Summary
In questo rapporto, descriviamo tridimensionale pelle ricostruire modello che imita la pelle umana in architettura e composizione. Fisiologia melanociti, la progressione del melanoma e il destino delle cellule staminali cutanee sono state studiate utilizzando il modello di ricostruire la pelle. Il modello è anche utile come strumento di pre-clinici per la valutazione dei farmaci.
Abstract
La maggior parte degli studi in vitro in biologia sperimentale della pelle sono state fatte in monocolture 2-dimensionali (2D), mentre accumulando evidenze suggeriscono che le cellule si comportano diversamente quando sono cresciuti in un 3D di matrice extra-cellulare e anche di interagire con altre cellule (1-5) . Modelli di topo sono stati ampiamente utilizzati per studiare la morfogenesi dei tessuti in vivo. Tuttavia il mouse e la pelle umana sono differenze significative nel campo dell'architettura e fisiologia cellulare, che rende difficile estrapolare studi sui topi per l'uomo. Dal melanociti della pelle del mouse sono per lo più localizzati nei follicoli piliferi, hanno spiccate proprietà biologiche da quelle degli esseri umani, che individuare principalmente lo strato basale dell'epidermide. Il recente sviluppo del 3D pelle umana ricostruire modelli ha permesso di indagare il campo cellula-matrice e cellula-cellula interazioni tra diversi tipi di cellule. La ricostruisce costituito da un "derma" con fibroblasti incorporati in una matrice di collagene I, un '"epidermide", che comprende stratificata, cheratinociti differenziati e una membrana basale funzionale, che separa l'epidermide dal derma. Il collagene fornisce ponteggi, la consegna dei nutrienti, e il potenziale di cellula-cellula interazione. I modelli 3D che incorpora le cellule della pelle melanocitici ricapitolare le caratteristiche naturali di omeostasi melanociti e la progressione del melanoma in pelle umana. Come in vivo, nei melanociti della pelle ricostruita sono localizzate a livello della membrana seminterrato intervallati da cheratinociti strato basale. Cellule di melanoma presentano le stesse caratteristiche che riflettono la fase iniziale del tumore (RGP, VGP e cellule di melanoma metastatico) in vivo. Recentemente, le cellule staminali cutanee sono state identificate nel derma umano (6). Questi multi-potenti cellule staminali possono migrare verso l'epidermide e si differenziano per melanociti.
Protocol
1. Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello:
- Preparazione dello strato acellulare: Mescolare i seguenti reagenti in una provetta da 50 ml su ghiaccio: 0,59 ml Emem 10X, 50 microlitri 200mm L-glutammina, 0,6 mL FBS, 120 microlitri di bicarbonato di sodio 7,5% e 4,6 ml di collagene bovino I. Aggiungere 1 ml di il composto in ogni inserto di piastre di colture di tessuto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e permettere al gel di solidificarsi. Colore della miscela dovrebbe essere da giallo paglierino al rosa.
- Trypsinize fibroblasti umani da fiaschi cultura con 0,25% tripsina / EDTA, aggiungere DMEM contenente 10% FBS per neutralizzare. Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere 0,45 x 10 6 cellule in 1,5 ml con DMEM 10% FBS. Per le cellule staminali cutanee, raccogliere 6600 sfere pelle (quando le cellule staminali cutanee crescono in media di cellule staminali, formano sfere in un modo simile a neurosfere) toccando pallone per staccare le sfere, centrifugazione.
- Preparazione dello strato cellulare: Mescolare le seguenti in un tubo da 50 ml su ghiaccio: 1,65 ml Emem 10X, 150 microlitri 200 mM L-glutammina, FBS 1,85 ml, 350 microlitri di sodio bicarbonato 7,5%, 14 ml di collagene bovino e 1,5 ml di sospensione fibroblasti dal punto 2 (in alternativa, utilizzare combinazione di 0,45 x 10 6 fibroblasti e 6600 sfere cutanea in 1,5 ml di pelle ricostruire media I per le cellule staminali cutanee ricostruisce), mescolare bene. Aggiungere 3 mL di una miscela ad ogni strato acellulare rivestite inserire. Incubare per 45 minuti a 37 ° C in un 5% di CO 2 di coltura tissutale incubatore. Colore della miscela dovrebbe essere dal giallo paglierino al rosa. Dopo che il gel si solidifica, aggiungere DMEM contenente 10% FBS (2 all'interno ml e 10 ml al di fuori di inserire in ciascun pozzetto della pelle ricostruire vassoi). Incubare per 4 giorni e assicurarsi che i contratti di gel.
