Summary
في هذا التقرير ، إلا أننا تصف البشرة ثلاثي الأبعاد إعادة بناء النموذج الذي يحاكي الجلد البشري في مجال العمارة وتكوينها. وقد تم التحقيق في فسيولوجيا الخلايا الصباغية ، تطور سرطان الجلد ومصير الخلايا الجذعية عن طريق الجلد باستخدام نموذج إعادة بناء الجلد. هذا النموذج هو مفيد أيضا كأداة لتقييم ما قبل السريرية على المخدرات.
Abstract
وقد تم القيام به في معظم الدراسات المختبرية في مجال البيولوجيا التجريبية في الجلد 2 الزراعات الأحادية الأبعاد (2D) ، في حين أن الأدلة تشير إلى أن تراكم الخلايا تتصرف بشكل مختلف عندما يتم تربيتها داخل المصفوفة خارج الخلوي 3D ، وكذلك تتفاعل مع الخلايا الأخرى (1-5) . وقد تم استخدام نماذج الماوس على نطاق واسع لدراسة التشكل الأنسجة في الجسم الحي. لكن الماوس وجلد الإنسان واختلافات كبيرة في مجال العمارة والفيزيولوجيا الخلوية ، مما يجعل من الصعب استقراء دراسات الماوس إلى البشر. لأن معظمها مترجمة الخلايا الصباغية في الجلد الماوس في بصيلات الشعر ، لديهم الخصائص البيولوجية تختلف عن تلك التي للبشر ، والذي حدد في المقام الأول الطبقة القاعدية من البشرة. التطورات الأخيرة في جلد الإنسان 3D إعادة نماذج مكن هذا المجال لتحقيق مصفوفة الخلايا والخلايا خلايا التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا. ويعيد تتكون من "الأدمة" مع الليفية مضمن في مصفوفة أنا الكولاجين ، وهو "البشرة" ، التي تتألف من الخلايا القرنية ، طبقية متمايزة والغشاء القاعدي وظيفية ، والذي يفصل بين البشرة من الأدمة. الكولاجين ويوفر السقالات وإيصال المواد الغذائية ، وإمكانية الخلية الى خلية التفاعل. نماذج دمج خلايا الجلد الصباغية 3D ألخص ملامح التوازن الطبيعي للخلايا الصباغية وتطور سرطان الجلد في جلد الإنسان. كما هو الحال في الجسم الحي ، والمترجمة الخلايا الصباغية في الجلد بناؤها في الغشاء القاعدي تتخللها الكيراتينية الطبقة القاعدية. خلايا سرطان الجلد يحمل نفس الخصائص التي تعكس مرحلة الورم الأصلي (RGP ، VGP وخلايا سرطان الجلد المنتشر) في الجسم الحي. مؤخرا ، تم التعرف على الخلايا الجذعية في الجلد والأدمة الإنسان (6). يمكن لهذه الخلايا الجذعية متعددة قوية الهجرة إلى البشرة وتفرق إلى الخلايا الصباغية.
Protocol
1. الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي :
- إعداد طبقة ديكي : مزيج من الكواشف التالية في أنبوب 50 مل على الجليد : 0.59 مل EMEM 10X ، 50 ميكرولتر L - 200MM الجلوتامين و 0.6 مل FBS ، 120 ميكرولتر بيكربونات الصوديوم 7.5 ٪ و 4.6 مل من الكولاجين البقري أولا أضف 1 مل من الخليط في كل من إدراج الصواني زراعة الأنسجة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والسماح لترسيخ هلام. وينبغي أن لون الخليط يكون من القش الأصفر إلى الوردي.
- يعرض للتريبسين الليفية الإنسان من قوارير ثقافة مع 0،25 ٪ التربسين / EDTA ، أضف تحتوي على 10 ٪ DMEM FBS تحييد. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وresuspend 0.45 × 10 6 خلايا في DMEM 1.5 مل مع FBS 10 ٪. الجلدي للخلايا الجذعية ، وجمع 6600 المجالات الجلدي (عندما تنمو الخلايا الجذعية في الجلد المتوسط الخلايا الجذعية ، فإنها لا تشكل المجالات بطريقة مشابهة لneurospheres) عن طريق التنصت على القارورة لفصل المجالات ، والطرد المركزي.
