חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Summary

דימות פלואורסצנטי חיים (FLIM) התפתחה הטכניקה מפתח לתמונה הסביבה ואינטראקציה של חלבונים ספציפיים צבעים בתאים חיים. FLIM של רוטורים מולקולאריים ניאון מאפשר מיפוי של צמיגות בתאים חיים.

Abstract

דיפוזיה הוא לעתים קרובות צעד חשוב בקביעת שיעור-בתגובות כימיות או תהליכים ביולוגיים משחק תפקיד במגוון רחב של אירועים תאיים. צמיגות היא אחד הפרמטרים העיקריים המשפיעים על דיפוזיה של מולקולות וחלבונים, ושינויים צמיגות נקשרו מחלות תקלה ברמה התאית. ^1-3 בעוד שיטות כדי למדוד את הצמיגות בתפזורת מפותחים היטב, microviscosity הדמיה עדיין מהווה אתגר . מפות הצמיגות של עצמים מיקרוסקופיים, כגון תאים בודדים, יש עד לאחרונה קשה להשיג. צמיגות עם טכניקות מיפוי הקרינה יש יתרון משום, בדומה שיטות אופטיות אחרות, פולשנית, בלתי הרסניות והוא יכול להיות מיושם על תאים חיים ורקמות.

רוטורים מולקולאריים פלורסנט התערוכה חיים הקרינה ותשואות הקוונטים שהם פונקציה של הצמיגות של microenvironment שלהם. פיתול Intramolecular ^4,5 אוסיבוב מוביל ריקבון לא מקרינים מאחור המדינה מתרגשת למצב בשטח. הסביבה צמיג מאט זה סיבוב או פיתול, הגבלת הגישה מסלול לא מקרינים את זה ריקבון. זה מוביל לעלייה בתשואה הקוונטים הקרינה ואת החיים פלואורסצנטי. דימות פלואורסצנטי חיים (FLIM) שונה של צבעים BODIPY הידרופובי אשר פועלים רוטורים מולקולאריים ניאון מראים כי החיים הקרינה של בדיקות אלה הוא פונקציה של microviscosity של סביבתם. ^6-8 העלילה לוגריתמי של פעם בחיים הקרינה לעומת התשואות צמיגות ממס קו ישר, כי מציית המשוואה הופמן פורסטר. ⁹ עלילה זו משמשת גם גרף כיול להמיר בחיים הקרינה לתוך צמיגות.

לאחר דגירה של תאים חיים עם רוטור שונה BODIPY ניאון מולקולרית, הפצה צבע punctate הוא ציין את התמונות פלואורסצנטי. ערך צמיגות המתקבלות הדואר puncta בתאים חיים הוא כ 100 פעמים גבוה יותר מזה של מים בציטופלסמה של התא. ^6,7 זמן נפתרה מדידות הקרינה אנאיזוטרופיה להניב פעמים מתאם הסיבוב בקנה אחד עם ערכים אלו microviscosity גדולים. מיפוי החיים הקרינה אינה תלויה בעוצמת הקרינה, ובכך מאפשר הפרדת ריכוז בדיקה ואפקטים צמיגות.

לסיכום, פיתחנו גישה מעשית צדדי למפות microviscosity בתאים מבוסס על FLIM של רוטורים מולקולאריים ניאון.

Protocol

הפרוטוקולים של הכנת המדגם FLIM אינן שונות מאלה של מיקרוסקופיה עוצמת מבוסס confocal או רחב בתחום הקרינה. רכישת נתונים מלווה המשימה העיקרית של ניתוח נתונים, כלומר חילוץ חיים הקרינה מן הנתונים הגולמיים. פעם אלה התקבלו, פרשנות נתונים מסייעת לאמת או לזייף את השערות.

1. תאים מכתים עם רוטורים מולקולאריים

1. הכן פתרון המניות (10 מ"ל) על ידי המסת כ 1 מ"ג / מ"ל של צבע בכל המתאים הממס (מתנול למשל עבור BODIPY _C-12) ^6,7 באמצעות איזון מדויק פיפטה.
2. התאים (סרטן מודל התא קו, הלה במקרה שלנו) להיות מוכתם גדלים על בצלחת עם multiwell התחתון coverslide עבור מיקרוסקופיה, באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם אווירה 5% CO ₂ עד ~ 80% confluent .
3. הוסף 10-20 μl של פתרון המניות על התאים החיים הגדלים רב welאני צלחת (SmartSlide 50 הדגירה מיקרו המערכת, WaferGen) ב 4 מ"ל של Opti-MEM בינוני (GIBCO) לכל צלחת 6 היטב היטב. זה יוצר ריכוז מיקרו טוחנת צבע היטב.
4. להחזיר את צלחת רב היטב באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם אווירה 5% CO ₂ עבור 10-45 דקות על מכתים.
5. הסר את הצלחת multiwell מן החממה ולשטוף את התאים 3-4 פעמים עם 4 ברור אופטית בינוני מ"ל תרבית תאים (למשל Opti-MEM) להסיר צבע עודף.
6. להעביר את הצלחת multiwell לשלב את המיקרוסקופ ולהתחבר בקר טמפרטורה / 5% ₂ CO כניסת הגז כנדרש, לקראת ההדמיה.

