Summary
Fluorescens Livstids Imaging (Flim) har vuxit fram som en viktig teknik för att avbilda omgivningen och interaktion av specifika proteiner och färgämnen i levande celler. Flim av fluorescerande molekyl rotorer tillåter avbildning av viskositet i levande celler.
Abstract
Diffusion är ofta en viktig hastighetsbestämmande steget i kemiska reaktioner eller biologiska förfaranden, och spelar en roll i en mängd olika intracellulära händelser. Viskositet är en av de viktigaste parametrar som påverkar diffusion av molekyler och proteiner, och förändringar i viskositet har kopplats till sjukdom och fel på cellnivå. 1-3 Medan metoder för att mäta bulkviskositeten är väl utvecklade, förblir avbildning microviscosity en utmaning . Viskositet kartor över mikroskopiska objekt, såsom enskilda celler, har tills nyligen varit svårt att få. Mappning viskositet med fluorescenstekniker är fördelaktigt eftersom, som liknar andra optiska tekniker, är det minimalt invasiva och icke-destruktivt och kan appliceras på levande celler och vävnader.
Fluorescerande molekyl rotorer uppvisar fluorescens livslängder och kvantumutbyten, vilka är en funktion av viskositeten hos deras mikromiljö. 4,5 Intramolekylär vridning ellerrotation leder till icke-radiativt sönderfall från det exciterade tillståndet tillbaka till grundtillståndet. Ett visköst miljö saktar denna rotation eller vridning, begränsa tillgången till denna icke-strålande sönderfall väg. Detta leder till en ökning i fluorescens kvantutbyte och fluorescenslivstid. Fluorescenslivstid Imaging (Flim) av modifierade hydrofoba BODIPY färgämnen som verkar som optiska molekylära rotorer visar att fluorescensen livslängd för dessa prober är en funktion av microviscosity i deras omgivning. 6-8 En logaritmisk kurva för fluorescensen livstid jämfört lösningsmedlet viskositet utbyten en rak linje som lyder Förster Hoffman ekvationen. 9 Denna tomt fungerar också som en kalibreringskurva för att konvertera fluorescenslivstid till viskositet.
Efter inkubation av levande celler med den modifierade BODIPY fluorescerande molekyl rötor, är en punktformig fördelning färgämne observerades i de fluorescerande bilderna. Viskositeten värde som erhålls i the puncta i levande celler är ungefär 100 gånger högre än för vatten och cellulära cytoplasman. 6,7 Time-resolved fluorescensanisotropi mätningar ger roterande korrelation gånger i samförstånd med dessa stora microviscosity värden. Mapping the fluorescenslivstid är oberoende av fluorescensintensitet, och medger sålunda separation av sond koncentration och effekter viskositet.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en praktisk och mångsidig strategi för att kartlägga microviscosity i celler baserat på Flim av fluorescerande molekylära rotorer.
Protocol
Protokollen för flim provberedning skiljer sig inte från dem för konfokala eller bred-fältstyrka-baserade fluorescensmikroskopi. Den datainsamling följs av huvuduppgift dataanalys, dvs extrahera fluorescens livstid från rådata. När dessa har erhållits, hjälper tolkning av data för att verifiera eller falsifiera hypoteser.
1. Färga celler med molekylära rotorer
- Framställa en stamlösning (10 ml) genom upplösning av ca 1 mg / ml av färgämnet i ett lämpligt lösningsmedel (t.ex. metanol för BODIPY-C12) 6,7 hjälp av en noggrann balans och en pipett.
- De celler som är en modell cancercellinje, HeLa i vårt fall) för att vara färgad odlas vidare i en flerkällsplatta med en coverslide undersida för mikroskopi, i en inkubator vid 37 ° C med en 5% CO2 atmosfär tills ~ 80% sammanflytande .
- Tillsätt 10 till 20 | il av stamlösningen till levande celler som växer i en multi-svetsl-platta (SmartSlide 50 mikro-inkubation system Wafergen) i 4 ml Opti-MEM-medium (GIBCO) per brunn under en 6-brunnsplatta. Detta ger en mikro-molar färgämneskoncentration i brunnen.
- Återföra platta med flera brunnar till en inkubator vid 37 ° C med en 5% CO2 atmosfär under 10-45 minuter för färgning.
- Avlägsna flerkällsplattan från inkubatorn och tvätta cellerna 3-4 gånger med 4 ml optiskt klar cellodlingsmedium (t.ex. Opti-MEM) för att avlägsna överskott av färgämne.
- Överföra flerkällsplatta till mikroskopets objektbord och ansluter till en temperaturregulator / 5% CO2 gasinlopp så erfordras, i förberedelse för avbildning.
2. Flim av fluorescerande molekylära rotorer i celler
- Placera provet på mikroskopställningen och erhålla en transmission och fluorescens bilden för att identifiera fluorescerande celler. Ett schematiskt diagram över den experimentella uppställning visas i fig. 1.Verify att fluorescensen härrör från platser erfarencted (t.ex. cellmembranet cytoplasma). Erhålla en fluorescensemissionsspektrumet och verifierar att det är den hos färgämnet eller förväntas proteinet, i detta fall spektrumet för den molekylära rotorn. Som en negativ kontroll, bild en icke-färgade provet och kontrollera att den inte fluorescerar. Även om detta steg är inte nödvändigt speciellt för Flim, är det god praxis i allmänhet och det hjälper att kontrollera att provet är vad du tycker det är.
- Växla till Flim-läge - detta enkelt genom att flytta en spegel ur fluorescensdetektering strålbanan ("extern detektor"-knappen på "strålbanan inställningen" panel på Leica TCS SP2 förvärv styrprogram). En lämplig fluorescens-emission för att blockera eventuella exciterande ljuset från att nå detektorn måste vara i fluorescensdetektering beampath.
Figur 1. Experimental arrangemang för time-domain Flim med AConfocal laserscanningsmikroskop.
- Skanna provet och kontrollera på datorn styr Flim förvärvet att detektorn pulsfrekvensen (svart stapel märkt CFD om förvärv styrprogram för Becker & Hickl SPC 830 ombord) är inte mer än ca 1% av lasern repetitionsfrekvens ( gröna adressfältet märkt SYNC inköp av program kontroll). Om det är, att minska intensiteten laserexcitation, t.ex. genom att placera en neutral densitet filter i laserstrålen vägen, för att undvika samla pile-up förvrängda fluorescens förfall kurvor.
- Skaffa en Flim bild typiskt för 3-5 min, stoppa scanning och spara rådata (en 3D-data "kuben" som består av rumslig koordinaterna x och y, och tid).
- Öppna rådata i fluorescensen sönderfallet analysen mjukvara, t.ex. TRI-2 14 eller kommersiell programvara, för att visa fluorescensintensiteten bilden. Detta är helt enkelt den integrerade fluorescensen förfall, dvs arean under fluorescensen avklingningskurvan i varjepixel.
- Välj en typisk pixel genom att placera markören på den, och inspektera fluorescensen förfall i den pixeln. Om toppen räkningen är under 100, använd spatial binning pixlar. De fall av närliggande pixlar (t.ex. 3x3 eller 5x5) läggs till den centrala pixel, så att en högre topp räkning har framställts där. Detta ger en högre statistisk noggrannhet för nästa steg. Alternativt kan mätningen göras om en längre ackvisitionstid (steg 5). För 30-50min, är en ca 10 gånger högre topp räknare (och totalt räknas) erhållas, men det är alldeles för lång förvärv för de flesta biologiska prover på grund av risken att införa artefakter på grund av prov rörelse, mikroskop drivgarn fototoxicitet och fotoblekning.
- Välj ett globalt värde pixel tröskeln (över vilken förfallet i en pixel är monterad) och tillämpa en enda exponentiell avklingning passning till bilden. Resultatet ger en fluorescenslivstid för varje pixel över tröskelvärdet, som sedan kodas ifärg. Varje pixel är färgad med resultatet av passning, och en karta Flim erhålles. Kontrollera reducerade chi-kvadrat-värden för olika pixlar - ca 1 (och upp till 1,3) indikerar en bra passform. Kontrollera motsvarande rester, som bör slumpmässigt fördelade runt noll.
- De fluorescenslivstid histogram tomter hur ofta vissa fluorescens livstid uppstår kontra fluorescenslivstid själv. Justera färgskalan så att fluorescenslivstid fördelningen passar in i färgskalan.
- Om en monoexponentiellt passning inte ger ett chi-kvadrat värde av cirka 1 (och upp till 1,3), och det finns en systematisk avvikelse residualerna från noll, är en mer sofistikerad modell krävs. Exempelvis försök att montera en dubbel exponentiell modell med fluorescensen sönderfaller, att ta hänsyn till två olika miljöer sonden kan vara i. passning även kommer att ge de pre-exponentiella faktorer eller amplituder som ger en indikation på den relativa mängden färgämne i en milning eller andra sidan. Alternativt kan en utsträckt exponentialfunktion vara lämpligt att redovisa en fördelning av fluorescens livstid.
- Resultaten för de fluorescerande livslängd, pre-exponentiella faktorer och livslängden förhållandet och pre-exponentiella faktorn förhållandet för varje pixel kan därefter kodas i färg. Varje pixel är färgad enligt dess värde, och kontrast på grund av fluorescens livslängd, pre-exponentiella faktorer och deras förhållanden erhålls. Återigen kontrollera Reducerad Chi-kvadrat-värden (som också kan kodas i färg och visas som en bild) - omkring 1 (och upp till 1,3) indikerar en god passform. Inspektera residualerna, som ska slumpmässigt fördelade runt noll.
- Fluorescenslivstid histogram ska åtfölja alla bilder för enkel visualisering av genomsnittliga fluorescens livstid värden och fluorescensen livslängd distribution.
3. Representativa resultat
Fluorescens sönderfall mäts förden fluorescerande molekyl-rotor vid ökande viskositet i metanol / glycerol-blandningar visas i fig.. 2. De fluorescens sönderfall är monoexponentiellt, och fluorescensen livslängd varierar påtagligt som en funktion av viskositet. Det ökar från ca 300 ps i metanol (viskositet 0,6 cP) till 3,4 ns i 95% glycerol (viskositet 950 cP).
Figur 2. Fluorescens förfall profiler för BODIPY-C 12 i metanol / glycerol blandningar av varierande viskositet. 6
Den logaritmiska kalibreringskurva fluorescenslivstid τ kontra viskositet η för den fluorescerande molekyl rotorn visas i fig.. 3. Det är en rak linje som krävs av Förster Hoffman ekvationen 9
där k är 0 radiative hastighetskonstant, och z och x är konstanter, med 0 <x <1. Ta logaritmen på båda sidor ger
där x är gradienten för den raka linjen.
Figur 3. En kurva över log fluorescenslivstid mot log viskositet för BODIPY-C12 ger en rak linje i enlighet med den Förster-Hoffmann-ekvationen. 6
Efter inkubation av levande celler med fluorescerande molekyl rotorn en punktformig fördelning färgämne observeras i de fluorescerande bilderna. FLIM bilder av HeLa-celler inkuberade med en meso-substituerad BODIPY färgämne visas i fig.. 4. De fluorescerande sönderfaller i varje pixel i bilden i tillräcklig utsträckning kan monteras med en enda exponentiell avklingning modell.
Figur 4. (En) Fluorescensintensitet och (b) Bilder FLIM av HeLa-celler färgade med BODIPY-C 12. De ljusa och punktera regioner uppvisar en kortare livslängd än andra regioner. Denna kortare liftime motsvarar en lägre viskositet i puncta, troligen lipiddroppar, enligt Förster-Hoffmann-ekvationen.
Genom att avsätta livstider som extraherats från varje pixel, erhåller vi ett fluorescenslivstid histogram över hela bilden, såsom visas i fig.. 5.
Figur 5. Histogram av fluorescens livstid från Flim bilder av HeLa-celler färgade med meso-substituerade BODIPY molekylära rotorer.
Discussion
Flim erbjuder några viktiga fördelar jämfört med intensiteten-baserad fluorescens avbildning. Det kan rapportera om fotofysikaliska händelser som är svåra eller omöjliga att observera med fluorescensintensitet avbildning, eftersom det kan skilja dem från effekterna fluorofor koncentration. Detta är särskilt användbart för att kartlägga intracellulär viskositet genom avbildning fluorescerande molekylära rotorer. Fluorescensen livstid kan lätt omvandlas till en viskositet med användning av en kalibreringskurva, såsom visas i fig.. 3, oberoende av koncentrationen av fluorescerande molekylära rotorer.