- Aspirare il terreno sia all'interno che all'esterno di ciascun frutto. Aggiungi lavaggio medio (HBSS con 1% FBS dializzati) 2 ml verso l'interno e 10 ml al di fuori di inserimento al fine di lavare siero normale. Incubare per 1 ora a 37 ° C.
- Preparazione della pelle ricostruire media:
- Per le normali cellule staminali melanociti dermici e ricostruisce: Per rendere terreno base (500 ml), mescolare i seguenti reagenti: 490 ml di siero dei cheratinociti privi di media, 1,8 mL di estratto di ipofisi bovina, 10 mL dializzati siero fetale bovino, 500 microlitri di 10 mg / mL SCF, 562,5 ml di 4 microgrammi / ml bFGF e 500 microlitri di 264 mg / ml ET-3. I media: aggiungere 10 ml di EGF 100 mg / ml a 100 ml di mezzo di base. Media II: Aggiungere 2 FEG microlitri a 100 ml di mezzo di base. III media: Aggiungere 720 microlitri CaCl 2 di 1 M a 300 ml di mezzo di base.
- Per la pelle melanoma ricostruire: per fare Medio I (100 ml), mescolare i seguenti reagenti: 72,5 ml di DMEM, 24 ml di F12 (HAM), 2 mL L-glutamina di 200 mm, 200 idrocortisone l di 269 g / ml, 200 ITES l di 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine di 0,05 M, 200 ml di adenina 90 mm, 200 ml di progesterone 2 nM, 240 microlitri CaCl 2 di 1 M, 200 ml di triiodotironina 10 nM e 100 ml di siero di vitello neonato chelexed (sciogliere 3 g di Chelex 100 in 100 ml di siero, mescolare 1,5 ore a 4 ° C, filtro sterilizzare). Per rendere Medio II (100 ml), mescolare i seguenti reagenti: 72,5 ml di DMEM, 24 ml di F12 (HAM), 2 mL L-glutamina di 200 mm, 200 idrocortisone l di 269 g / ml, 200 ITES l di 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine di 0,05 M, 200 ml di adenina 90 mm, 200 ml di progesterone 2 nM, 240 ml di CaCl2 1 M, 200 ml di triiodotironina 10 nM e 100 microlitri di siero di vitello neonato. Per rendere Media III (300ml), mescolare i seguenti reagenti: 142,5 ml di DMEM, 142,5 mL di F12 (HAM), 6 mL di L-glutammina di 200 mm, 600 idrocortisone l di 269 g / ml, 600 ITES ml di 500X , 600 microlitri O-phosphorylethanolamine di 0,05 M, 600 ml di adenina 90 mm, 600 ml di progesterone 2 nM, 720 microlitri CaCl 2 di 1 M, 600 ml di triiodotironina 10 nM e 6 ml di siero di vitello neonato.
- Trypsinize cheratinociti umani da fiaschi cultura con 0,05% tripsina / EDTA, neutralizzare tripsina con inibitori della tripsina di soia (250 mg / L in 1x tampone fosfato), spin down, risospendere una cella pellet a 4,17 x10 6 cellule / ml in pelle ricostruire medio I.
- Trypsinize melanociti umani o cellule di melanoma da fiaschi cultura con 0,05% tripsina / EDTA, neutralizzare con inibitori della tripsina di soia tripsina, spin down, risospendere una cella pellet a 0,83 x10 6 cellule / ml in pelle ricostruire medio I.
- Togliere dal lavaggio medio sia all'interno che all'esterno di ciascun frutto.