- إعداد طبقة الخليوي : مزيج التالية في أنبوب 50 مل على الجليد : 1.65 مل EMEM 10X ، 150 ميكرولتر 200 ملم الجلوتامين L - ، 1.85 مل FBS ، 350 ميكرولتر بيكربونات الصوديوم 7.5 ٪ ، و 14 مل من الكولاجين البقري الأول و 1.5 مل تعليق الليفية من الخطوة 2 (بدلا من ذلك ، استخدام مزيج من 0.45 X الليفية 6 10 6600 والمجالات الجلدي في 1.5 مل من الجلد لإعادة بناء المتوسطة أنا جلدي يعيد الخلايا الجذعية) ، ومزيج جيد. أضف 3 مل من هذا المزيج على إدراج كل طبقة المغلفة ديكي. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2 حاضنة زراعة الأنسجة. وينبغي أن لون الخليط يكون من القش الأصفر إلى الوردي. بعد هلام يتصلب ، إضافة DMEM FBS تحتوي على 10 ٪ (2 و 10 مل داخل خارج مل من إدراجه في كل بئر من صواني إعادة بناء الجلد). احتضان لمدة 4 أيام ، وتأكد من أن العقود هلام.
- نضح المتوسطة من داخل وخارج كل إدراج. إضافة غسل المتوسطة (FBS مع HBSS مدال 1 ٪) 2 مل إلى 10 مل من الداخل وإلى الخارج من أجل إدراج في مصل الدم يغسل العادية. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- إعداد إعادة بناء الجلد المتوسط :
- لطبيعية في الخلايا الجذعية الخلايا الصباغية الجلدي ويعيد : لجعل المتوسط الأساسية (500 مل) ، ومزيج من الكواشف التالية : 490 مل مصل خلية كيراتينية خالية المتوسطة ، و 1.8 مل من مستخلص الغدة النخامية الأبقار ، و 10 مل مدال مصل بقري جنيني ، 500 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل SCF ، 562.5 ميكرولتر من 4 ميكروغرام / مل و 500 bFGF ميكرولتر من 264 ميكروغرام / مل ET - 3. أنا المتوسط : أضف 10 ميكرولتر من EGF المتوسطة مل 100 ميكروغرام / مل إلى 100 الأساسية. المتوسطة الثانية : أضف 2 ميكرولتر EGF إلى متوسط 100 مل الأساسية. المتوسطة الثالثة : إضافة 720 ميكرولتر CaCl 2 من 1 م إلى متوسط 300 مليلتر الأساسية.
- للبشرة الجلد إعادة : لجعل متوسطة الأول (100ML) ، مزج الكواشف التالية : 72.5 مل من DMEM ، 24 مل من F12 (HAM) ، و2 مل L - الجلوتامين من 200 مم ، 200 هيدروكورتيزون ميكرولتر من ز 269 / مل ، 200 ميكرولتر من خائبي 500X و 200 ميكرولتر O - phosphorylethanolamine 0.05 متر ، 200 الأدينين ميكرولتر من 90 مم ، 200 البروجسترون ميكرولتر من 2 نانومتر ، 240 ميكرولتر CaCl 2 من 1 م ، و 200 ثلاثي يودوثيرونين ميكرولتر من 10 نانومتر و 100 ميكرولتر من chelexed مصل العجل الوليد (3 غرام من حل Chelex 100 في 100 مل من الدم ، وإثارة 1.5 ساعة في 4 درجات مئوية ، فلتر تعقيم). لجعل متوسط الثاني (100ML) ، مزج الكواشف التالية : 72.5 مل من DMEM ، 24 مل من F12 (HAM) ، و2 مل L - الجلوتامين من 200 مم ، 200 هيدروكورتيزون ميكرولتر من ز 269 / مل ، 200 خائبي ميكرولتر من 500X ، 200 ميكرولتر O - phosphorylethanolamine 0.05 متر ، 200 الأدينين ميكرولتر من 90 مم ، 200 البروجسترون ميكرولتر من 2 نانومتر ، 240 CaCl2 ميكرولتر من 1 م ، و 200 ثلاثي يودوثيرونين ميكرولتر من 10 نانومتر و 100 ميكرولتر مصل العجل الوليد. لجعل متوسط الثالث (300mL) ، مزج الكواشف التالية : 142.5 مل من DMEM ، 142.5 مل من F12 (HAM) ، و6 مل من الجلوتامين L - 200 مم ، 600 هيدروكورتيزون ميكرولتر من ز 269 / مل ، 600 خائبي ميكرولتر من 500X ، 600 ميكرولتر O - phosphorylethanolamine 0.05 متر ، 600 الأدينين ميكرولتر من 90 مم ، 600 البروجسترون ميكرولتر من 2 نانومتر ، 720 ميكرولتر CaCl 2 من 1 م و 600 ثلاثي يودوثيرونين ميكرولتر من 10 نانومتر و 6 مل مصل العجل الوليد.
- يعرض للتريبسين الكيراتينية البشرية من قوارير الثقافة مع 0.05 ٪ التربسين / EDTA ، مع تحييد التربسين التربسين المانع فول الصويا (250 ملغم / لتر في 1X الفوسفات مخزنة المالحة) ، وتدور إلى أسفل ، resuspend بيليه في الخلية 4،17 X10 6 خلية / مل في إعادة بناء الجلد المتوسط I.
- يعرض للتريبسين الصباغية الإنسان أو خلايا سرطان الجلد من قوارير الثقافة مع 0.05 ٪ التربسين / EDTA ، مع تحييد مثبط التربسين التربسين فول الصويا ، وتدور إلى أسفل ، resuspend بيليه في الخلية 0،83 X10 6 خلية / مل في الجلد أولا إعادة بناء المتوسطة
- إزالة غسل المتوسطة من داخل وخارج كل إدراج.
- إضافة الجلد اعادة اعمار أنا متوسطة (1.5 مل إلى 10 مل من الداخل وإلى الخارج من كل إدراج).
- أخذ 600 تعليق خلية ميكرولتر من الخلايا القرنية و 600 خلية تعليق ميكرولتر من الخلايا الصباغية أو خلايا سرطان الجلد ، ومزيج جيد. الاستغناء عن 200 ميكرولتر تعليق الخلية المختلطة قطرة قطرة إلى داخل كل إدراج. لإعادة بناء الخلايا الجذعية عن طريق الجلد ، باستخدام 100 ميكرولتر من خلية كيراتينية تعليق فقط. احتضان لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية.
- نضح الجلد إعادة المتوسطة أناسواء من داخل وخارج كل إدراج. إضافة الجلد إعادة المتوسطة الثانية (2 مل إلى 10 مل من الداخل وإلى الخارج). احتضان لمدة يوم 2 إلى 37 درجة مئوية.
- إعادة بناء الجلد نضح الثاني متوسطة من داخل وخارج كل إدراج ، إضافة 7.5 مل اعادة الجلد الثالث المتوسط إلى خارج فقط. من هذه النقطة ، يبدأ سطح يعيد التعرض للهواء. التغيير الثالث المتوسط كل يوم حتى يوم 18.
- إعادة بناء الجلد الحصاد في اليوم (18) :
- نضح وسائل الإعلام من داخل وخارج إدراج.
- إزالة يدرج من درج بالملقط.
- تخلص من إعادة بناء (بما في ذلك تصفية البولي) عن طريق تتبع دائرة قريب إلى حافة بشفرة المشرط.
- خفض وإعادة تصفية في نصف على سطح صلب.
- لمقاطع البرافين : مكان نصف من إعادة بناء الأنسجة في الكاسيت بين 2 أوراق سوداء خزعة TBS وتنقع الكاسيت كله في الفورمالين 10 ٪ لأكثر من 4 ساعات. ثم ضع الكاسيت في الإيثانول 70 ٪ وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى تكون مستعدة لعملية إعادة بناء لتضمين البارافين.
- لأقسام المجمدة :
- وضع النصف الآخر من السكروز في إعادة بناء 50 ٪ في 4 ساعات لمدة 1-2 درجة مئوية ، ثم تغيير ل2M السكروز وتخزينه في درجة مئوية لمدة 4 ساعات 1-2.
- درجة الحرارة المثلى الاستغناء تجميد قطع وسائل الاعلام (أكتوبر) في قالب قاعدة المتاح بحيث يملأ حوالي 50 ٪ من القارب. تجنب أي فقاعات في أكتوبر
- الاستيلاء على حافة اعادة مع ملقط وإزالة إعادة بناء من السكروز. وضعه على Kimwipes حتى Kimwipes امتصاص السكروز.
- نقل إعادة بناء في قالب قاعدة على أعلى من أكتوبر ، وذلك باستخدام ملقط وملعقة ملف. يغطي الجزء العلوي من إعادة بناء مع أكثر أكتوبر حتى العفن قاعدة ممتلئ تماما. تأكد من أنك لا تملك أي فقاعات في أكتوبر وهو ما سيجعل من الصعب القطع.
- مكان القالب بالتساوي على قاعدة سحق الثلج الجاف ، والسماح للأكتوبر بتجميد كامل.
- التفاف العفن القاعدة في احباط القصدير وتخزينه في -70 درجة مئوية حتى تكون على استعداد لقطع عليه مع ناظم البرد.
- الكسب غير المشروع على إعادة بناء الجلد ماوس :
- يعد أنبوب 50 مل الصقر مع 5 مل من DMEM (لتجميد وإزالة الجليد الجلد الماوس).
- استخدام الماوس SCID أصلع الإناث outbred نحو 6 أسابيع.
- الفأر هو تخدير مع isoflurane (نظام التخدير EZ) : يتم تنفيذ الأولي التخدير في غرفة مع تحريض التخدير isoflurane 4 ٪ (قبل أن يتم نقله إلى السرير الماوس الجراحية) والمحافظة على طريق التنفس أثناء إجراء الرؤوس (isoflurane : 1،5-2 ٪ ). الحرارة عن طريق دعم وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم والعقيمة تشحيم البصريات التطبيقية لمنع إصابة العين أثناء التخدير.
- وضع 600 مل من الماء في كوب ويترك على رأس لوحة الساخنة للحفاظ على درجة حرارة الماء بين 40-60 درجة مئوية.
- تنظيف البشرة الفأر مع صبغة الجاوي المركبة والإعدادية مسحات الكحول.
- علامة خط على اعلى ظهره الماوس للحفاظ على نفس الموقف في وقت لاحق للخياطة.
- قطع مستديرة حول سرير الجرح 1.2 سم وقطرها على ظهر الماوس العلوي باستخدام مقص وملقط ايريس. غطاء السرير مع الجرح الإسفنج شاش معقم. وضع الجلد الماوس جولة في 5 مل من DMEM ، ثم ترك في وعاء النيتروجين السائل حتى تجمد تماما. تذويب الأنبوب من الماء الساخن على رأس لوحة الساخن حتى تحسنت تماما. كرر 3 مرات.
- فصل الجلد من إعادة استخدام شفرة transwell الجراحية وإزالة الغشاء بعناية بالغة ، ونقل الجلد اعادة اعمار (الجانب البشرة متابعة) على رأس السرير الجرح.
- الجلد مكان الماوس (الجانب البشرة متابعة) على أعلى من الجلد إعادة بناء.
- جعل الخيط الأول عن علامة المسمى سابقا ، والثاني على الجزء السفلي ، ثم اثنين اخرين من الغرز على الجانبين لإصلاح الجلد الماوس.
- تنظيف البشرة الماوس بعد التطعيم. إزالة الرؤوس والحفاظ على لوحة الماوس ساخنة حتى مستيقظا والمتنقلة.
- تضع الماوس في قفص جديد.
- آخر تسكين المنطوق : Meloxicam (1 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن تحت الجلد مباشرة بعد الجراحة ، و 24 ساعة و 48 ساعة بعد الجراحة.
2. ممثل النتائج :
يعيد الجلد الطبيعي مع الخلايا الصباغية الجلدي والخلايا الجذعية
الجلد ويعيد المثقف في علبة 6 - جيدا خاصة مع إدراج. هو مثقف المقصورة الجلدي في DMEM FBS مع 10 ٪ خلال الأيام الأربعة الأولى (الشكل 1A). الجلد هو إعادة بناء المتوسطة كنت عند المصنف الكيراتينية مع الخلايا الصباغية أو خلايا سرطان الجلد (الشكل 1B). تتعرض البشرة في الهواء في يوم 9 ، وهذا يسمح للتمييز بين الخلايا القرنية (الشكل 1C). في يوم 18 ، ويعيد بناء البشرة من الجلد وتتكون من طبقات خلية كيراتينية الطبقية. الطبقة القاعدية غير متمايزة ومتباينة الطبقات بالتسلسل موجهة عموديا (شكل 1D). وصمةجي يعيد المقطع من علامة مع S100 الصباغية يبين أن يتم محاذاة الخلايا الصباغية في الطبقة القاعدية من البشرة والتواصل مع الخلايا القرنية متعددة من خلال التمديدات تغصن (الشكل 1E). مقصورة جلدي يحتوي على الخلايا الليفية مضمن في مصفوفة من النوع الأول الكولاجين. أودعت الكولاجين الرابع يدل على الغشاء القاعدي ، الذي يفصل بين البشرة من الأدمة (الشكل 1F). عندما يتم تضمين الخلايا الجذعية عن طريق الجلد (المسمى مع GFP lentiviral ناقلات) مع الليفية في الكولاجين أنا المصفوفة ، تهاجر إلى البشرة وتفرق في الخلايا الصباغية (1) ، (الشكل 2). وضعت عدة طبقات من الخلايا القرنية في البشرة.
الجلد القتامي يعيد للأورام
دراسات تشير إلى أن المدارسة السريرية الميلانينية التقدم بطريقة متدرجة : وحمات المشتركة المكتسبة ، وحمات خلل التنسج ، RGP (شعاعي مرحلة النمو) الميلانينية ، VGP (مرحلة النمو الرأسي) الميلانينية والنقيلي الميلانومات (7). مراحل مختلفة من خطوط الخلايا القتامي تشبه شكليا لبعضها البعض في 2 مد الثقافة (الشكل 3A - D) ولكن عندما يتم إدراجها في الجلد يعيد ، وسلوك الخلايا يعكس الخصائص في الجسم الحي. تخضع لرقابة مشددة من الموقع ومعدل نمو الخلايا الصباغية في الجلد الطبيعي يعيد (الشكل 3E). RGP الأولية الميلانينية WM35 تنتشر في الغالب في البشرة (الشكل 3F) ، في حين تنمو VGP الميلانينية WM793 جراحية في الأدمة (الشكل 3G). النقيلي الميلانينية 1205Lu غزو بقوة في عمق الأدمة (الشكل 3H).
الشكل 1. يعيد الجلد مع الخلايا الصباغية الطبيعية. مظهر الجسيمة ليعيد الجلد هو مبين في ميلان. تزرع الخلايا الليفية ألف مختلطة مع الكولاجين في DMEM تحتوي على 10 ٪ وشكل FBS مقصورة الجلدية. هي المصنفة الكيراتينية وباء الخلايا الصباغية في أعلى الأدمة في الجلد وتنمو إعادة المتوسط. تتعرض البشرة وجيم في الهواء في يوم 9. D. H & E - الجلد الملون إعادة يعرض البشرة تتكون عموديا ، الطبقة القاعدية المنحى ، وطبقات متمايزة بالتسلسل الخلية الطبقية. تحتوي الأدمة الليفية مضمن في مصفوفة من النوع الأول الكولاجين. يتم محاذاة E. S100 إيجابية الخلايا الصباغية (الأسهم السوداء) على الغشاء القاعدي والتواصل مع الخلايا القرنية متعددة. F. الكولاجين IV - تلطيخ يدل على الغشاء القاعدي ، الذي يفصل بين البشرة من الأدمة. أجريت في كل stainings مدافع ثابت عن الفورمالين المقاطع جزءا لا يتجزأ من البارافين.
الشكل 2. الخلايا الجذعية في الجلد الجلد يعيد الهجرة إلى تفرق في البشرة والخلايا الصباغية. وفي يوم 5 بعد الكيراتينية البذر ، وخلايا GFP ايجابي واحد (الأخضر) يبدأ ترحيل الخروج من المجالات. وتتألف تزال البشرة من طبقة واحدة. في يوم 8 من بضع خلايا في الوصول إلى واجهة البشرة ، الأدمة. بعد يوم 10 ، يتم محاذاة بإحكام GFP إيجابية الخلايا في الطابق السفلي موقف الغشاء. وGFP إيجابية ترحيل الخلايا في البشرة علامة الصباغية أعرب HMB45 (أحمر ، كما يتبين من السهام البيضاء). هي ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). يتم تطوير البشرة وطبقات متعددة. يشار إلى الغشاء القاعدي مع خطوط بيضاء منقطة.
الشكل 3. يعيد الجلد من مراحل مختلفة من الميلانومات : م. الخلايا الصباغية الطبيعية وخلايا سرطان الجلد المزروع في الثقافات 2D. الخلايا الصباغية من ألف القلفة. باء RGP WM35 الخلايا. جيم VGP WM793 الخلايا. دال خلايا سرطان الجلد 1205Lu الإنتقالية. تقع الخلايا الصباغية E. عادي في الغشاء القاعدي. F. RGP القتامي WM35 الخلايا تنمو كتل الخلايا في البشرة. G. VGP خلايا سرطان الجلد WM793 غزو في الأدمة من خلال الغشاء القاعدي. H. النقيلي خلايا سرطان الجلد 1205Lu غزو بقوة في عمق الأدمة.
المشاكل
| مشكلة | المشاكل |
| مزيج الكولاجين لا يصلب | لون مزيج الكولاجين وينبغي القش الأصفر إلى الوردي ، ودرجة الحموضة وإلا خاطئ والكولاجين قد لا هلام. إذا كان لون أصفر مشرق ، يجب إضافة مزيد من بيكربونات الصوديوم قطرة قطرة. |
| الكولاجين يترسب قبل الأوان في mixuture | إبقاء جميع المكونات على الجليد حتى يوضع الخليط على إدراج مادة الكولاجين |
| الكولاجين هو التعاقد ولا حتى (واحد هو الجانب سمكا من الجانب الآخر) | معايرة الجرف من الحاضنة |
| يتم تشكيل البشرة مع أقل من ثلاث طبقات خلية كيراتينية. | استخدام الخلايا القرنية غير متمايزة في الممرات السفلى |
Discussion
وقد وصفت لنا توليد 3D يعيد الجلد الصباغية مع الإنسان العادي ، والخلايا الجذعية خلايا الجلد وسرطان الجلد. عندما نمت في الثقافة أحادي الطبقة ، والخلايا الصباغية تقديم التشكل مماثلة (سويت بالارض والمغزل أو أكثر على شكل شجيري) بغض النظر عن أصلهم من المرحلة السريرية. في المقابل ، يعيد الجلد 3D ألخص مرحلة معينة من خصائص خلايا سرطان الجلد. الصباغية الإنسان العادي يقيم في الطابق السفلي الأغشية بين البشرة وطبقات الجلد والخلايا واحدة. خلايا سرطان الجلد RGP الابتدائية تنمو في شكل مجموعات صغيرة على طول الغشاء القاعدي في حين أن خلايا سرطان الجلد أكثر عدوانية VGP تنمو كتل كبيرة اختراق الغشاء القاعدي في الأدمة. تنمو خلايا سرطان الجلد المنتشر في كل الاتجاهات وغزو عميقا في الأدمة كخلايا مفردة أو مجموعات. يمكن إجراء التحليلات الكمية على هذا النموذج من خلال قياس عمق غزو ومدى الانتشار. بالإضافة إلى توصيف الخلايا الصباغية العادية والخبيثة ، وذلك باستخدام نموذج يمكن أن تحفز مباشرة تمايز الخلايا الجذعية إلى الخلايا الصباغية الجلدي نضجت ، والتي تضم الطبقة القاعدية من البشرة وإقامة الاتصالات مع حسن النية من خلال القرنية upregulation من E - كادهيرين ( 6).