2. FLIM של הרוטורים ניאון מולקולריים בתאים

1. מניחים את המדגם על הבמה מיקרוסקופ ולקבל שידור ותמונה הקרינה לזהות תאים ניאון. תרשים סכמטי של הניסוי הגדרת מוצג איור. 1.Verify שמפיץ הקרינה במיקומים expected (למשל קרום התא, בציטופלסמה). להשיג ספקטרום פליטת הקרינה, ולוודא כי הוא זה של צבע או חלבון צפוי, במקרה זה את הספקטרום של הרוטור מולקולרית. כביקורת שלילית, התמונה המדגם הלא מוכתם ולוודא שזה לא לזרוח. למרות שלב זה אינו חיוני במיוחד עבור FLIM, זהו תרגול טוב בכלל עוזר כדי לוודא כי המדגם הוא מה שאתה חושב שזה.
2. עבור למצב FLIM - זה נעשה בקלות על ידי הזזת המראה מתוך נתיב קרן הקרינה זיהוי ("גלאי חיצוני" כפתור "נתיב קרן ההגדרה" פאנל על התוכנה TCS Leica SP2 רכישת השליטה). המסנן המתאים פליטת הקרינה כדי לחסום את כל האור מרגש להגיע הגלאי חייב להיות beampath גילוי הקרינה.

באיור 1. הסדר ניסיוני עבור FLIM תחום בזמן באמצעות ACלייזר onfocal סריקת מיקרוסקופ.

3. סרוק את המדגם ולבדוק, במחשב השליטה על רכישת FLIM, כי ספירת גלאי קצב (פס שחור שכותרתו CFD על תוכנת רכישת השליטה בקר & Hickl SPC 830 עמוד) הוא לא יותר מ 1% של שיעור החזרה לייזר ( בר ירוק שכותרתו השליטה SYNC תוכנה הרכישה). אם כן, להפחית את עוצמת הלייזר עירור, למשל על ידי הצבת מסנן צפיפות ניטרלי בנתיב קרן הלייזר, כדי למנוע איסוף ערימת-up עקומות דעיכה מעוותות פלואורסצנטי.
4. לרכישת התמונה FLIM, בדרך כלל 3-5 דקות, להפסיק סריקה ולשמור את הנתונים הגולמיים (נתונים 3D "הקוביה" המורכב מרחבית הקואורדינטות x ו-y, וזמן).
5. פתח את הנתונים הגולמיים של חבילת ריקבון הקרינה ניתוח התוכנה, למשל Tri-2 ¹⁴ או תוכנה מסחרית, כדי להציג את התמונה עוצמת הקרינה. זה פשוט ריקבון הקרינה משולב, כלומר את השטח מתחת לעקומה ריקבון הקרינה, בכל אחדפיקסל.
6. בחר פיקסל טיפוסי על ידי הצבת הסמן על זה, ובחן את הדעיכה של הקרינה פיקסל זה. אם ספירת השיא הוא מתחת 100, השתמש binning המרחבי של פיקסלים. ספירת הפיקסלים הסמוכים (3x3 או 5x5 למשל) יתווספו אל פיקסל המרכזי, כך מספר שיא גבוה יותר מתקבל שם. זה מספק דיוק סטטיסטי גבוה יותר עבור לשלב הבא. לחלופין, מדידת יכול לחזור לזמן הרכישה יותר (שלב 5). במשך 30 50 דקות, מספר שיא של כ 10 פעמים גבוה יותר (וספירת הכולל של הפורום) מתקבל, אבל זה הרבה יותר מדי זמן בזמן הרכישה עבור דגימות ביולוגיות רוב בגלל הסיכון של החדרת חפצים בשל התנועה המדגם, להיסחף מיקרוסקופ, phototoxicity ו photobleaching.
7. בחר פיקסל העולמי ערך הסף (שמעליו ריקבון ב פיקסל מותאם) ולהחיל התאמה אחת דעיכה מעריכית לתמונה. התוצאה מניב לכל החיים הקרינה עבור כל פיקסל מעל הסף, אשר מקודד אזצבע. כל פיקסל הוא בצבע עם תוצאה של התאמה, ומפה FLIM מתקבל. בדוק את מופחת צ'י בריבוע ערכי פיקסלים שונים - סביב 1 (ועד 1.3) מצביע על התאמה טובה. בדוק את השאריות המתאימים, אשר יש שחולקו באופן אקראי סביב אפס.
8. ההיסטוגרמה הקרינה לכל החיים חלקות באיזו תדירות הקרינה חיים מסוימים המתרחשים בחיים לעומת הקרינה עצמה. התאם את טווח הצבעים כך הפצה החיים הקרינה נכנס לתוך טווח הצבעים.
9. אם לא מתאים monoexponential להניב ערך צ'י בריבוע של כ 1 (ועד 1.3), ויש סטייה שיטתית של שאריות את מאפס, מודל מתוחכם יותר נדרש. לדוגמה, נסה להתאים מודל מעריכי כפולה על דועך הקרינה, כדי להסביר את שתי סביבות שונות לחקור את עשויה להיות בו מתאים גם להניב מראש מעריכי לגורמים או משרעות אשר נותן אינדיקציה לכמות היחסית של צבע אחד מסבment זה או אחר. לחלופין, פונקציה מעריכית מתוח יכול להיות מתאים לחשבון להפצה של חיים פלואורסצנטי.
10. התוצאות עבור חיים הקרינה, מראש מעריכי גורמים, והיחס לכל החיים ויחס מראש מעריכי גורם עבור כל פיקסל אז יכול להיות מקודד בצבע. כל פיקסל הוא בצבע בהתאם לערך שלה, לעומת זאת בגלל הקרינה, חיים מראש מעריכי גורמים יחסים שלהם מתקבלת. שוב, בדוק את מופחת צ'י בריבוע ערכים (אשר יכול גם להיות מקודד בצבע ומוצג כתמונה) - כ 1 (ועד 1.3) מצביע על התאמה טובה. בדוק את השאריות, אשר יש שחולקו באופן אקראי סביב אפס.
11. היסטוגרמות לכל החיים הקרינה צריך ללוות את כל התמונות להדמיה קלה של ממוצע ערכי הקרינה לכל החיים, וחלוקת החיים פלואורסצנטי.