- Aggiungi pelle ricostruire media I (1,5 ml per l'interno e 10 ml al di fuori di ogni inserto).
- Prendete 600 microlitri della sospensione cellulare di cheratinociti e 600 ml di sospensione cellulare melanociti o cellule di melanoma, mescolare bene. Dispensare 200 ul misti sospensione cellulare goccia a goccia all'interno di ciascun frutto. Per le cellule staminali cutanee ricostruire, utilizzare 100 l di sospensione dei cheratinociti solo. Incubare per 2 giorni a 37 ° C.
- Aspirare pelle ricostruire media Isia da interno e l'esterno di ciascun frutto. Aggiungi pelle ricostruire medio II (2 ml verso l'interno e 10 ml verso l'esterno). Incubare per altri 2 giorni a 37 ° C.
- Aspirare pelle ricostruire medio II dall'interno e l'esterno di ciascun frutto, aggiungere 7,5 mL di ricostruire la pelle III media solo la parte esterna. Da questo punto, la superficie del ricostruisce comincia ad essere esposto all'aria. Cambia III media a giorni alterni fino al giorno 18.
- Vendemmia ricostruire la pelle al giorno 18:
- Aspirare i media dall'interno e l'esterno degli inserti.
- Rimuovere dal vassoio inserti con una pinza.
- Tagliare la ricostruzione (tra cui il filtro in policarbonato) tracciando un primo cerchio al bordo con una lama di bisturi.
- Tagliare la ricostruzione e il filtro a metà su una superficie dura.
- Per le sezioni paraffina: luogo della metà dei ricostruire in una cassetta istologia tra 2 nero TBS carte biopsia e godersi tutta la cassetta in formalina al 10% per più di 4 ore. Poi mettete la cassetta nel 70% di etanolo e conservarlo a 4 ° C fino a quando si è pronti a ricostruire il processo per l'incorporamento di paraffina.
- Per le sezioni congelate:
- Posizionare l'altra metà di ricostruire nel 50% di saccarosio a 4 ° C per 1-2 ore, quindi modificare il saccarosio a 2M e conservarlo a 4 ° C per altre 1-2 ore.
- Dispensare ottimale di taglio dei media della temperatura di congelamento (OCT) in uno stampo usa e getta di base in modo da riempire circa il 50% della barca. Evitare eventuali bolle in ottobre
- Afferrare il bordo della ricostruire con una pinza e rimuovere la ricostruzione dal saccarosio. Posizionarlo sul Kimwipes fino alla Kimwipes assorbire il saccarosio.
- Trasferire la ricostruzione nello stampo di base in cima alla Ottobre, con pinze e una spatola. Coprire la parte superiore del ricostruire con più fino a ottobre lo stampo di base è completamente pieno. Assicurarsi che non hanno alcun bolle in ottobre che renderà difficile il taglio.
- Mettere lo stampo in modo uniforme sulla base di ghiaccio tritato secco, e permettono di Office di congelare completamente.
- Avvolgete lo stampo di base in carta stagnola e conservarlo a -70 ° C fino al momento di tagliare con un criostato.
- Innesto di una pelle ricostruire su un mouse:
- Preparare un falco tubo da 50 ml con 5 ml di DMEM (per il congelamento e lo scongelamento del mouse pelle).
- Utilizzare una femmina SCID topo senza peli outbred circa 6 settimane.
- Il mouse è anestetizzato con isoflurano (sistema di anestesia EZ): anestesia iniziale viene effettuata nella camera di induzione con il 4% isoflurano (prima del mouse viene spostato al letto chirurgico) e mantenere l'anestesia per un attimo di respiro nosecone durante la procedura (isofluorano: 1,5-2% ). Sostegno di calore da un pad riscaldato per prevenire l'ipotermia e lubrificante oftalmica sterile applicata per evitare lesioni oculari durante l'anestesia.
- Mettere 600 ml di acqua in un bicchiere e lasciare sopra una piastra calda per mantenere la temperatura dell'acqua tra i 40 - 60 ° C.
