4. Görüntünün her piksel floresans çürükleri yeterli tek bir üstel bozulma modeli kullanılarak monte edilebilir.
Şekil 4. (A) floresans yoğunluğunu ve BODIPY-C 12 ile boyanmış HeLa hücreleri (b) flim görüntüler. Parlak, noktasal bölgelerde diğer bölgelere göre daha kısa bir ömür boyu sergiler. Bu, daha kısa liftime Förster-Hoffmann denkleme göre, punktumlarda daha düşük bir viskoziteye, muhtemelen lipid damlacıkları karşılık gelir.
Her bir piksel ile ekstre ömürleri çizdirme ederek, Şek tüm görüntünün bir floresans ömrü çubuk elde edilir. 5.
Şekil 5. Meso-sübstitüe BODIPY moleküler rotorlar ile boyanmış HeLa hücrelerinin flim görüntüleri floresans yaşamların Histogramlar.
Discussion
Flim yoğunluğu tabanlı floresan görüntüleme üzerinden bazı önemli avantajlar sunuyor. Bu fluorofor konsantrasyon etkileri onları ayırabilirsiniz, çünkü floresan görüntüleme ile gözlemlemek zor veya imkansızdır fotofiziksel olayları rapor edebilirsiniz. Bu görüntüleme flüoresan moleküler rotorlar tarafından intraselüler viskozitesi haritalanması için özellikle yararlıdır. Şek floresans boyunca kolaylıkla, bir kalibrasyon grafiği kullanılarak bir viskoziteye dönüştürülebilir. 3, floresan moleküler rotorların konsantrasyonu bağımsızdır.
Flim verileri yorumlamayı güçleştirebilir eserler olabilir. 10 Enstrümantal eserler floresans çürüme başlangıcı üstüne bir zirve olarak görünecek ve kısa bir yıkım zamanı ile karışabilir saçılan ışık, ya sonra küçük bir tepe vardır IRF hangi mikroskop içindeki yansımaları neden olabilir. Bu dağınık ışık eserler gibi tespit edilebilironlar spektral ayrımcılık ile ayırt edilebilir çünkü - onlar heyecan verici ışık ile aynı dalga boyunda her zaman vardır. Hava, ışık 1 nanosaniye 30 cm seyahat eden Hatırlama yansımaları kökeni kesin olarak belirlemek için yardımcı olur.
Filtre veya cam floresan de özellikle düşük örnek floresans at, bir dışlayıcı neden olabilir, ancak bu kolay örnek olmadan bir ölçü alınarak tespit edilebilir: Bir çürüme, bu koşullar altında elde edilir, eğer araç nedeniyle ve hiçbir ilgisi yoktur Örnek ile! Diğer taraftan, örnek otofloresans da floresan çürümesine neden olabileceğini unutmayın.
Zaman ilişkili tek foton sayımında (TCSPC), süre-genlik çevirici (TAC) Lineer olmayan yoksul nöbete neden olabilir, ancak uyarma engelleme ve örnek üzerine iletilen ışık kaynağından örneğin ortam ışığı, parlayan tarafından tespit edilebilir ve zamanlaması ölçülmesi. Sabit bir arka olmalıdırgörüntünün her pikseline elde edilen. Sabit bir arka plan sapmalar meydana Bölgeler, iyi bir uyum verim asla ve TCSPC kartı parametrelerini ayarlayarak önlenememesi durumunda ölçüm için kaçınılmalıdır.
TCSPC biri rezil artifact çok yüksek bir foton yakalama oranı neden olan kazık-up fotondur. 11,12 Bu elektronik zamanlama meşgul olduğu için herhangi bir sonraki fotonlar yok sayarak ve ilk foton işleme, zamanlanmış olan sadece ilk foton yol açar. Floresans ömrü bir kısalma, ve bunu önlemek için en iyi yolu, Pile-up uçları lazer tekrarlama oranı yaklaşık% 1'ini de foton sayısı oranı tutmaktır.
Görünüm
Uygulamaya bağlı olarak, var flim çeşitli uygulamaları vardır ve her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. 13 ideal bir floresan mikroskop sahip olacağı tüm boyutlu floresans emissiotek foton hassasiyet, maksimum uzamsal çözünürlük ve minimum alma süresi ile tek bir ölçüm yoğunluğu, konum, kullanım ömrü, dalga boyu ve polarizasyon, n kontur. Orada özellikleri bu eşsiz kombinasyonu ile hiçbir teknoloji şu anda, ve bir inşa etmek enstrümantasyon geliştiriciler için bir sorun olmaya devam etmektedir. Hücre biyolojisinde önemli sorunlara yeni fiziksel tekniklerin uygulanması çoğu zaman beklenmeyen buluşları yolu olduğunu ve hücre biyolojisi için floresans görüntüleme doyurarak yetenekleri yakın olan önce gitmek için uzun bir yol var. Aslında, böyle ömür boyu, spektrum ve polarizasyon gibi yüksek uzaysal çözünürlükte 3D daha hızlı görüntüleme gibi görüntüleme floresan parametrelerini, hücre biyolojisinde yeni yönlerini açığa kesindir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
MKK Birleşik Krallık'ın Mühendislik ve kişisel Bursu için Fiziksel Bilimler Araştırma Konseyi (EPSRC) Yaşam Bilimleri Arayüz programı sayesinde. Ayrıca Birleşik Krallık'ın Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) tarafından finansman kabul etmek istiyorum.
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
References
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area. International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).
- Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269, 847-850 (1995).
- Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).
- Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A. Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. Demchenko, A. P. 8, Springer. Berlin Heidelberg. 267-308 (2010).
- Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4, (2010).
- Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).
- Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).
- Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes. J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).
- Förster, T., Hoffmann, G. Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme. Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).
- vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. J. Fluores. 15, 377-413 (2005).
- Becker, W. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , Springer. (2005).
- O'Connor, D. V., Phillips, D. Time-correlated single-photon counting. , Academic Press. New York. (1984).
- Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).