I Flim kan det finnas artefakter som kan komplicera tolkning av data. 10 Instrumental artefakter inkluderar spritt ljus som kommer att dyka upp som en topp ovanpå början av fluorescensen förfall och kan förväxlas med en kort avklingningstid, eller en liten topp efter IRF som kan orsakas av reflektioner inuti mikroskopet. Dessa spridda ljus artefakter kan identifieras som sådanaeftersom de kan särskiljas med spektral diskriminering - de är alltid på samma våglängd som den spännande ljus. Kom ihåg att i luft, reser ljus 30 cm i 1 nanosekund hjälper till att lokalisera ursprunget av reflektioner.
Filter eller glas fluorescens kan också orsaka en artefakt, speciellt vid låga prov fluorescens, men detta kan lätt identifieras genom att ta en mätning utan provet: om ett sönderfall erhålls under dessa omständigheter är det på grund av instrumentet och har ingenting att göra med provet! Å andra sidan, notera att urvalet autofluorescens också kan bidra till en fluorescens förfall.
I tidskorrelerade enda fotonräkning (TCSPC), tid-till-amplitud-omvandlare (TAC) olinjäriteter kan orsaka dåliga anfall, men kan identifieras genom att blockera excitation och skinande omgivningsljus, t ex från den sända ljuskällan på provet och mätning av timing. En konstant bakgrund bör varasom erhållits i varje pixel i bilden. Regioner där avvikelser från en konstant bakgrund förekommer, kommer aldrig att ge en bra passform och bör undvikas vid mätning om de inte kan elimineras genom att justera parametrar för TCSPC kortet.
En ökänd artefakt i TCSPC är photon pile-up som orsakas av för hög foton träffsäkerhet. 11,12 Detta leder till endast den första fotonen är tidsinställda och ignorerar alla efterföljande fotoner eftersom elektroniken är upptagna timing och behandling den första fotonen. Uppstapling leder till en förkortning av fluorescenslivstid, och det bästa sättet att undvika detta är att hålla det fotonalstrande räknehastigheten med ca 1% av lasern repetitionshastighet.
Utsikterna
Det finns olika implementationer av Flim, och, beroende på tillämpningen, har varje sina fördelar och nackdelar 13. Den ideala fluorescensmikroskop skulle förvärva hela flerdimensionella fluorescensen att utsläppenn konturen av intensitet, läge, livslängd, våglängd och polarisering i en enda mätning, med enkel foton känslighet, maximal rumslig upplösning och minsta förvärvet tid. Det finns för närvarande ingen teknik med denna unika kombination av egenskaper, och att bygga en fortfarande en utmaning för instrumentering utvecklare. Tillämpningen av nya fysiska tekniker för att viktiga problem i cellbiologi är ofta vägen till oväntade upptäckter, och det är en lång väg att gå innan vi är nära mättande möjligheterna av fluorescens avbildning för cellbiologi. I själva verket, imaging fluorescens parametrar såsom livslängd, spektrum och polarisering, samt avbildning snabbare i 3D vid högre spatial upplösning, är säker på att avslöja nya aspekter i cellbiologi.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
MKK tackar den brittiska Engineering and Physical Science Research Council (EPSRC) Life Sciences Interface för en personlig Fellowship. Vi vill också tacka för finansiering av den brittiska bioteknik och Biological Sciences Research Council (BBSRC).
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors Hardware: inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors DCC 100 detector control module Software: TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl |
References
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area. International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).
- Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269, 847-850 (1995).
- Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).
- Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A. Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. Demchenko, A. P. 8, Springer. Berlin Heidelberg. 267-308 (2010).
- Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4, (2010).
- Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).
- Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).
- Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes. J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).
- Förster, T., Hoffmann, G. Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme. Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).
- vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. J. Fluores. 15, 377-413 (2005).
- Becker, W. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , Springer. (2005).
- O'Connor, D. V., Phillips, D. Time-correlated single-photon counting. , Academic Press. New York. (1984).
- Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).