- Pulire la pelle del mouse con tintura composta di benzoino e tamponi preparazione alcol.
- Tracciare una linea sulla parte superiore del dorso del mouse per mantenere la stessa posizione per la sutura in seguito.
- Tagliare un letto rotondo ferita circa 1,2 cm di diametro sul retro del mouse in alto con le forbici Iris e pinze. Coprire il letto della ferita con garza sterile spugne. Mettete la pelle del mouse rotondo in 5 ml di DMEM, poi lasciare in un contenitore di azoto liquido fino a quando non del tutto congelato. Sbrinare il tubo in acqua calda sopra una piastra calda fino a quando completamente scongelati. Ripetere 3 volte.
- Staccare la pelle ricostruire dal transwell con lama chirurgica e rimuovere la membrana con molta attenzione, il trasferimento di ricostruire la pelle (epidermide lato alto) in cima al letto della ferita.
- Posizionare la pelle del mouse (lato epidermide verso l'alto) sulla parte superiore della pelle ricostruire.
- Effettuare la sutura primo marcatore precedentemente etichettati, la seconda sul fondo, poi due punti di sutura più sui lati per riparare la pelle del mouse.
- Topo pelle pulita dopo l'innesto. Rimuovere dell'ogiva e tenere il mouse sul pad riscaldato fino sveglio e ambulatoriale.
- Mettere il mouse in una nuova gabbia.
- Analgesia post operatoria: Meloxicam (1 mg / kg) per via sottocutanea immediatamente dopo la chirurgia, 24 ore e 48 ore dopo l'intervento.
2. Rappresentante dei risultati:
Ricostruisce la pelle con normali melanociti e cellule staminali cutanee
La pelle ricostruisce sono coltivate in uno speciale di 6 e vassoio con inserti. Il vano dermica è colto in DMEM con 10% FBS per i primi quattro giorni (Fig. 1A). La pelle ricostruire media mi viene utilizzata quando cheratinociti sono seminati con melanociti e cellule di melanoma (Fig. 1B). L'epidermide è esposta all'aria al giorno 9 e questo permette di differenziare cheratinociti (Figura 1C). Al giorno 18, l'epidermide della pelle ricostruisce è composta da strati di cheratinociti stratificata. Lo strato basale indifferenziata e differenziata in sequenza gli strati sono orientati verticalmente (Fig. 1D). MacchiaING la sezione ricostruisce con la melanocitici marcatore S100 dimostra che i melanociti sono allineati nello strato basale dell'epidermide e comunicare con i cheratinociti multipli attraverso le estensioni dendriti (Fig. 1E). Il vano cutanea contiene fibroblasti incorporato in una matrice di collagene di tipo I. Depositata collagene IV indica la membrana basale che separa l'epidermide dal derma (Fig. 1F). Quando le cellule staminali cutanee (marcato con GFP lentivirale vettoriale) sono integrati con fibroblasti in una matrice di collagene I, che migrano verso l'epidermide e differenziarsi in melanociti (1), (Fig. 2). Più livelli di cheratinociti nell'epidermide sono sviluppate.
Ricostruisce la pelle del melanoma
Gli studi clinico-patologici indicano che il progresso melanomi in maniera graduale: comune acquisito nevi, nevi displastici, RGP (fase di crescita radiale) melanomi, VGP (fase di crescita verticale) e di melanomi metastatici melanomi (7). Diverse fasi di linee cellulari di melanoma sono morfologicamente simili tra loro in 2-D cultura (fig. 3A-D), ma quando vengono incorporati in pelle ricostruisce, il comportamento delle cellule riflette le loro caratteristiche nel vivo. La posizione e il tasso di crescita dei melanociti normali sono strettamente controllati in pelle ricostruisce (Fig. 3E). RGP primarie melanomi WM35 proliferano prevalentemente l'epidermide (Fig. 3F), mentre VGP melanomi WM793 crescere invasivo nel derma (Fig. 3G). Melanomi metastatici 1205Lu aggressivamente invadono in profondità nel derma (Fig. 3H).