باستخدام ناقلات فيروسية ، ونحن قادرون على تفعيل أو تعطيل وظيفة الجين لفهم أفضل للديناميات وأهميتها الوظيفية من الجينات التي أعرب عنها كل نوع من الخلايا في الجلد يعيد ، والتي تبشر بأن تكون نموذجا فعالا لدراسة آليات التحول ليس فقط من الخلايا الصباغية ، ولكن أيضا تطور سرطان الجلد (8). أصبح على المدى الطويل مراقبة الظواهر الخلية ممكن من خلال ترقيع الجلد يعيد العوز المناعي للحيوانات. مثل هذا الإنسان جلد الفأر الوهم هو أداة ممتازة لدراسة البحوث melanomagenesis والانبثاث سرطان الجلد.
يعيد الجلد يمكن أيضا أن تكون منبرا مفيدا لتقييم المخدرات. العديد من الأدوية التي قضاء على الخلايا السرطانية في ظروف ثقافة 2D غالبا ما يكون تأثير يذكر في مجال التطبيقات التجريبية والسريرية. كما رأينا في الورم في الجسم الحي ، وخلايا سرطان الجلد في الثقافات 3D غالبا ما تكون مقاومة للعقاقير التي الخلايا في الاستجابة للثقافات 2D ، مما يوحي بأن المكروية ينظم مسارات إشارات في سرطان الجلد. لاكتشاف المخدرات ناجحة ، والجلد 3D إعادة بناء النموذج هو أداة مثالية قبل السريرية على التنبؤ بآثار المركبات في فيفو (9،10).
باختصار ، إعادة بناء نماذج الجلد جسر الفجوة بين في التجارب المختبرية والدراسات المجراة. سوف يؤدي إلى فهم أفضل لجينات التي تشارك في عملية التحول ، وكيف الخلايا الجذعية تسهم في هذا التحول.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الحيوان معهد ويستار مرفق ، ومرفق المجهري ، ومرفق Histotechnology ومركز الأبحاث التموين. وقد تم تمويل هذه الدراسة في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة CA 076674 ، CA 098101 ، 025874 و CA CA 10815.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | BioWhittaker | 12-684F | |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH-30071.02 | |
| Bovine Tendon Acid-Extracted Collagen | Organogenesis | 200/50 | |
| Tissue Culture 6-well Trays with Inserts | Organogenesis | 9285 | |
| Keratinocyte Serum Free Medium | GIBCO, by Life Technologies | 17005042 | |
| Dialyzed Fetal Calf Serum | Hyclone | SH-30079.03 | |
| recombinant Human Stem Cell Factor | Fitzgerald Industries | RDI-307-255X | |
| Basic FGF | Fitzgerald Industries | 30R-AF015 | |
| Endothelin-3, human | American Peptide | 88-5-10 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-7902 | |
| DMEM | JRH biosciences | 56430-10L | |
| F12 (HAM’s) | GIBCO, by Life Technologies | 11765-54 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | |
| Insulin, Transferrin, Ethanolamine, Selenium (ITES) | BioWhittaker | 17839Z | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Newborn calf serum | Hyclone | SH3011802 | |
| 10% buffer formalin | Surgipath | 00600 | |
| Optimal cutting temperature freezing media (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Multi cassettes | Surgipath | 02293-BX | |
| TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 15-182-501C | |
| Compound benzoin tincture | Professional Disposables, Inc, | S42450 | |
| Alcohol Prep Swabs | CVS pharmacy | ||
| Silk Black Braided 5-0 | Ethicon Inc. | 682G | |
| Gauze sponges (sterile) | CVS pharmacy | ||
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS5070 | |
| Iris scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS5913 | |
| Surgical blades | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976 | |
| EZ anesthesia | Euthanex Corp. | ||
| SCID hairless outbred mouse | Charles River Laboratories |
References
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).
- Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers. Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).
- Kremer, M., Lang, E., Berger, A. Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system. Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).
- Escámez, M. J., Garcí, M., Larcher, F., Meana, A., Muñoz, E., Jorcano, J. L., Del Río, M. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).
- Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF. Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).
- Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes. Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).
- Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).
- Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).