3. נציג תוצאות

דועך הקרינה נמדדהרוטור מולקולרי פלואורסצנטי להגדיל את צמיגות ב מתנול / גליצרול תערובות מוצגים בתרשים. 2. את דועך הם הקרינה monoexponential, ואת החיים הקרינה משתנה במידה ניכרת כפונקציה של צמיגות. זה מגביר את מרחבי 300 PS ב מתנול (צמיגות 0.6 CP) כדי ns 3.4 ב גליצרול 95% (950 CP צמיגות).

באיור 2. דעיכה פרופילים הקרינה עבור BODIPY-C ₁₂ מתנול / גליצרול תערובות של צמיגות משתנה. ⁶

העלילה כיול לוגריתמי של פעם בחיים הקרינה τ לעומת הצמיגות η עבור רוטור מולקולרי פלואורסצנטי מוצג איור. 3. זה קו ישר כפי שנדרש על ידי המשוואה פורסטר הופמן ⁹

כאשר k הוא ₀ radiativ שיעור דואר מתמיד, ו-Z ו-X הם קבועים, עם 0 <x <1. אם ניקח את הלוגריתם על שני הצדדים תשואות

כאשר x הוא שיפוע של קו ישר.

איור 3. העלילה של צמיגות הקרינה יומן החיים לעומת יומן של BODIPY-C ₁₂ התשואות קו ישר לפי המשוואה פורסטר, הופמן ^6.

לאחר דגירה של תאים חיים עם הרוטור מולקולרי פלואורסצנטי הפצה צבע punctate הוא ציין את התמונות פלואורסצנטי. תמונות FLIM של תאים הלה מודגרות עם צבע BODIPY טווינה, להחליף מוצגים בתרשים. 4. דועך את הקרינה של כל פיקסל של התמונה יכול להיות מצויד כראוי באמצעות מודל יחיד דעיכה מעריכית.

>
איור 4. (א) עוצמת פלואורסצנציה (ב) תמונות FLIM של תאים הלה מוכתמים BODIPY-C _12. החיובי, באזורים לפסק התערוכה חיים קצר יותר מאשר באזורים אחרים. זה liftime קצר יותר מתאים צמיגות נמוכה יותר puncta, טיפות השומנים ככל הנראה, על פי המשוואה פורסטר, הופמן.