Figura 1. Ricostruisce con i melanociti della pelle normale. L'aspetto macroscopico della pelle ricostruisce è mostrato in CA. I fibroblasti A. mescolato con collagene sono coltivate in DMEM contenente 10% FBS vano e la forma dermica. B. cheratinociti e melanociti sono seminati sulla parte superiore del derma e crescere in pelle ricostruire media. C. L'epidermide è esposto all'aria al giorno 9. D. H & E-pelle macchiata ricostruire presenta l'epidermide comprende in senso verticale, orientato strato basale, e sequenzialmente differenziati strati di cellule stratificate. Il derma contiene fibroblasti incorporato in una matrice di collagene di tipo I. E. S100-positivi melanociti (frecce nere) sono allineati alla membrana basale e comunicare con i cheratinociti multipli. F. collagene IV-colorazione indica la membrana basale che separa l'epidermide dal derma. Tutte le colorazioni in DF sono stati eseguiti su fissati in formalina, incluse in paraffina sezioni.
Figura 2. Le cellule staminali dermico della cute ricostruisce migrare verso l'epidermide e differenziarsi in melanociti. Al 5 ° giorno dopo la semina cheratinociti, le cellule GFP-positive singolo (verde) avviare la migrazione fuori dalle sfere. L'epidermide è ancora composto da un singolo strato. Al giorno 8, poche cellule raggiungono l'epidermide-derma interfaccia. Dal giorno 10, GFP-positive le cellule sono strettamente allineati alla posizione membrana basale. La GFP-positive cellule migrate nel marcatore epidermide esprimere melanocitici HMB45 (rosso, come indicato dalle frecce bianche). I nuclei sono colorati con DAPI (blu). L'epidermide è sviluppato come più livelli. La membrana basale è indicato con il bianco linee tratteggiate.
Figura 3. Ricostruisce la pelle di diversi stadi di melanomi: AD. Melanociti normali e cellule di melanoma cresciute in colture 2D. Melanociti A. prepuzio. B. RGP WM35 cellule. C. VGP WM793 cellule. D. 1205Lu melanoma metastatico delle cellule. E. melanociti normali si trovano a livello della membrana basale. F. RGP melanoma WM35 cellule crescono come gruppi di cellule nell'epidermide. G. VGP melanoma WM793 invadere le cellule nel derma attraverso la membrana basale. H. melanoma metastatico 1205Lu aggressivamente invadere le cellule in profondità nel derma.
Risoluzione dei problemi
| Problema | Risoluzione dei problemi |
| Miscela di collagene non solidificano | Miscela dei colori collagene dovrebbe essere giallo paglierino al rosa, altrimenti il pH è sbagliato e collagene non possono gel. Se il colore è giallo brillante, bicarbonato di sodio più deve essere aggiunto goccia a goccia. |
| Collagene precipitati prematuramente nel mixuture | Tenere tutti i componenti su ghiaccio fino a quando la miscela di collagene viene posto sul inserto |
| Collagene contratto non è nemmeno (un lato è più spesso l'altro lato) | Calibrare il ripiano di incubatore |
| L'epidermide è formata con meno di tre strati di cheratinociti. | Usa cheratinociti indifferenziato alle basse vie |
Discussion
Abbiamo descritto la generazione pelle 3D ricostruisce con melanociti umani normali, le cellule staminali e cellule di melanoma cutaneo. Quando coltivate in coltura monostrato, le cellule melanocitici presentano una morfologia simile (appiattita, mandrino o più dendritiche a forma), indipendentemente dalla loro origine di stadio clinico. Al contrario, la pelle 3D ricostruisce ricapitolare fase proprietà specifiche delle cellule del melanoma. Normali melanociti umani a risiedere nel membrane basali dell'epidermide tra il derma e gli strati di cellule singole. Cellule di melanoma RGP primarie crescere come piccoli gruppi lungo la membrana basale, mentre più aggressive le cellule di melanoma VGP crescere come grandi cluster rompere la membrana basale nel derma. Cellule di melanoma metastatico crescere in tutte le direzioni e invadono in profondità nel derma come singole cellule o gruppi. Analisi quantitative possono essere eseguite su questo modello, misurando la profondità di invasione e il grado di proliferazione. Oltre alla caratterizzazione delle cellule melanocitiche normali e maligne, utilizzando il modello possiamo direttamente indurre la differenziazione delle cellule staminali cutanee in melanociti maturata, che ospita lo strato basale dell'epidermide e di stabilire la comunicazione in buona fede con i cheratinociti attraverso sovraregolazione di E-caderina ( 6).
Utilizzando vettori virali, siamo in grado di attivare o disattivare la funzione del gene per una migliore comprensione delle dinamiche e significato funzionale di geni espressi da ciascun tipo di cellula in pelle ricostruisce, che promette di essere un modello efficiente per studiare non solo i meccanismi di trasformazione dei melanociti , ma anche la progressione del melanoma (8). Osservazione a lungo termine di fenotipi cellulari è diventato possibile attraverso l'innesto di pelle ricostruisce agli animali immunodeficienti. Tale pelle umana-topo chimera è uno strumento di ricerca di eccellenza per lo studio melanomagenesis e metastasi melanoma.
Ricostruisce la pelle può anche essere una piattaforma utile per la valutazione dei farmaci. Molti farmaci che sradicare le cellule tumorali in condizioni di coltura 2D spesso hanno scarso effetto in applicazioni sperimentali e cliniche. Come si è visto nel tumore in vivo, le cellule di melanoma nelle culture 3D sono spesso resistenti ai farmaci che le cellule nelle culture 2D rispondere, suggerendo che il microambiente modula vie di segnalazione nel melanoma. Per la scoperta di nuovi farmaci di successo, la pelle ricostruire il modello 3D è uno strumento ideale preclinici per prevedere gli effetti dei composti in vivo (9,10).
In sintesi, ricostruire la pelle modelli colmare il divario tra dati in vitro e in vivo. Essi porteranno ad una migliore comprensione di quali sono i geni coinvolti nella trasformazione e come le cellule staminali contribuiscono a tale trasformazione.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il Wistar Institute Animal Facility, strumento di Microscopia, strumento Histotechnology e Supply Research Center. Questo studio è stato finanziato in parte dalle concessioni dal National Institutes of Health CA 076674, 098101 CA, CA 025874 e CA 10815.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | BioWhittaker | 12-684F | |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH-30071.02 | |
| Bovine Tendon Acid-Extracted Collagen | Organogenesis | 200/50 | |
| Tissue Culture 6-well Trays with Inserts | Organogenesis | 9285 | |
| Keratinocyte Serum Free Medium | GIBCO, by Life Technologies | 17005042 | |
| Dialyzed Fetal Calf Serum | Hyclone | SH-30079.03 | |
| recombinant Human Stem Cell Factor | Fitzgerald Industries | RDI-307-255X | |
| Basic FGF | Fitzgerald Industries | 30R-AF015 | |
| Endothelin-3, human | American Peptide | 88-5-10 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-7902 | |
| DMEM | JRH biosciences | 56430-10L | |
| F12 (HAM’s) | GIBCO, by Life Technologies | 11765-54 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | |
| Insulin, Transferrin, Ethanolamine, Selenium (ITES) | BioWhittaker | 17839Z | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Newborn calf serum | Hyclone | SH3011802 | |
| 10% buffer formalin | Surgipath | 00600 | |
| Optimal cutting temperature freezing media (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Multi cassettes | Surgipath | 02293-BX | |
| TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 15-182-501C | |
| Compound benzoin tincture | Professional Disposables, Inc, | S42450 | |
| Alcohol Prep Swabs | CVS pharmacy | ||
| Silk Black Braided 5-0 | Ethicon Inc. | 682G | |
| Gauze sponges (sterile) | CVS pharmacy | ||
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS5070 | |
| Iris scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS5913 | |
| Surgical blades | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976 | |
| EZ anesthesia | Euthanex Corp. | ||
| SCID hairless outbred mouse | Charles River Laboratories |
References
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