עד זומם את חיים המופקים כל פיקסל, נקבל היסטוגרמה לכל החיים הקרינה של התמונה כולה, כפי שמוצג באיור. 5.

איור 5. Histograms של חיים הקרינה מתמונות FLIM של תאים הלה מוכתמים טווינה, שייצגו רוטורים מולקולאריים BODIPY.

Discussion

FLIM מציע כמה יתרונות מרכזיים על פני הדמיה עוצמה המבוסס על הקרינה. הוא יכול לדווח על אירועים photophysical שקשה או בלתי אפשרי לשמור על ידי הדמיה עוצמת הקרינה, כי זה יכול להפריד ביניהם מתופעות ריכוז fluorophore. תכונה זו שימושית במיוחד עבור מיפוי צמיגות תאיים על ידי רוטורים הדמיה מולקולרית ניאון. החיים הקרינה יכול בקלות להפוך צמיגות באמצעות גרף הכיול, כפי שמוצג באיור. 3, ללא תלות בריכוז של רוטורים מולקולאריים ניאון.

ב FLIM ייתכנו ממצאים עלול לסבך פרשנות הנתונים. ¹⁰ פריטים אינסטרומנטלי כולל אור מפוזר אשר יופיע בתור שיא על גבי תחילת הדעיכה הקרינה ועלול לבלבל עם זמן דעיכה קצר, או שיא קטן אחרי IRF, אשר עלולה להיגרם על ידי השתקפויות בתוך המיקרוסקופ. כלים אלו אור מפוזר ניתן לזהות ככזהכי הם יכולים להבחין באפליה רפאים - הם תמיד באורך גל זהה לזה של אור מרגש. לזכור באוויר, אור נוסע 30 ס"מ ב 1 שבריר שנייה מסייע לאתר את מקורו של השתקפויות.

מסנן הקרינה או זכוכית יכול גם לגרום חפץ, בעיקר מדגם הקרינה נמוכה, אבל זה יכול בקלות להיות מזוהה על ידי לקיחת דגימה ללא מדידה: אם ריקבון מתקבל בנסיבות אלה, בשל מכשיר ואין לו מה לעשות עם מדגם! לעומת זאת, לציין כי autofluorescence מדגם עשוי גם לתרום ריקבון פלואורסצנטי.

בספירת הזמן בקורלציה פוטון יחיד (TCSPC), ממיר את זמן היציאה משרעת (TAC) שאינם linearities עלול לגרום התקפי עניים, אבל ניתן לזהות על ידי חסימת עירור ומבריק אור הסביבה, למשל ממקור האור המועבר על מדגם ומדידת העיתוי. הרקע צריך להיות קבועהושגו כל פיקסל של התמונה. באזורים בהם חריגות רקע קבוע להתרחש, לא תניב בכושר טוב, יש להימנע למדידת אם לא ניתן למנוע על ידי התאמת הפרמטרים של כרטיס TCSPC.

אחד החפץ לשמצה TCSPC הוא פוטון ערימת-up אשר נגרמת על ידי שיעור גילוי גבוה מדי פוטון. ^11,12 זה מוביל פוטון רק 1 בזמן, תוך התעלמות כל הפוטונים הבאים בגלל האלקטרוניקה הם העיתוי עסוק ועיבוד פוטון 1. עורמים מוקפצים מוביל קיצור של פעם בחיים הקרינה, והדרך הטובה ביותר למנוע זאת היא לשמור על קצב הספירה פוטון ב 1% סביב שער החזרה לייזר.

השקפה

ישנם יישומים שונים של FLIM, וכן, בהתאם ליישום, כל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות. ¹³ מיקרוסקופ פלואורסצנטי האידיאלי היה לרכוש את כל ממדי הקרינה emissioקווי המתאר של n, עמדה עוצמת הגל, חייו ואת הקיטוב במדידה אחת, עם רגישות פוטון יחיד, רזולוציה מרחבית מקסימלית בזמן רכישת מינימום. אין כיום שום טכנולוגיה עם שילוב ייחודי זה של תכונות, ולבנות 1 עדיין מהווה אתגר עבור מפתחים מכשור. יישום של טכניקות פיזיות חדשים לבעיות חשובות בביולוגיה של התא היא לעתים קרובות הדרך תגליות בלתי צפויות, ויש עוד דרך ארוכה לעבור לפני שאנחנו קרובים להרוות את היכולות של דימות פלואורסצנטי של ביולוגיה של התא. אכן, הדמיה פרמטרים הקרינה כמו בחיים, קשת ואת הקיטוב, כמו גם הדמיה מהר יותר ב-3D ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר, בטוחים כדי לחשוף היבטים חדשים בביולוגיה של התא.

Materials

Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl